1、美極梅奇酵母冷凍干燥復(fù)合保護(hù)劑的優(yōu)化研究冷凍干燥菌劑具有活性高、穩(wěn)定性強(qiáng)以及能有效預(yù)防變質(zhì)和污染細(xì)菌等優(yōu)點(diǎn)1-2。為提高冷凍干燥過程中細(xì)胞的存活率，通常加入保護(hù)劑以提高細(xì)胞對(duì)外界壓力的抵抗力3。海藻糖、脫脂牛奶、蔗糖、乳糖、葡聚糖、麥芽糖、甘露醇、麥芽糊精、阿拉伯膠和淀粉等糖和碳水化合物以及蛋白質(zhì)被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞的凍干過程4。但單一保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用非常有限，需要其他保護(hù)劑的協(xié)同作用來提高細(xì)胞的存活率5。因此，在細(xì)胞凍干過程中通常添加復(fù)合保護(hù)劑，以達(dá)到冷凍過程中對(duì)細(xì)胞更好的保護(hù)作用6-7。POLOMSKA等8研究發(fā)現(xiàn)，凍干假絲酵母時(shí)，采用脫脂奶粉、海藻糖和谷氨酸鈉作保護(hù)劑比僅使用脫脂奶粉作

2、為保護(hù)劑酵母存活率提高了60%。美極梅奇酵母(Metschnikowiapulcherrima，Mp)是一種常見的非釀酒酵母，普遍存在于成熟葡萄漿果表面和葡萄酒發(fā)酵初級(jí)階段9。Mp與釀酒酵母混菌發(fā)酵，具有降低葡萄酒酒精含量、增加甘油含量10、改善葡萄酒的風(fēng)味和品質(zhì)11-12、促進(jìn)紅葡萄酒色澤穩(wěn)定性13等良好釀造特性14-15。因此，其在果酒釀造中具有非常廣泛的應(yīng)用前景。我國釀造菌劑的研發(fā)遠(yuǎn)落后于國外相關(guān)研究，且國內(nèi)果酒釀造菌劑主要依賴進(jìn)口。所以，專一性菌劑的缺乏，是導(dǎo)致國內(nèi)葡萄酒同質(zhì)化問題嚴(yán)重、口感寡淡缺乏特色的關(guān)鍵。因此，開發(fā)高效菌劑是提升果酒風(fēng)味和品質(zhì)的關(guān)鍵，也是提升果蔬精加工產(chǎn)品附加值的

3、重要手段。為了促進(jìn)Mp發(fā)酵劑的商業(yè)化及推廣其廣泛應(yīng)用，有必要開展高穩(wěn)定性及高存活率Mp菌劑的制備方法和技術(shù)等相關(guān)研究。目前雖已有文獻(xiàn)報(bào)道了異常漢遜酵母(Hansenulaanormala)和馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)等少數(shù)非釀酒酵母冷凍干燥保護(hù)劑的研究6,16，并對(duì)保護(hù)劑的保護(hù)機(jī)理進(jìn)行了初步探討，為非釀酒酵母冷凍干燥菌劑的開發(fā)提供了參考。但研究發(fā)現(xiàn)，不同物種甚至同一物種的不同菌株在真空冷凍干燥及其儲(chǔ)存期間表現(xiàn)出不同的行為17。因此，目前有關(guān)非釀酒酵母冷凍干燥菌劑及其保護(hù)劑的開發(fā)還需要開展廣泛的研究。同時(shí)，有關(guān)Mp菌劑的開發(fā)及其冷凍復(fù)合保護(hù)劑的研究還鮮見報(bào)道

4、。本研究采用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)法篩選出對(duì)Mp冷凍干燥具有顯著保護(hù)作用的保護(hù)劑，結(jié)合最陡爬坡試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法(response surface method,RSM)進(jìn)一步優(yōu)化保護(hù)劑復(fù)合配方，以期最大限度提高該酵母在冷凍干燥過程中的存活率，為未來實(shí)現(xiàn)Mp發(fā)酵劑工業(yè)化的制備和應(yīng)用提供參考，也為其他酵母冷凍干燥保護(hù)劑的研究和開發(fā)提供一定的研究基礎(chǔ)和參考。1 材料與方法1.1 材料與試劑美極梅奇酵母(Mp 01)，由河北科技師范學(xué)院釀酒工程實(shí)驗(yàn)室保藏。YPD液體培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸粉 10、蛋白胨 20、葡萄糖 20，121 滅菌20 min。YEPD固體培養(yǎng)基(g/L)：酵

