1、燈盞細(xì)辛對神經(jīng)細(xì)胞尼古丁受體表達(dá)的影響及其神經(jīng)庇護(hù)作用研究齊曉嵐，黃勇，王永林，王愛民，官志忠【摘要】目的研究中藥燈盞細(xì)辛對神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞神經(jīng)型尼古丁受體表達(dá)的影響及其對抗淀粉樣卵白A神經(jīng)毒性作用機(jī)制。要領(lǐng)接納比色法測定細(xì)胞TT復(fù)原率挑選藥物濃度寧靜范疇，拔取必然濃度的燈盞細(xì)辛乙醇提取物醋酸乙酯部位處置懲罰SH-SY5Y細(xì)胞后，再參加A1-42處置懲罰，測定TT復(fù)原率，卵白質(zhì)印跡法esternbltting要領(lǐng)測定神經(jīng)型尼古丁受體3、7卵白表達(dá)的變革；接納革新的Ellan比色法測定細(xì)胞造就基中乙酰膽堿酯酶Aetylhlinesterase，AhE及丁酰膽堿酯酶Butyrylhl

2、inesterase，BuhE活性。效果燈盞細(xì)辛乙醇提取物醋酸乙酯部位能進(jìn)步細(xì)胞3及7尼古丁受體亞單元卵白質(zhì)表達(dá)程度；低落細(xì)胞乙酰膽堿酯酶活性；并能對抗A引起的TT復(fù)原率低落。結(jié)論燈盞細(xì)辛乙醇提取物醋酸乙酯部位能上調(diào)尼古丁受體亞單元卵白表達(dá)程度，低落細(xì)胞乙酰膽堿酯酶活性，且能對抗A的神經(jīng)毒性作用，在阿爾茨海默氏病的治療中大概起到必然作用?！娟P(guān)鍵詞】燈盞細(xì)辛；SH-SY5Y細(xì)胞；尼古丁受體；-淀粉樣卵白；膽堿酯酶；阿爾茨海默氏病Abstrat：bjetiveTinvestigatetheeffetsfHerbaErigertisntheexpressinfnitiniaetylhlinereep

3、tr(nAhR)andtheanti-neurtxiityehanisfthedrugbyusingneurblastaSH-SY5Yellstreatedithbeta-aylidpeptide.ethdsTheSH-SY5YellseretreatedbyHerbaErigeritis,andthenexpsedtA1-42.TTredutinassayasusedthsasafe-dsenentratinfHerbaErigeritisandtunderstandtheinfluenesfthedrugsnellularviabilityresultedfrthetreatentfA;e

4、xpressinsf3and7nAhRsubunitsatprtEinleveleredetetedbyestern-bltting.Thelevelsfaetylhlinesterase(AhE)andbutyrylhlinesterase(BuhE)ativitiesinellultureediusereeaturedbyaniprvedEllanslrietriethd.ResultsHerbaErigertisstiulatedinreasesf7and3nAhRprteinsintheulturedells;dereasedtheativityfAhEandinhibitedthed

5、ereasedTTredutinresultedfrA.nlusinHerbaErigertisanupregulatetheexpressinfnAhRsubunitsatprteinlevel,dereasetheativityfAhEandpreventthedereasedTTredutininduedbyA.ThedrugsightplayaniprtantrleintherapeutistrategyfAD.Keyrds：SH-SY5Yells;nAhR;-aylidpepitide;Alzheierdisease;hlinesterase;HerbaErigertis阿爾茨海默氏

6、病Alzheiersdisease，簡稱AD是一種重要在老年期產(chǎn)生的以舉行性癡呆為重要特性的神經(jīng)元退行性變疾病，其重要臨床表現(xiàn)為舉行性認(rèn)知成效停滯、影象力闌珊、性格和舉動(dòng)改變等13。近一個(gè)世紀(jì)以來，浩繁的科學(xué)家就AD的病因及發(fā)病機(jī)制舉行了大量的研究，但其發(fā)病機(jī)制至今尚不非常明晰。如今以為AD是由遺傳學(xué)因素、情況因素和代謝因素等多種因素配合作用所引起的一種疾病，病理學(xué)上以腦細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)及細(xì)胞外老年斑形成為重要特性1。老年斑的重要身分為淀粉樣卵白，是一種神經(jīng)毒性物質(zhì)，可以引起神經(jīng)元的損傷和殞命，是AD發(fā)病歷程中的一個(gè)緊張因素，能促進(jìn)AD的產(chǎn)生和生長。神經(jīng)型尼古丁乙酰膽堿受體(Nitinia

