1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)專心-專注-專業(yè)精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)養(yǎng)胃舒軟膠囊微生物限度檢查方法驗(yàn)證方案方案審批：文件編號(hào)STP-YZ-FF-038-00 起 草 人日期審核人質(zhì)量控制室日期質(zhì)量管理部日期批準(zhǔn)人質(zhì)量管理負(fù)責(zé)人日期XXXXX藥業(yè)有限責(zé)任公司目 錄 TOC o 1-1 h z u 1. 背景：根據(jù)中國(guó)藥典2010年版二部附錄 J 微生物限度檢查法的要求，由于某些供試品具有抗菌活性，在建立微生物檢查方法或產(chǎn)品的組分發(fā)生改變或原檢查法的檢驗(yàn)條件發(fā)生改變時(shí)，可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，必須對(duì)供試品的抑菌活性及測(cè)定方法的可靠性進(jìn)行驗(yàn)

2、證。2. 目的：為確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的微生物限度檢查，包括細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)和控制菌檢查，特制定本驗(yàn)證方案，通過比較試驗(yàn)菌的恢復(fù)生長(zhǎng)結(jié)果，來評(píng)價(jià)整個(gè)檢驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性、有效性和重現(xiàn)性，以確認(rèn)供試品在該實(shí)驗(yàn)條件下無抑菌活性或其抑菌活性可忽略不計(jì)，所采用的方法適用于該品種的微生物限度檢查。驗(yàn)證過程應(yīng)嚴(yán)格按照本方案規(guī)定的內(nèi)容進(jìn)行，若因特殊原因確需變更時(shí)，應(yīng)填寫驗(yàn)證方案修改申請(qǐng)并報(bào)驗(yàn)證領(lǐng)導(dǎo)小組批準(zhǔn)。 3. 范圍：本驗(yàn)證方案適用于養(yǎng)胃舒軟膠囊的微生物限度檢查方法的驗(yàn)證。4. 驗(yàn)證組織及職責(zé)：4.1驗(yàn)證小組組織：組長(zhǎng)：。組員： 4.2職責(zé)：4.2.1驗(yàn)證領(lǐng)導(dǎo)小組職責(zé)：負(fù)責(zé)驗(yàn)證方案的審批；負(fù)責(zé)驗(yàn)

3、證的協(xié)調(diào)工作，以保證本驗(yàn)證方案規(guī)定項(xiàng)目的順利實(shí)施；負(fù)責(zé)驗(yàn)證數(shù)據(jù)及結(jié)果的審核；負(fù)責(zé)驗(yàn)證報(bào)告的審批；負(fù)責(zé)發(fā)放驗(yàn)證合格證書。4.2.2質(zhì)量管理部職責(zé)：負(fù)責(zé)制定分析方法驗(yàn)證的標(biāo)準(zhǔn)、限度、檢查方法；負(fù)責(zé)制定分析方法的驗(yàn)證方案，并組織實(shí)施；負(fù)責(zé)儀器設(shè)備的操作；負(fù)責(zé)各項(xiàng)目的取樣和檢測(cè)；負(fù)責(zé)收集各項(xiàng)驗(yàn)證、試驗(yàn)記錄，并對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析后，起草驗(yàn)證報(bào)告，報(bào)驗(yàn)證領(lǐng)導(dǎo)小組。4.2.3設(shè)備動(dòng)力車間責(zé)：負(fù)責(zé)保證各儀器設(shè)備處于完好狀態(tài)。4.2.4質(zhì)量負(fù)責(zé)人職責(zé)負(fù)責(zé)驗(yàn)證方案/報(bào)告的批準(zhǔn)。5. 驗(yàn)證內(nèi)容：5.1 驗(yàn)證要求：5.1.1 驗(yàn)證前的準(zhǔn)備：進(jìn)行微生物限度檢查方法驗(yàn)證前，應(yīng)選用合格的培養(yǎng)基和試驗(yàn)菌種，所有的平皿、培養(yǎng)基