5、母浸粉 10、蛋白胨 20、葡萄糖 20、瓊脂 20，121 滅菌20 min。葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂粉，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；脫脂乳粉，山東億寶萊生物科技有限公司；谷氨酸鈉和海藻糖，河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司；麥芽糖，成都市科龍化工試劑廠；蔗糖，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；乳糖、甘氨酸、維生素C，上海源葉生物科技生物有限公司；吐溫-80，阿拉丁。1.2 儀器與設(shè)備FDU-1 200 EYELA真空冷凍干燥機(jī)，北京五洲東方科技發(fā)展有限公司；低溫離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；SW-CJ 系列潔凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；數(shù)顯立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)

6、療設(shè)備廠；BS-2F數(shù)顯恒溫振蕩培養(yǎng)箱，金壇區(qū)水北科普實(shí)驗(yàn)儀器廠。1.3 實(shí)驗(yàn)方法1.3.1 美極梅奇酵母生長曲線及菌體收集時(shí)間的確定菌種的活化：適量挑取斜面菌種接種于100 mL YPD液體培養(yǎng)基中，28 、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，得活化種子液，并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。將活化的酵母種子液以1.0106CFU/mL 的接種量接入150 mL YPD培養(yǎng)基中，28 、150 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔3 h取樣，測(cè)定其OD600值。以未接種的培養(yǎng)基為空白對(duì)照，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)繪制Mp 01生長曲線，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。1.3.2 美極梅奇酵母菌液離心條件的確定根據(jù)

7、1.3.1確定的Mp 01生長曲線，在酵母減速生長末期及平衡期初期收集酵母菌體，通過考察不同離心力(2 184、2 852、3 610、4 457g)及不同離心時(shí)間(3、5、10、15、20 min)對(duì)酵母收集率的影響，確定適宜離心轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間。1.3.3 酵母活菌計(jì)數(shù)方法離心后收集菌泥，加入與離心菌液等體積的生理鹽水對(duì)菌體進(jìn)行復(fù)溶。取離心前菌液及離心后菌泥用生理鹽水復(fù)溶后的菌液17，采用稀釋涂布法確定活菌數(shù)，存活率計(jì)算如公式(1)所示：存活率(1)式中：N1，沉淀復(fù)溶液中的活菌數(shù)；N2，初始活菌數(shù)。1.3.4 冷凍干燥方法將離心后的菌泥放入無菌凍存管中，菌泥與保護(hù)劑按12的體積比混合，放入

8、-80 冰箱預(yù)凍4 h。提前開啟凍干機(jī)，待冷阱溫度達(dá)到-40 時(shí)，將處理好的MP 01立即放入凍干機(jī)，真空凍干24 h。采用稀釋涂布法計(jì)算冷凍干燥前后的活菌數(shù)18，如公式(2)所示：存活率(2)式中：N3，凍干粉復(fù)溶后的活菌數(shù)；N4，初始活菌數(shù)。1.3.5 不同保護(hù)劑對(duì)酵母存活率的影響單因素試驗(yàn)：選取海藻糖、蔗糖、乳糖、維生素C、谷氨酸鈉、甘氨酸、麥芽糖、脫脂乳粉、吐溫-80作為單一冷凍干燥保護(hù)劑，以上保護(hù)劑的濃度參照文獻(xiàn)報(bào)道3,5,7-8，分別設(shè)定質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%、5%、7%、9%、11%，以存活率作為檢測(cè)指標(biāo)初步篩選凍干存活率積極影響作用比較顯著的因素和水平，進(jìn)行Plackett-Burma

