1、精品文檔精品文檔精品文檔精品文檔實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理及實(shí)驗(yàn)無論是對(duì)遺傳病如地中海貧血和血友病)、傳染病(如肝炎和艾滋病)或腫瘤 技術(shù)都可以發(fā)揮很大作用。定量 技術(shù)的最新進(jìn)展是實(shí)時(shí)熒面還可以做到 值確定起始dnadna定量。這是dna 定量技術(shù)的一次飛躍。典濃度。根據(jù)所使用的技術(shù)不同，熒光定量sybr i 熒光染料兩種方法。比較而言，方案時(shí)要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?duì)數(shù)據(jù)精度的要求來決定。以監(jiān)控試劑和實(shí)驗(yàn)操作方面可能出現(xiàn)的問題。為什么終點(diǎn)定量不準(zhǔn)確？我們都知道理論上 擴(kuò)增曲線并不是標(biāo)準(zhǔn)的指數(shù)曲線，而是s 形曲線。這是因?yàn)殡S著 酶、dna 的效率越來越低，產(chǎn)物增長的速度就逐漸減緩。當(dāng)所有的酶

2、都被飽和以反應(yīng)使是重復(fù)實(shí)驗(yàn)，各種條件基本一致，最后得到的dna 波動(dòng)很大（1）。圖 1 同一個(gè)樣本重復(fù) 96 次 pcr 的擴(kuò)增曲線測定的都是dna的終產(chǎn)物量與起始dna拷貝數(shù)。放大之前標(biāo)本中的dnadna拷貝數(shù)已經(jīng)不 值確定dna 起始拷貝的數(shù)量。為什么值與起始模板拷貝數(shù)成線性關(guān)系？值的定義1dna 值卻是相對(duì)固定的。如果用不同濃度的dna 作pcr出dna值越小。dna11個(gè)循環(huán)。值與模板dna的起始拷貝數(shù)成反比。改變方程的線性性質(zhì)。一般地，我們有n循環(huán)時(shí)的熒光信號(hào)強(qiáng)度等于背景信號(hào)強(qiáng)度加上每個(gè)分子的熒光強(qiáng)度(與分子數(shù)目的乘積。當(dāng)循環(huán)次數(shù)nrt=rb+xo(1+ex)ctrs。兩邊取對(duì)數(shù)，得

3、rblogx0ctlog(1s- logx0 + log(rt -rb)logrs。整理此式，ctlog(1+ ex) =所以對(duì)于每一個(gè)特定的、rt、值與log x0 值與起始模板拷貝數(shù)(x0)dna11個(gè)循環(huán)。值的定量是精確和嚴(yán)格的，而傳統(tǒng)的終點(diǎn)定量則比較粗放。如果讀者有興趣的話，也可以假設(shè)的效率(即ex)值的最佳范圍。值？t值定義為在基線上方產(chǎn)生可檢測到的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的熒光發(fā)射時(shí)所對(duì)應(yīng)的 循環(huán)次數(shù)（圖 2）?；€上方也就是閾值高度的量化定義是10倍。擴(kuò)增曲線的交點(diǎn)所指的值。3個(gè)循環(huán)起到值33153較大，不是真正的基線高度；而在3個(gè)循環(huán)之內(nèi)，大多數(shù)情況下熒光信號(hào)已經(jīng)開始增強(qiáng)，超過了基線高度，

4、都不宜當(dāng)作基線來處理。圖2值和閾值一個(gè)完全客觀的參數(shù)。dna值越大，模板dna 的起始拷貝數(shù)越少。18-30 之間，過大和過小都將影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的精度。熒光信號(hào)和定量數(shù)據(jù)的歸一化雖然大多數(shù)定量現(xiàn)，一般采用紅色 熒光，稱為陽性參比信號(hào)。 在反應(yīng)緩沖液中的濃度是標(biāo)基因和對(duì)照基因的信號(hào)除以陽性參比信號(hào)以后，即r/樣的起點(diǎn)上進(jìn)行比較和各種計(jì)算。rox 校正可以提高定量數(shù)據(jù)的精度和重現(xiàn)性，減少孔間差異（圖 3）。圖 3 rox 熒光校正（左）和不校正（右）對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的影響歸一后的熒光信號(hào)再扣除本底，就得到drn：drn = rn,樣本- rn,空白。drn是最后構(gòu)建pcr 實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線的縱坐標(biāo)。的樣本所來