4、、稀釋劑和檢驗(yàn)用具都應(yīng)嚴(yán)格按照相關(guān)的程序滅菌或消毒，以確保其對(duì)試驗(yàn)結(jié)果沒有影響。試驗(yàn)菌應(yīng)包括G-和G+并不得超過五代。5.1.2 驗(yàn)證試驗(yàn)操作計(jì)劃：用3個(gè)不同批號(hào)產(chǎn)品或同一批號(hào)產(chǎn)品進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，按微生物限度檢查方法進(jìn)行操作，通過計(jì)算回收率或試驗(yàn)菌生長(zhǎng)情況來判斷微生物限度檢查方法是否對(duì)產(chǎn)品有影響。方法驗(yàn)證試驗(yàn)可與供試品的微生物限度檢查同時(shí)進(jìn)行。5.1.3 驗(yàn)證試驗(yàn)可接受標(biāo)準(zhǔn)：通過3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證時(shí)，稀釋劑對(duì)照組和試驗(yàn)組的菌數(shù)回收率均不得低于70%；控制菌檢查方法驗(yàn)證時(shí)，陽性對(duì)照組應(yīng)檢出試驗(yàn)菌，陰性對(duì)照組應(yīng)無菌生長(zhǎng)。5.2 前瞻性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估：5.2.1評(píng)估

5、方法：對(duì)檢驗(yàn)方法潛在的風(fēng)險(xiǎn)做出評(píng)估。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)的嚴(yán)重性（R）、發(fā)生的可能性(P)、各項(xiàng)指標(biāo)等級(jí)進(jìn)行打分，風(fēng)險(xiǎn)測(cè)量值為二個(gè)指標(biāo)等級(jí)分的乘積，即風(fēng)險(xiǎn)得分為RPN。5.2.2風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估評(píng)分表分?jǐn)?shù)可能性嚴(yán)重性1發(fā)生的可能性很低對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量，設(shè)備及人員安全、GMP無影響2很少發(fā)生對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量，設(shè)備及人員安全、GMP有潛在影響3偶爾發(fā)生可能對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量，設(shè)備及人員安全、GMP產(chǎn)生影響4極易發(fā)生直接或嚴(yán)重影響產(chǎn)品質(zhì)量，設(shè)備及人員安全、GMP5.2.3風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法按照以上風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估評(píng)分表對(duì)各項(xiàng)確認(rèn)逐項(xiàng)進(jìn)行打分（風(fēng)險(xiǎn)得分=嚴(yán)重性可能性），得分14分為低風(fēng)險(xiǎn)，低風(fēng)險(xiǎn)為可接受標(biāo)準(zhǔn)，68分為中風(fēng)險(xiǎn)，須加強(qiáng)管理或采取相關(guān)措施加以控

6、制，916分為高風(fēng)險(xiǎn)，須進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)控制，制定整改措施，再確認(rèn)評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)，直至風(fēng)險(xiǎn)可接受。5.2.4風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果：潛在的風(fēng)險(xiǎn)風(fēng)險(xiǎn)分析風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)嚴(yán)重性發(fā)生的可能性RPN人員培訓(xùn)、健康狀況文件指導(dǎo)性、可操作性物料或制劑自身易染菌性、均勻性、包裝質(zhì)量試驗(yàn)菌生長(zhǎng)情況、菌液濃度均勻性取樣、檢驗(yàn)操作規(guī)范性結(jié)果評(píng)估： 評(píng)估人/日期：5.3人員評(píng)估：評(píng)估參與微生物限度檢查方法的所有人員，其培訓(xùn)檢查情況是否符合2010年版GMP要求。5.3.1評(píng)估方法：查閱培訓(xùn)檔案，確認(rèn)是否對(duì)參與微生物限度檢查方法驗(yàn)證的所有人員進(jìn)行了相關(guān)培訓(xùn)及健康檢查，檢查內(nèi)容包括： 5.3.1.1 2010年版GMP及藥品管理法培訓(xùn)；5.3.1.2