9、n(PB)試驗(yàn)設(shè)計(jì)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1。1.3.6 Plackett-Burman試驗(yàn)根據(jù)1.3.5的試驗(yàn)結(jié)果，確定保護(hù)劑種類，每個(gè)因素設(shè)置高、低2個(gè)水平，使用Design-Expert 8.0.6設(shè)計(jì)n=12的PB測(cè)試19，篩選對(duì)Mp 01存活率有顯著影響作用的保護(hù)劑成分。1.3.7 最陡爬坡試驗(yàn)根據(jù)DU等20的方法，對(duì)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果確定的顯著影響因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，分析對(duì)Mp 01凍干存活率具有顯著影響作用的因素，并進(jìn)一步確定顯著影響因素的最佳水平范圍。1.3.8 美極梅奇酵母凍干保護(hù)劑復(fù)合配方的優(yōu)化試驗(yàn)及驗(yàn)證根據(jù)1.3.6的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用Design-Expe

10、rt 8.0.6進(jìn)行Box-Behnken Design(BBD)響應(yīng)面分析，確定Mp 01最優(yōu)凍干保護(hù)劑的配比21。1.3.9 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)根據(jù)Box-Benhnken模型的中心組合原理，主要采用Design-Expert 8.0.6中Plackett-Burman、RSM進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析及模型的建立，差異顯著性水平為0.01和0.05。2 結(jié)果與分析2.1 美極梅奇酵母生長曲線由Mp 01的生長曲線可知(圖1)，在接入菌種后的06 h為酵母生長的遲滯期，918 h為酵母的對(duì)數(shù)生長期，21 h左右進(jìn)入穩(wěn)定期(平衡期)，菌體量逐漸達(dá)到最大值，綜合考慮菌齡和菌體量，本試驗(yàn)在發(fā)酵的

11、第24 h進(jìn)行菌體收集。圖1 美極梅奇酵母生長曲線Fig.1 Growth curve ofM.pulcherrima2.2 離心條件對(duì)美極梅奇酵母收集率的影響將收集的Mp 01菌體在不同條件下進(jìn)行離心，并計(jì)算Mp 01的收集率，結(jié)果如圖2所示。離心轉(zhuǎn)速和時(shí)間對(duì)菌體收集率有明顯影響，隨著轉(zhuǎn)速和時(shí)間的延長，離心收集率先增大再減小，在15 min時(shí)，收集率最高；20 min時(shí)降低，隨著時(shí)間的延長，離心力對(duì)酵母細(xì)胞的破壞影響增大，細(xì)胞死亡率增大，導(dǎo)致收集率下降。最終確定，2 852g離心15 min，Mp 01的收集率最高為93.55%，為本試驗(yàn)最佳離心條件。圖2 美極梅奇酵母在不同離心力及 時(shí)間下

12、的離心存活率Fig.2 Survival rate ofM.pulcherrimaunder different centrifugal force and time2.3 單一保護(hù)劑對(duì)美極梅奇酵母凍干存活率的影響綜合文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果，優(yōu)選9種物質(zhì)(表1)作為Mp 01冷凍干燥過程中的單一保護(hù)劑。由表1數(shù)據(jù)可知，9種單一保護(hù)劑對(duì)Mp 01具有不同保護(hù)作用。其中脫脂乳粉、麥芽糖、蔗糖、海藻糖、谷氨酸鈉和乳糖等6種物質(zhì)作為單一保護(hù)劑時(shí)，Mp 01的存活率相對(duì)較高，存活率最高分別能達(dá)到64.9%，76.88%，77.3%，80.7%，70.92%，70.8%。因此，選擇以上6種保護(hù)劑進(jìn)行顯著影響因素分析

13、。表1 不同保護(hù)劑種類及濃度對(duì)美極梅奇酵母凍干存活率的影響 單位：%Table 1 Effect of different drying protective and concentration on the survival rate of yeast2.4 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及顯著影響因素根據(jù)1.3.6的方法，進(jìn)行Plackett-Burman(PB)試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)19,22，考查以上6種冷凍保護(hù)劑成分(脫脂乳粉、谷氨酸鈉、海藻糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖)中，對(duì)Mp 01冷凍干燥過程中的存活率具有顯著影響作用的因素，PB設(shè)計(jì)結(jié)果見表2，試驗(yàn)結(jié)果見表3，各因素效應(yīng)分析見表