7、etylhlinereeptr,nAhR)或稱尼古丁受體與學(xué)習(xí)和影象等認(rèn)知成效嚴(yán)密相干，并具有顯著的神經(jīng)庇護(hù)作用4。在較早的一些研究中就創(chuàng)造，AD患者大腦皮層nAhR出現(xiàn)連續(xù)和嚴(yán)峻的喪失，大腦皮層nAhR缺失與AD患者認(rèn)知停滯有明顯的相干性。膽堿酯酶hlinestease，hE是一類絲氨酸水解酶，其成效重要為水解快樂性神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿?？煞譃閮深?，乙酰膽堿酯酶Aetylhlinesterase,AhE與丁酰膽堿酯酶Butyrylhlinesterase，BuhE。近幾年的研究表白，AhE和BuhE在AD的發(fā)病歷程中起著緊張的作用，且它們的水解底物Ah缺失的嚴(yán)峻程度與癡呆嚴(yán)密相干5。在AD病人腦

8、中，總AhE的酶活性是落落的，然而在老年斑中以及其四周AhE活性卻是升高的，其能促進(jìn)A的聚攏，并加快其沉淀，形成不成溶的淀粉樣斑塊6。由于AD的發(fā)病機(jī)制龐大，只管天下各國在探求有用治療藥物的研究中投入了大量人力和物力，但效果卻非常有限，如今天下上最為成熟和樂成的要領(lǐng)是接納膽堿酯酶按捺劑hlinesteaseinhibitr，hEI，以進(jìn)步患者腦內(nèi)Ah的程度、賠償膽堿能成效的缺失，也是唯逐一種通過美國FDA容許用于治療AD的藥物7。但是，膽堿酯酶按捺劑只能緩解AD的臨床病癥，而無法到達(dá)根治的作用。中藥是我國奇特的資源，在治療上具有多途徑、多靶點(diǎn)、毒副作用較小等特點(diǎn)，中醫(yī)藥學(xué)從團(tuán)體不雅念動(dòng)身，辨證

9、論治，并積聚了富厚的履歷。燈盞細(xì)辛具有抗血栓,抗缺血,腦缺血再灌注神經(jīng)損傷庇護(hù)作用，且燈盞細(xì)辛乙醇提取物表現(xiàn)-淀粉樣肽聚攏按捺活性8。本研究用A1-42處置懲罰泉源于人腦的神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞作為研究工具，以研究燈盞細(xì)辛神經(jīng)庇護(hù)作用機(jī)制。1試劑及樣品燈盞細(xì)辛由貴陽醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院制備、提供，燈盞藥材以95乙醇提取2次，接納乙醇后，以水混懸，取樣?；鞈宜芤捍姿嵋阴ポ腿?shù)次，醋酸乙酯層歸并接納溶劑得燈盞細(xì)辛乙醇提取物醋酸乙酯部位。D-E造就液購自GibInvitrgen公司英國；源于人腦的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SH-SY5Y細(xì)胞購于Geranlletinfirrganissandellultu

10、res公司德國；羊抗3、7及鼠抗-肌動(dòng)卵白-atin多克隆抗體及HRP標(biāo)識表記標(biāo)幟的抗羊及抗鼠二抗購自SantaruzBitehnlgyIn(美國)。聚乙烯二氟PVDF膜、EL-Plus發(fā)光試劑、高效顯影膠片購自Aersha公司；膽堿酯酶測定試劑及別的化學(xué)試劑均購自Siga公司。2要領(lǐng)2.1細(xì)胞造就，-淀粉樣肽及燈盞細(xì)辛的處置懲罰先用含15胎牛血清的DE造就液造就SH-SY5Y細(xì)胞，待細(xì)胞生長不變后，改用不含血清的DE造就液繼承造就，造就箱中含5%2，溫度為37。在SH-SY5Y細(xì)胞中參加1l/L的A1-42，造就48h。為不雅察燈盞細(xì)辛對A毒性作用的影響，先參加3g/L燈盞細(xì)辛乙醇提取物醋酸

