1、中藥熏蒸對佐劑型關(guān)節(jié)炎大鼠血液、關(guān)節(jié)中白細胞介素 -1 的阻礙【摘要】 目的 觀看中藥熏蒸對佐劑性關(guān)節(jié)炎 (AA) 模型大鼠血液及關(guān)節(jié)中白細胞介素 -1 (IL-1 ) 的阻礙 , 探討中藥熏蒸療法抗炎作用機理。方式 將 50 只 Wistar 大鼠隨機分為正常組、 模型組、水熏組、中藥低熏組、中藥高熏組。除正常組外 , 其余各組于大鼠右足跖皮下注射弗氏完全佐劑 mL 造成 AA模型 , 將水熏組、中藥低熏組、中藥高熏組進行熏蒸醫(yī)治 10 d 。造模后第 21 日, 取大鼠血清及關(guān)節(jié)滑膜 , 用酶聯(lián)免疫法 (ELISA) 檢測血液中 IL-1 的含量 , 免疫組化檢測關(guān)節(jié)中 IL-1的表達水平

2、。結(jié)果 中藥熏蒸對大鼠血液中 IL-1 含量較模型組均有顯著降低 (P, 對大鼠關(guān)節(jié)中 IL-1 的強陽性表達與模型組有明顯不同 (P 。結(jié)論 中藥熏蒸能夠下調(diào) AA模型大鼠血液中異樣升高的致炎因子 IL-1 的水平 , 抑制關(guān)節(jié)滑膜中 IL-1 的表達。【關(guān)鍵詞】中藥熏蒸療法；大鼠；佐劑性關(guān)節(jié)炎；白細胞介素-1 中藥熏蒸療法操作方便 , 適用癥廣 , 療效確切 , 但在熏蒸機理的研究方面方才起步。本實驗從熏蒸對佐劑型關(guān)節(jié)炎 (AA) 大鼠血液、關(guān)節(jié)中白細胞介素 -1 (IL-1 ) 的阻礙 , 探討該療法的抗炎作用機理 , 為該療法推行應(yīng)用提供臨床和實驗依據(jù)。實驗材料.1動物 健康清潔級雄性

3、Wistar 大鼠 50 只, 體重 (140 20)g, 中國人民解放軍廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院實驗動物中心提供。試劑弗氏完全佐劑 , 美國 Sigma 公司； IL-1 的酶聯(lián)免疫 (ELISA) 檢測試劑盒 , 上海森雄科技實業(yè) , 美國 RD公司；IL-1 的免疫組化檢測試劑盒, 武漢博士德公司。熏蒸藥物羌活 20 g, 獨活 20 g, 防風 15 g, 桂枝 15 g, 細辛 10 g, 川芎 20 g, 海風藤 30 g, 徐長卿 30 g, 姜黃 20 g, 蘇木 20 g, 冰片 1 g, 中國人民解放軍廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院中藥房提供。 熏蒸方中前 10 味中藥由自動煎藥機煎煮成 %

4、濃度的中藥液保留 , 熏蒸醫(yī)治時按高、低濃度別離稀釋成 % 和%濃度的中藥液 , 冰片待熏蒸醫(yī)治前加入藥液中。儀器動物熏蒸籠；三用電子恒溫水槽 , 廣東省汕頭市醫(yī)用設(shè)備廠產(chǎn)品；低溫離心機 , 美國 Beckman 公司產(chǎn)品； LEICA-RM2245型組織切片機；Lt2-12550 酶標儀 , 澳大利亞 Biocell公司產(chǎn)品； NIKON-E600顯微鏡；生化培育箱。實驗方式佐劑性關(guān)節(jié)炎模型的成立只大鼠隨機留取 10 只作為正常組 , 其余 40 只同意弗氏完全佐劑(CFA)造模 , 即將 CFA 充分振蕩混勻后 , 在每只造模組大鼠右踝關(guān)節(jié)下cm處皮下注射 CFA mL1 。注射后 1 d

5、, 各造模組大鼠注射區(qū)局部色紅、腫脹、皮溫升高 , 活動欠靈活 , 第 3 日右足腫脹達峰值 , 并于 35 d 開始慢慢消退 , 至第 10 日, 大鼠右足再度腫脹 , 并同時顯現(xiàn)對側(cè)后肢腫脹, 呈進行性加重。多發(fā)性關(guān)節(jié)炎的顯現(xiàn)說明大鼠 AA模型成立成功。分組及處置方式造模后第 11 日,40 只模型大鼠隨機分成 4 組, 模型組、水熏組、中藥低熏組、中藥高熏組各 10 只。正常組和模型組常規(guī)喂養(yǎng) , 不做熏蒸處置；水熏組給予 (59 1) 蒸餾水熏蒸 , 蒸氣溫度為 3940 ；中藥低熏組給予相同溫度 %的中藥液熏蒸；中藥高熏組給予相同溫度 %的中藥液熏蒸。將大鼠放入動物熏蒸籠 , 開啟電

6、子恒溫水槽 , 待蒸汽溫度達到熏蒸要求時 , 開始熏蒸并計時 , 每次熏蒸 20 min, 持續(xù) 10 d 。造模后第 21 日, 予腹腔麻醉后心腔取血 , 置抗凝管內(nèi)混勻 , 后頸椎脫臼法處死。大鼠處身后 , 取右后肢踝關(guān)節(jié)及以下足爪 , 扒去皮毛 , 剔除肌肉、肌腱等附著組織 , 剪去足爪 , 留取完整踝關(guān)節(jié) , 用 10%中性甲醛固定 48 h,EDTA脫鈣 15 d, 脫水、浸蠟、包埋、切片。指標檢測大鼠血液中 IL-1 含量的檢測大鼠抗凝血行ELISA 法檢測血液中IL-1 的含量 , 測定步驟按檢測藥盒說明書嚴格執(zhí)行。大鼠關(guān)節(jié)中 IL-1 含量的檢測大鼠關(guān)節(jié)切片后脫蠟、水化； PB