14、4。對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行效應(yīng)分析(表4)，發(fā)現(xiàn)本次PB試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷腜值為0.044 0，說明此模型在0.05水平上足以擬合試驗(yàn)數(shù)據(jù)。表4中麥芽糖、蔗糖和海藻糖的效應(yīng)值均為正，說明對(duì)Mp 01存活率有顯著正作用，表2 Plackett-Burman設(shè)計(jì)因素與水平Table 2 Factors and levels of Plackett-Burman design注：G、H、J、K、L為虛擬項(xiàng)(下同)表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 單位：%Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiments表4 Plackett-Burm

15、an試驗(yàn)設(shè)計(jì)各因素效應(yīng)分析Table 4 Effect analysis of Plackett-Burman experiments design注：P0.01 表示差異極顯著；0.01P0.05 表示差異顯著；P0.05 表示差異不顯著而其余因素作用效果不顯著(P0.05)。因此，麥芽糖、蔗糖和海藻糖是對(duì)Mp 01冷凍過程中具有顯著保護(hù)作用的保護(hù)劑，需進(jìn)一步確定這3種顯著因素的最佳添加水平和配比。2.5 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果本試驗(yàn)利用最陡爬坡試驗(yàn)，對(duì)顯著影響因素麥芽糖、蔗糖和海藻糖的濃度范圍和配比進(jìn)行優(yōu)化，以對(duì)Mp 01凍干過程達(dá)到最好的保護(hù)作用。最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，3個(gè)因素的變化方向的

16、效應(yīng)均為正效應(yīng)(表4)，因此最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)中以上3因素的水平均為正向變化，從低值往上增加。具體結(jié)果見表5。表5 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 單位：%Table 5 Designs and results of the steepest experiments實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，麥芽糖、蔗糖和海藻糖分別以13%、10%和14%(表5，試驗(yàn)號(hào)5)進(jìn)行配比時(shí)，對(duì)Mp 01的保護(hù)效果最好。因此，進(jìn)一步將表5中的第5組試驗(yàn)中的3因素及其水平確定為響應(yīng)面優(yōu)化研究的試驗(yàn)中心組合。2.6 響應(yīng)面法優(yōu)化美極梅奇酵母凍干復(fù)合保護(hù)劑配比2.6.1 復(fù)合保護(hù)劑響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果(表5)，使用Design-Ex

17、pert 8.0.6對(duì)麥芽糖、蔗糖和海藻糖進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)。響應(yīng)面具體設(shè)計(jì)方案和試驗(yàn)結(jié)果如表6所示，方差分析如表7所示。將表7中數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合分析，獲得Mp 01的菌體存活率對(duì)麥芽糖、蔗糖和海藻糖的二元多項(xiàng)式回歸方程：Y/%=93.35+3.71A+2.69B+2.00C-1.16AB-3.50AC-3.07BC-4.27A2-5.38B2-5.17C2由表7可知，P0.000 1，說明此模型在=0.01的水平上回歸顯著；失擬項(xiàng)P值為0.058 90.05，表6 美極梅奇酵母菌存活條件優(yōu)化Box-Benhnken 設(shè)計(jì)方案及結(jié)果 單位：%Table 6 Design a

18、nd results of Box-Benhnken experiments for survival conditions optimization ofM.pulcherrima表7 響應(yīng)面試驗(yàn)回歸方程方差分析Table 7 Analysis of variance of regression equation注：P0.01表示差異極顯著表明失擬項(xiàng)不顯著，由此可知該方程可真實(shí)反映Mp 01冷凍過程中存活率的實(shí)際情況。響應(yīng)面試驗(yàn)回歸方程的決定系數(shù)R2=0.990 3，表明該模型具有很好的相關(guān)性。修正后的決定系數(shù)表明該響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)Ｐ涂梢越忉?7.79%的響應(yīng)面值的變化。響應(yīng)面的變異系數(shù)為1.0