7、 滅菌和消毒管理規(guī)程及實(shí)驗(yàn)室安全管理規(guī)程培訓(xùn)；5.3.1.3微生物基礎(chǔ)知識(shí)及微生物污染的防范培訓(xùn)；5.3.1.4 微生物檢查方法驗(yàn)證管理及檢查法操作規(guī)程培訓(xùn)；5.3.1.5 取樣操作規(guī)程、相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)操作規(guī)程的培訓(xùn)；5.3.1.6人員進(jìn)出實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)程培訓(xùn)、物品進(jìn)出實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)程培訓(xùn)；5.3.1.7 崗位操作規(guī)程培訓(xùn)；5.3.2合格標(biāo)準(zhǔn)：參與微生物限度檢查方法驗(yàn)證的所有人員，已經(jīng)接受了相關(guān)的知識(shí)及操作技術(shù)培訓(xùn)，并經(jīng)考核合格，持證上崗；5.3.3人員培訓(xùn)檢查報(bào)告：培訓(xùn)主要內(nèi)容（摘要）培訓(xùn)對(duì)象、培訓(xùn)情況姓 名職務(wù)/崗位培訓(xùn)情況姓 名職務(wù)/崗位培訓(xùn)情況檢查人/日期： 復(fù)核人/日期：5.4

8、檢查方法評(píng)估：5.4.1 實(shí)驗(yàn)條件評(píng)估：5.4.1.1評(píng)估方法：查閱驗(yàn)證或確認(rèn)合格證書，確認(rèn)驗(yàn)證所用設(shè)備及系統(tǒng)是否符合驗(yàn)證要求。包括：5.4.1.1.1 消毒滅菌設(shè)備驗(yàn)證合格。5.4.1.1.2 凈化檢驗(yàn)室空氣系統(tǒng)驗(yàn)證及消毒效果驗(yàn)證合格。5.4.1.1.3潔凈工作臺(tái)驗(yàn)證合格。5.4.1.1.4培養(yǎng)箱確認(rèn)合格。5.4.1.1.5 培養(yǎng)基適用性檢查合格。5.4.1.1.6試驗(yàn)菌株符合要求。5.4.1.2合格標(biāo)準(zhǔn)：用于微生物限度檢查方法驗(yàn)證的各設(shè)備或系統(tǒng)等實(shí)驗(yàn)條件均驗(yàn)證或確認(rèn)合格，并在有效期內(nèi)，所用培養(yǎng)基和試驗(yàn)菌株均符合要求。5.4.1.3設(shè)備或系統(tǒng)評(píng)估報(bào)告：設(shè)備或系統(tǒng)名稱設(shè)備編碼驗(yàn)證或確認(rèn)報(bào)告編碼

9、檢查情況SPX-80BS-型生化培養(yǎng)箱MJ-160S-型霉菌培養(yǎng)箱LDZX-50KB型立式壓力蒸汽滅菌器YJ-875SDB型凈化工作臺(tái)微生物室空氣凈化系統(tǒng)檢查人/日期復(fù)核人/日期5.4.1.4培養(yǎng)基評(píng)估報(bào)告：脫水培養(yǎng)基名稱生產(chǎn)商 培養(yǎng)基批號(hào)適用性檢查檢查情況營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL）4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基(MUG)營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基改良馬丁培養(yǎng)基檢查人/日期復(fù)核人/日期5.4.1.5試驗(yàn)菌株評(píng)估報(bào)告：試驗(yàn)菌株名稱菌株批號(hào) 傳代次數(shù)菌株生長(zhǎng)情況檢查情況大腸埃希菌CMCC(B) 44102金黃色葡萄球菌CMCC(B) 26003枯草芽孢桿菌CMCC(B) 63501白