11、乙酯部位造就24h后，再參加1l/LA1-42造就48h。2.23-4,5-二甲基噻唑-2,5-二酚四唑溴化物3-(4,5-diethylthiazl-2-yl)-2,5-diphenyltetrazliubride,TT測定TT是一種四甲基偶氮唑鹽，經(jīng)活細(xì)胞線粒體琥珀酸脫氫酶催化可天生藍(lán)紫色的復(fù)原型TT，該產(chǎn)物在490n波優(yōu)點(diǎn)有極大的汲取峰。比色法測定TT程度9，常用來表現(xiàn)細(xì)胞的損傷程度和成效狀態(tài)。為挑選燈盞細(xì)辛的寧靜濃度，選擇0.0510g/l濃度處置懲罰SH-SY5Y細(xì)胞后24h后測定TT復(fù)原率，以檢測其對細(xì)胞是否具有毒性作用及其寧靜濃度范疇。2.3尼古丁受體亞單元卵白表達(dá)測定參照Gua

12、n等10的要領(lǐng)舉行提取細(xì)胞膜卵白及用西印跡esternbltting要領(lǐng)檢測3，7nAhR亞單元卵白程度。以Labrks軟件闡發(fā)效果時(shí)以-Atin卵白條帶作為內(nèi)參照，盤算3、7nAhR卵白條帶與-Atin卵白條帶像素灰度的百分比值作為3、7nAhR卵白質(zhì)表達(dá)的相對程度比。2.4體外造就的細(xì)胞膽堿酯酶活性測定網(wǎng)絡(luò)細(xì)胞造就基，參加的造就基量根據(jù)卵白定量的效果使其含有雷同的卵白質(zhì)克數(shù)。96孔酶標(biāo)板每孔總體系為200l，每孔加造就基10l，按表1加樣。表1細(xì)胞膽堿酯酶活性測定略于室溫避光處正確反響15in后，在酶標(biāo)儀412n波長下比色。盤算公式為：AhE或BuhE活性單元=2.941D測定值-比擬值3

13、效果3.1中藥寧靜濃度篩查燈盞細(xì)辛乙醇提取物醋酸乙酯部位在所選濃度范疇內(nèi)對SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞TT復(fù)原率無顯著影響，表白其對細(xì)胞毒性作用較校因此選擇3g/l作為本次研究燈盞細(xì)辛的選用濃度圖1。圖1經(jīng)差異濃度燈盞細(xì)辛乙醇提取物乙酸乙酯部位處置懲罰的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞TT復(fù)原率略3.2藥物處置懲罰后TT復(fù)原率測定藥物處置懲罰后TT復(fù)原率測定創(chuàng)造，1l/LA1-42處置懲罰細(xì)胞后引起TT復(fù)原率顯著低落；3g/l燈盞細(xì)辛乙醇提取物醋酸乙酯部位處置懲罰細(xì)胞不影響細(xì)胞成效；而用燈盞細(xì)辛預(yù)處置懲罰細(xì)胞后可顯著削弱A對細(xì)胞的毒性作用，A組與燈盞細(xì)辛+A組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0.05。見圖2。3.3尼

14、古丁受體亞單元卵白表達(dá)程度3及7nAhR亞單元卵白質(zhì)表達(dá)程度效果表白，燈盞細(xì)辛處置懲罰細(xì)胞可上調(diào)細(xì)胞3及7nAhR亞單元卵白質(zhì)表達(dá)程度P0.01。見圖3。3.4細(xì)胞膽堿酯酶測定效果細(xì)胞經(jīng)3g/l燈盞細(xì)辛乙醇提取物醋酸乙酯部位處置懲罰組AhE活性值為11.691.21nlin-1l-1，較空缺比擬組的15.860.47nlin-1l-1低落26.29，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0.05。遍地理組BuhE活性值別離為：空缺比擬組10.880.33nlin-1l-1，燈盞細(xì)辛乙醇提取物處置懲罰組11.161.23nlin-1l-1。兩組間BuhE活性值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0.05。SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)燈