19、9%，表明僅有1.09%的變異不能由該模型解釋。因此，可用該模型來預(yù)測(cè)不同保護(hù)劑組合對(duì)Mp 01存活率的影響，并且麥芽糖、蔗糖和海藻糖這3個(gè)因素對(duì)Mp 01菌體存活率影響作用都非常顯著。2.6.2 冷凍保護(hù)劑最優(yōu)組合配方及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)依據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，通過對(duì)回歸模型進(jìn)行數(shù)學(xué)分析，得到的Mp 01最優(yōu)凍干保護(hù)劑配方：麥芽糖130 g/L、蔗糖100 g/L和海藻糖140 g/L，在此條件下Mp 01存活率預(yù)測(cè)值為93.34%。將所得最優(yōu)保護(hù)劑配方應(yīng)用于Mp 01的冷凍干燥，重復(fù)3次，Mp 01的平均存活率為92.78%，與預(yù)測(cè)值相差0.56%。以上結(jié)果說明，由響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)得到的數(shù)學(xué)模型準(zhǔn)確可靠，

20、得到的最佳凍干保護(hù)劑組合方案可行，在實(shí)際操作中具有指導(dǎo)意義。2.6.3 美極梅奇酵母發(fā)酵劑貯藏條件及穩(wěn)定性測(cè)定對(duì)Mp 01凍干菌劑貯藏條件進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表8，確定貯藏條件后，對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行持續(xù)觀察，結(jié)果見表9。表8 美極梅奇酵母貯藏條件結(jié)果 單位：%Table 8 Results of the storage conditions ofM.pulcherrima表9 美極梅奇酵母發(fā)酵劑貯藏穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果Table 9 Result ofM.pulcherrimastarter storage stability test通過對(duì)美極梅奇酵母菌劑貯藏條件的研究發(fā)現(xiàn)，凍干菌劑在-20 條件下貯

21、藏，其存活率遠(yuǎn)高于室溫和4 條件，對(duì)貯藏穩(wěn)定性的研究發(fā)現(xiàn)，在-20 條件下保存4個(gè)月仍具有較高的存活率(89.85%)，說明在此條件下貯藏凍干菌劑具有較好的穩(wěn)定性。3 結(jié)論與討論酵母的代謝和生理特征存在種間和種內(nèi)差異，現(xiàn)階段并沒有普遍而有效的方法用于酵母凍干過程的保護(hù)。因此，對(duì)于不同的酵母，有必要開展針對(duì)性的凍干工藝，并優(yōu)化最佳保護(hù)劑的配方，以促進(jìn)其商業(yè)生產(chǎn)和廣泛應(yīng)用。本研究前期篩選出的美極梅奇酵母Mp 01具有纖維素酶、果膠酶和-葡萄糖苷酶等多種水解酶活性，有利于提高水果果皮花色素苷及果皮中品種香氣成分的釋放，對(duì)果酒釀造過程中果酒的澄清及增香具有非常重要的影響作用。因此本研究開展了Mp 01

22、冷凍干燥保護(hù)劑的優(yōu)化研究，以期為該酵母的廣泛應(yīng)用及Mp商業(yè)菌劑的制備提供研究基礎(chǔ)和方法學(xué)參考。首先通過評(píng)估9種單一保護(hù)劑對(duì)Mp 01冷凍干燥過程的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)脫脂乳粉、麥芽糖、蔗糖、海藻糖、谷氨酸鈉和乳糖等6種保護(hù)劑對(duì)Mp 01具有較好保護(hù)作用，進(jìn)一步通過Plackett-Burman試驗(yàn)法，發(fā)現(xiàn)麥芽糖、蔗糖和海藻糖對(duì)Mp 01的保護(hù)作用最為顯著，最后通過最陡爬坡試驗(yàn)和響應(yīng)面法，確定了Mp 01冷凍干燥復(fù)合保護(hù)劑配方(麥芽糖130 g/L、蔗糖100 g/L和海藻糖140 g/L)，結(jié)果表明，Mp 01冷凍干燥后的平均存活率達(dá)到92.78%，比單一保護(hù)劑最高存活率提高了16%左右。已有研究發(fā)現(xiàn)，糖醇類物質(zhì)是酵母冷凍干燥過程中的有效保護(hù)劑4，本研究也驗(yàn)證了這一結(jié)論。在本研究中，對(duì)Mp 01具有顯著保