10、色念珠菌CMCC(B) 98001黑曲霉菌CMCC(B) 98003檢查人/日期復(fù)核人/日期5.4.2 驗(yàn)證前提文件評(píng)估：5.4.2.1評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)要求：5.4.2.1.1 取樣方法已經(jīng)批準(zhǔn)，其中包括取樣操作規(guī)程和取樣地點(diǎn)。5.4.2.1.2質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及操作規(guī)程已經(jīng)批準(zhǔn)。5.4.2.1.3微生物限度檢查法操作規(guī)程已經(jīng)批準(zhǔn)。5.4.2.1.4檢定菌管理規(guī)程已經(jīng)批準(zhǔn)。5.4.2.2評(píng)估項(xiàng)目及結(jié)論評(píng)估：確認(rèn)無菌檢查方法驗(yàn)證的文件已建立，內(nèi)容全面、詳細(xì)、準(zhǔn)確，已簽發(fā)，符合驗(yàn)證要求。5.4.2.3驗(yàn)證前提文件評(píng)估報(bào)告：設(shè)備或系統(tǒng)名稱存放地點(diǎn)微生物檢查方法驗(yàn)證管理規(guī)程成品取樣管理規(guī)程養(yǎng)胃舒軟膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)養(yǎng)胃舒軟

11、膠囊檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程微生物限度檢查法檢定菌管理規(guī)程檢查人/日期復(fù)核人/日期5.5 驗(yàn)證實(shí)施：5.5.1 試驗(yàn)前的準(zhǔn)備:5.5.1.1 試驗(yàn)用具的準(zhǔn)備：將試驗(yàn)需用的試管、刻度吸管、薄膜過濾器、濾膜（孔徑0.22um、直徑50mm）、平皿、空三角瓶、稱量紙等，用牛皮紙包扎好后，放于濕熱滅菌器中，在121，滅菌30 min，在3天內(nèi)使用。5.5.1.2試驗(yàn)用培養(yǎng)基的制備：取適用性檢查合格的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL）、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基（MUG）等脫水培養(yǎng)基，按照相應(yīng)的配制說明，用純化水配制、分裝后，在2小時(shí)內(nèi)，放于濕熱滅菌

12、器中，在121，滅菌15 min，在3周內(nèi)使用。5.5.1.3試驗(yàn)用稀釋劑/緩沖液、沖洗液的制備：取在有效期內(nèi)的試劑，按照相應(yīng)的配制方法，配制pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、0.9%無菌氯化鈉溶液、0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液等，用純化水配制，加熱使溶，過濾，分裝，在121，滅菌15 min，在3周內(nèi)使用。 5.5.2 試驗(yàn)菌的制備和稀釋：5.5.2.1細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證用菌液：5.5.2.1.1取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物少許接種至10ml營(yíng)養(yǎng)肉湯中，在3035培養(yǎng)1824小時(shí)；取白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁培

13、養(yǎng)基中，在2328培養(yǎng)2448小時(shí)；取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，2328培養(yǎng)57天。5.5.2.1.2將上述大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的均勻培養(yǎng)物（菌懸液），用0.9%無菌氯化鈉溶液對(duì)倍稀釋制成每1ml含菌50100cfu的試驗(yàn)菌液。在黑曲霉的改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，加入35ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫（菌懸液），用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌50100cfu的試驗(yàn)孢子液。5.5.2.1.3上述菌液在供試驗(yàn)的同時(shí)，取1ml注皿、培養(yǎng)、計(jì)數(shù)；大腸

14、埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，于3035倒置培養(yǎng)48小時(shí)，白色念珠菌、黑曲霉用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，于2328倒置培養(yǎng)72小時(shí)。5.5.2.2控制菌檢查方法驗(yàn)證用菌液：5.5.2.2.1取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物少許接種至10ml營(yíng)養(yǎng)肉湯中，生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物少許接種至12ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，在3035培養(yǎng)1824小時(shí)。5.5.2.2.2 取上述均勻培養(yǎng)物（菌懸液），用0.9%無菌氯化鈉溶液對(duì)倍稀釋，制成每1ml含菌10100cfu的試驗(yàn)菌液。5.5.2.2.3上述菌液在供試驗(yàn)的同時(shí)，取1ml注皿、注入營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基