15、盞細(xì)辛及A處置懲罰后TT復(fù)原率測定，效果用單因素方差闡發(fā)法統(tǒng)計(jì)闡發(fā)(n=6)，*表現(xiàn)與比擬組比擬差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0.01；表現(xiàn)與A處置懲罰組比擬差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0.05。n：比擬組；A：A處置懲罰組，DZXX：單純燈盞細(xì)辛處置懲罰組，DZXX+A：燈盞細(xì)辛和A處置懲罰組圖2SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞藥物處置懲罰后TT復(fù)原率略SHSY5Y細(xì)胞經(jīng)燈盞細(xì)辛處置懲罰后，用esternbltting法測定SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞3及a7尼古丁受體亞單元卵白質(zhì)表達(dá)程度，效果用單因素方差闡發(fā)法統(tǒng)計(jì)闡發(fā)(n=6)，*表現(xiàn)與比擬組比擬差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0.01。n：比擬組，DZXX：燈盞細(xì)辛處置懲罰組圖3SH-S

16、Y5Y神經(jīng)細(xì)胞藥物處置懲罰后3及7尼古丁受體亞單元卵白質(zhì)表達(dá)程度略4討論大量研究已經(jīng)證明在AD腦構(gòu)造中老年斑的重要身分A是由其前體卵白-Aylidpreursrpeptide,APP經(jīng)排泄酶-和-水解后形成的，具有必然的神經(jīng)毒性作用。邇來也有研究表白，A的損傷作用是AD產(chǎn)生生長的重要因素11。本研究用A1-42處置懲罰泉源于人類的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞，模擬AD患者腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的病理歷程，以此作為燈盞細(xì)辛體外研究的類AD細(xì)胞模子。研究效果表現(xiàn)，與比擬組比擬，A1-42處置懲罰組SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞的TT復(fù)原率顯著低落，進(jìn)一步證明A-可引起神經(jīng)細(xì)胞的損傷。實(shí)行還創(chuàng)造，燈盞細(xì)辛預(yù)處置懲罰的SH-

17、SY5Y神經(jīng)細(xì)胞可以或許對抗A引起的TT復(fù)原率低落，進(jìn)一步表白該中藥具有抗A細(xì)胞毒性的作用。神經(jīng)型尼古丁受體是神經(jīng)體系中一類非第2信使介導(dǎo)性神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)合的離子通道，與學(xué)習(xí)和影象干系嚴(yán)密，是一類明白的具有神經(jīng)庇護(hù)成效的受體，其淘汰與AD的產(chǎn)生有關(guān)12。AD病人腦內(nèi)尼古丁受體-配體結(jié)合率低落，其亞基的卵白表達(dá)程度也低落13。如今探求可上調(diào)nAhR且副作用小的藥物是治療AD藥物研究的標(biāo)的目的之一。在SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞中，a3和a7是重要的尼古丁受體亞類。本研究中，通過測定nAhR3和7亞單元卵白質(zhì)程度創(chuàng)造，燈盞細(xì)辛乙醇提取物可以或許顯著地上調(diào)3和7nAhRs卵白質(zhì)的表達(dá)程度，說明在治療AD藥物的選擇中燈盞細(xì)辛大概具有緊張的作用。hE能通過水解膽堿而發(fā)揮生理成效。中樞神經(jīng)體系的AhE及膽堿能受體到場完成神經(jīng)與神經(jīng)之間行動(dòng)電位的通報(bào)歷程，AhE能敏捷水解乙酰膽堿Aetylhline，Ah天生膽堿和乙酸，發(fā)揮停頓神經(jīng)沖動(dòng)通報(bào)的作用5。近幾年的研究表白，AhE和BuhE在AD的發(fā)病歷程中起著緊張的作用，它們的水解底物Ah缺失的嚴(yán)峻程度與癡呆嚴(yán)密相干14。AD病人腦中總體的AhE活性落落，然而在老年斑中以及其四周AhE活性卻是升高的