7、S洗 2 次, 各 5 min ；用 PBS配置新鮮的 3%H2O2,室溫封鎖 8 min, 蒸餾水洗 3 次；抗原修復 (pH 的枸櫞酸鈉緩沖溶液在恒溫水浴加熱至 95 , 放入載玻片加熱 1520 min) ；自然冷卻后 PBS洗 5 min；滴加正常山羊血清封鎖液 , 室溫 20 min。甩去多余液體；滴加抗 ,4 保濕留宿； 37 復溫 45 min ；PBS洗 3 次。滴加生物素化抗 , 室溫 20 min；PBS洗 3 次；滴加新配試劑 SABC, 室溫 20 min；PBS洗 4 次； DAB顯色 3 min( 鏡下把握顯色程度 ) ；蒸餾水洗；脫水、透明、封片、鏡檢。每組切片隨

8、機抽取 10 張 , 并在顯微鏡下選取大鼠踝關(guān)節(jié)周圍視野 , 攝像取圖像保留 , 以關(guān)節(jié)周圍軟骨及軟骨下骨組織細胞胞漿染成黃褐色為陽性 , 依照細胞染色深淺不同 , 統(tǒng)一概念命名陰性、弱陽性、強陽性細胞, 采納 HMIAS-2000高清楚度彩色醫(yī)學圖文分析系統(tǒng)免疫組化測量程序( 武漢千屏影像技術(shù)開發(fā)) 分析圖像, 獲取各類細胞數(shù)占視野內(nèi)總細胞數(shù)的比值( 系統(tǒng)數(shù)據(jù)以小數(shù)表示 ),別離為陰性細胞百分比、弱陽性細胞百分比( 簡稱“弱陽比” ) 、強陽性細胞百分比 ( 簡稱“強陽比” ) 、陽性細胞百分比為弱陽比與強陽比之和 ( 簡稱“陽性比” ), 記錄弱陽比、強陽比、陽性比數(shù)據(jù)。統(tǒng)計學方式大鼠血液

9、中細胞因子含量檢測選正常組、模型組、水熏組、中藥高熏組、中藥低熏組進行對照分析 , 實驗所有數(shù)值均為計量資料； 免疫組化檢測選各組的陽性細胞含量比進行對照分析 , 實驗所有數(shù)值均為計數(shù)資料。采納統(tǒng)計軟件 , 運用方差分析進行多組間兩兩比較。 統(tǒng)計結(jié)果以 xs 表示 ,P 表示不同具有統(tǒng)計學意義。結(jié)果( 見表一、表 2) 表 1 中藥熏蒸對 AA大鼠血液中 IL-1 含量的阻礙( 略) 注：與正常組比較 ,*P ；與模型組比較 ,#P ；與水熏組比較 , P( 下同 ) 表 2 中藥熏蒸對 AA大鼠關(guān)節(jié)中 IL-1 含量的阻礙( 略)討論依照人體中藥熏蒸的原理, 咱們以三用電子恒溫水槽作為熏蒸藥

10、箱以保證熏蒸溫度恒定 , 另做一底面大小相當?shù)氖蠡\(47 cm27 cm7cm), 底面覆以透氣性能良好的細格鋼絲網(wǎng), 四面用不銹鋼做成 , 頂蓋用大格鋼絲網(wǎng)做成 , 熏蒸時把大鼠放入小格中 , 關(guān)緊上蓋 , 待藥液達到適合溫度時 , 置于恒溫水槽上即可開始熏蒸。 該實驗方式具有易操作、 易控溫、蒸汽量大及可重復性能好的優(yōu)勢。 本實驗結(jié)果顯示 , 各造模組的 IL-1 含量均有顯著升高 , 與正常組比較不同顯著。經(jīng)熏蒸醫(yī)治后 , 各醫(yī)治組 ( 包括水熏組、中藥低熏組、中藥高熏組 )IL-1 的含量較模型組均有顯著降低；醫(yī)治組間比較 , 中藥高熏組在指標的改善上優(yōu)于水熏組；中藥低熏組與水熏組比較

11、 , 前者略優(yōu)于后者 , 但統(tǒng)計學上未見明顯不同。緣故可能為：一是醫(yī)治時刻不夠長； 二是動物實驗不同于臨床 , 動物熏蒸的藥物最低有效濃度需進一步探討。 以上實驗結(jié)果提示 , 中藥熏蒸療法醫(yī)治關(guān)節(jié)炎的抗炎機理可能與下調(diào)血液中異樣升高的致炎因子 IL-1 水平有關(guān)。采納免疫組化觀看AA大鼠病變踝關(guān)節(jié)局部細胞因子的表達, 結(jié)果顯示各造模組的 IL-1 陽性表達明顯強于正常組； 各醫(yī)治組與模型組對照 , 中藥高熏組、中藥低熏組 IL-1 強陽比都明顯低于模型組；醫(yī)治組間比較 , 中藥高熏組、中藥低熏組對 IL-1 強陽性細胞比值的改善均優(yōu)于水熏組。以上實驗結(jié)果提示 , 中藥熏蒸對 AA大鼠關(guān)節(jié)局部炎性細胞因子表達有明顯的抑制作用 , 可能與熏蒸藥物中的中藥成份