15、，于3035倒置培養(yǎng)48小時(shí)，計(jì)數(shù)。5.5.3供試液的制備：5.5.3.1 根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性，采取適宜的方法制備供試液。5.5.3.2，取供試品養(yǎng)胃舒軟膠囊5g，加至含溶化的（溫度不超過45）5g司盤80、3g單硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80無菌混合物的燒杯中，用無菌玻璃攪拌成團(tuán)后，慢慢加入45pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為1：20的供試液。5.5.3.3 供試液的制備如需用水浴加溫時(shí)，溫度不得超過45，時(shí)間不得超過30min。5.5.4細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證方法:5.5.4.1 驗(yàn)證試驗(yàn)分4組，照微生物限度檢查法操

16、作，分別用3個(gè)不同批號(hào)樣品進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，并分別計(jì)算供試品組和對(duì)照試驗(yàn)組的菌回收率。5.5.4.2試驗(yàn)組： 5.5.4.2.1 平皿法：分1：20的供試液1ml和試驗(yàn)菌液（含菌50100CFU）1ml，注入同一直徑90mm的滅菌平皿中，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿。5.5.4.2.2薄膜過濾法：取1：20的供試液110ml，加至100ml稀釋液中混勻，按薄膜過濾法過濾（水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤(rùn)濕濾膜，油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應(yīng)充分干燥）。用適宜的沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量約100ml，總沖洗量不得超過1000ml，在最后一次沖洗液中加入一種試驗(yàn)菌液1m

17、l（含菌50100CFU），濾過，取出濾膜，菌面朝上貼于相應(yīng)的經(jīng)預(yù)培養(yǎng)合格的培養(yǎng)基平板上，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板，白色念珠菌、黑曲霉用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平板。每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平板。5.5.4.3菌液組：取試驗(yàn)菌液各1ml，注入直徑90mm的滅菌平皿中，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿。5.5.4.4供試品對(duì)照組：5.5.4.4.1 平皿法：取1：20供試液1ml，注入直徑90mm的滅菌平皿中，每種培養(yǎng)基平行制備2個(gè)平皿。5.5.4.4.2薄膜過濾法：取1：20的供試液110ml（取用量同試驗(yàn)組），加至100ml稀釋液中混勻，按薄膜過濾法過濾（水溶性供試液過

18、濾前先將少量的沖洗液過濾以潤(rùn)濕濾膜，油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應(yīng)充分干燥）。用沖洗液沖洗濾膜，沖洗液、沖洗量及沖洗次數(shù)同試驗(yàn)組，濾過，取出濾膜，菌面朝上貼于經(jīng)預(yù)培養(yǎng)合格的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上，每種培養(yǎng)基平行制備2個(gè)平板。5.5.4.5稀釋劑對(duì)照組：若供試液制備需要分散、乳化、中和、離心等特殊處理時(shí)，需增加稀釋劑對(duì)照組，以考察供試液制備過程中微生物受影響的程度。5.5.4.5.1平皿法：分別取1ml稀釋劑或緩沖液和1ml試驗(yàn)菌液（含菌50100CFU），注入同一直徑90mm的滅菌平皿中，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿。5.5.4.5.2薄膜過濾法：每個(gè)濾桶內(nèi)加入100ml

19、稀釋液，按薄膜過濾法過濾，用沖洗液沖洗濾膜，沖洗液、沖洗量及沖洗次數(shù)同試驗(yàn)組，在最后一次沖洗液中加入一種試驗(yàn)菌液1ml（含菌50100CFU），濾過，取出濾膜，菌面朝上貼于相應(yīng)的經(jīng)預(yù)培養(yǎng)合格的培養(yǎng)基平板上，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板，白色念珠菌、黑曲霉用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平板。每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平板。5.5.4.6傾注培養(yǎng)基：在菌液組各平皿中分別傾注1520ml溫度不超過45的溶化的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，其中，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，白色念珠菌、黑曲霉用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固。5.5.4.7培養(yǎng)觀察：

20、用于細(xì)菌計(jì)數(shù)的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板，倒置于3035的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48小時(shí)；用于霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)的玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平板，倒置于2328的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)72小時(shí)。逐日觀察菌落生長(zhǎng)情況，點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。5.5.4.8菌落計(jì)數(shù)：將平板置菌落計(jì)數(shù)器上或從平板的背面直接以肉眼點(diǎn)計(jì)，以透射光襯以暗色背景，仔細(xì)觀察并記錄結(jié)果。5.5.4.9計(jì)算回收率試驗(yàn)組回收率試驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試品對(duì)照組平均菌落數(shù)100%菌液組的平均菌落數(shù)稀釋劑對(duì)照組回收率稀釋劑對(duì)照組的平均菌落數(shù)100%菌液組的平均菌落數(shù)5.5.4.10結(jié)果判定：在3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，稀釋劑對(duì)照組的回收率應(yīng)均不低于70。試驗(yàn)組的菌回收率均不低于70，則照

21、該供試液制備方法和計(jì)數(shù)法測(cè)定。若任一次試驗(yàn)中試驗(yàn)組的菌回收率低于70，則應(yīng)采用薄膜過濾法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、中和法等方法或聯(lián)合使用上述方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。5.5.4.11細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證結(jié)果：第一次：樣品名稱試驗(yàn)日期規(guī) 格樣品批號(hào)生 產(chǎn) 商類 別供試液的制備及處理 保溫振搖法 研缽法 勻漿儀 檔 min 水溶性供試品：供試品 g(ml)，加稀釋劑 ml，制成1： 供試液；取供試液 ml，沖洗次數(shù) 次，每膜沖洗量 ml。 非水溶性供試品：供試品 g(ml)，加乳化劑（名稱 ；批號(hào) ） g(ml)，加稀釋劑 ml，制成1： 供試液；取供試液 m

22、l，沖洗次數(shù) 次，每膜沖洗量 ml。 其它： 。計(jì)數(shù)方法細(xì)菌計(jì)數(shù)霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基名稱營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基配制批號(hào)培養(yǎng)溫度培養(yǎng)起止時(shí)間菌種名稱大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉菌種編號(hào)菌懸液批號(hào)菌液稀釋倍數(shù)試驗(yàn)組（cfu）12平均菌液組（cfu）12平均稀釋劑對(duì)照組（cfu）12平均供試品對(duì)照組（cfu）12平均試驗(yàn)組回收率(%)稀釋劑對(duì)照組回收率(%)結(jié) 論檢查人/日期復(fù)核人/日期第二次：樣品名稱試驗(yàn)日期規(guī) 格樣品批號(hào)生 產(chǎn) 商類 別供試液的制備及處理 保溫振搖法 研缽法 勻漿儀 檔 min 水溶性供試品：供試品 g(ml)，加稀釋劑 ml，制成1： 供試液

23、；取供試液 ml，沖洗次數(shù) 次，每膜沖洗量 ml。 非水溶性供試品：供試品 g(ml)，加乳化劑（名稱 ；批號(hào) ） g(ml)，加稀釋劑 ml，制成1： 供試液；取供試液 ml，沖洗次數(shù) 次，每膜沖洗量 ml。 其它： 。計(jì)數(shù)方法細(xì)菌計(jì)數(shù)霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基名稱營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基配制批號(hào)培養(yǎng)溫度培養(yǎng)起止時(shí)間菌種名稱大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉菌種編號(hào)菌懸液批號(hào)菌液稀釋倍數(shù)試驗(yàn)組（cfu）12平均菌液組（cfu）12平均稀釋劑對(duì)照組（cfu）12平均供試品對(duì)照組（cfu）12平均試驗(yàn)組回收率(%)稀釋劑對(duì)照組回收率(%)結(jié) 論檢查人/日期復(fù)核人/日期第三次

24、：樣品名稱試驗(yàn)日期規(guī) 格樣品批號(hào)生 產(chǎn) 商類 別供試液的制備及處理 保溫振搖法 研缽法 勻漿儀 檔 min 水溶性供試品：供試品 g(ml)，加稀釋劑 ml，制成1： 供試液；取供試液 ml，沖洗次數(shù) 次，每膜沖洗量 ml。 非水溶性供試品：供試品 g(ml)，加乳化劑（名稱 ；批號(hào) ） g(ml)，加稀釋劑 ml，制成1： 供試液；取供試液 ml，沖洗次數(shù) 次，每膜沖洗量 ml。 其它： 。計(jì)數(shù)方法細(xì)菌計(jì)數(shù)霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基名稱營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基配制批號(hào)培養(yǎng)溫度培養(yǎng)起止時(shí)間菌種名稱大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉菌種編號(hào)菌懸液批號(hào)菌液稀釋倍數(shù)試驗(yàn)組（cf

25、u）12平均菌液組（cfu）12平均稀釋劑對(duì)照組（cfu）12平均供試品對(duì)照組（cfu）12平均試驗(yàn)組回收率(%)稀釋劑對(duì)照組回收率(%)結(jié) 論檢查人/日期復(fù)核人/日期5.5.5控制菌檢查方法驗(yàn)證方法:5.5.5.1 根據(jù)各品種項(xiàng)下微生物限度標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定檢查的控制菌，選擇相應(yīng)驗(yàn)證的菌株，驗(yàn)證大腸菌群檢查法時(shí)，采用大腸埃希菌作為驗(yàn)證菌株。驗(yàn)證試驗(yàn)分3組，分別用3個(gè)不同批號(hào)樣品或同一批號(hào)樣品進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)。5.5.5.2試驗(yàn)組：5.5.5.2.1 平皿法：取1：10的供試液10ml（相當(dāng)于供試品1g、1ml、10cm2）和1ml試驗(yàn)菌液（含菌10100CFU），加入同一增菌培養(yǎng)基中，按相應(yīng)控

26、制菌的檢查方法進(jìn)行檢查。5.5.5.2.2薄膜過濾法：取1：10的供試液10ml（相當(dāng)于供試品1g、1ml、10cm2），按薄膜過濾法過濾（水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤(rùn)濕濾膜，油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應(yīng)充分干燥）。用適宜的沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量約100ml，總沖洗量不得超過1000ml，在最后一次沖洗液中加入1ml試驗(yàn)菌液（含菌10100CFU），濾過，取出濾膜，放入增菌培養(yǎng)基中，按相應(yīng)控制菌的檢查方法進(jìn)行檢查。5.5.5.3 陽性對(duì)照：取1ml試驗(yàn)菌液（含菌10100CFU），加入增菌培養(yǎng)基中，按相應(yīng)控制菌的檢查方法進(jìn)行檢查。5.5.5.4 陰性對(duì)照：取1

27、0ml稀釋劑或緩沖液替代供試液，加入增菌培養(yǎng)基中，按相應(yīng)控制菌的檢查方法進(jìn)行檢查。5.5.5.5結(jié)果判定：在3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，陽性對(duì)照組應(yīng)檢出試驗(yàn)菌，陰性菌對(duì)照組應(yīng)無菌生長(zhǎng)。若試驗(yàn)組檢出試驗(yàn)菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進(jìn)行供試品的該控制菌檢查；若試驗(yàn)組未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)采用薄膜過濾法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、中和法等方法或聯(lián)合使用上述方法消除供試品的抑菌活性，建立新的方法，并重新驗(yàn)證。5.5.5.6控制菌檢查方法驗(yàn)證結(jié)果：第一次：控制菌名稱樣品名稱試驗(yàn)日期規(guī) 格樣品批號(hào)生 產(chǎn) 商類 別供試液的制備及處理 保溫振搖法 研缽法 勻漿儀 檔 min 水溶性供試品：供試品 g(ml)，加稀釋劑 ml，制成1： 供試液；取供試液 ml，沖洗次數(shù) 次，每膜沖洗量 ml。 非水溶性供試品：供試品 g(ml)，加乳化劑（名稱 ；批號(hào) ） g(ml)，加稀釋劑 ml，制成1： 供試液；取供試液 ml，沖洗次數(shù) 次，每膜沖洗量 ml。 其它： 。培養(yǎng)基名稱培養(yǎng)溫度培養(yǎng)起止時(shí)間菌落生長(zhǎng)情況試驗(yàn)組陽性對(duì)照陰性對(duì)照結(jié) 論檢查人/日期復(fù)核人/日期第