5、源的細(xì)胞數(shù)目并不一樣，所以拷貝/l或拷貝/ng的定量數(shù)據(jù)相互之間實(shí)際上并不可比。只有將這些數(shù)據(jù)歸一到以拷貝細(xì)胞或拷貝/基因組為單位后，才可進(jìn)行嚴(yán)格意義上的比較。這種校正可以通過適當(dāng)?shù)膮⒈葋硗瓿?。參比一般選用樣本/樣本值與起始dna 拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)是反比關(guān)系，可以證明，這兩種計(jì)算方法在數(shù)學(xué)上是等價(jià)的。為了減少誤差，目標(biāo)基因和參比基因最好在同一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)進(jìn)行定量測定，所以這種對(duì)照稱為陽性內(nèi)對(duì)照positivecontrol，ipc)。要進(jìn)行ipc 歸一化校正，定量儀必須具備多色檢測能力，最好是4 和參比基因只能分兩管作定量，就不成其為內(nèi)標(biāo)了。污染的預(yù)防和熱啟動(dòng)ung 酶ung 酶的作用原理是降解含

6、有du 的雙鏈或單鏈激活，95c試劑盒均以dutp取代，所以du的dna鏈。在定量的保溫步驟，ung產(chǎn)物降解破壞，防止可能造成的污染。普通的 酶即使在室溫下也有一定的活性，如果不采取措施，在加入 試劑的過程中、正式開始前就會(huì)完成少量 擴(kuò)增，增加了背景，影響定量精度。而金牌 10 min的熱啟動(dòng)以后，封閉被解除，才能開始dna 鏈延伸，這樣就最大限度地減少了雜訊的生成。標(biāo)準(zhǔn)曲線、重復(fù)實(shí)驗(yàn)和陰性、陽性對(duì)照3 68 次，以滿足小樣本統(tǒng)計(jì)的要求。如果作絕對(duì)定量，則標(biāo)準(zhǔn)曲線需要在 5 個(gè)點(diǎn)以上。標(biāo)準(zhǔn)曲線使用的標(biāo)準(zhǔn)品是濃度已知的dna 條件應(yīng)當(dāng)與未知樣本的一致，以便在同一反應(yīng)板上同時(shí)定量。陰性對(duì)照中不加模

7、板立了ipc 既可以用來校正數(shù)據(jù)，也可以起到陽性對(duì)照的作用。探針技術(shù)原理35 以熒光信號(hào)的強(qiáng)弱就代表了模板的數(shù)量。在引物和一條探針。5端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán), r)、vic 等，3端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán), q)， 如 儀器檢測不到信號(hào)。隨著酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針，其外切核酸酶活性就會(huì)將探針切斷，報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，其能 量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光信號(hào)（4）。所以，每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，熒光信號(hào)也和目的片段一樣，有一個(gè)同步指數(shù)增長的過程。信號(hào)的強(qiáng)度就代表了模板dna的拷貝數(shù)。圖 4 taqman 探針的熒光信號(hào)產(chǎn)生機(jī)制端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)的不同分為兩種：普通的探針和探針。探針的淬滅基團(tuán)采用非熒光

8、淬滅基團(tuán)quencher)，本身不產(chǎn)生熒光，可以大大降低本底信號(hào)的強(qiáng)度。同時(shí)探針上還連接有minorgroove修飾基團(tuán)（圖5），可以將探針的tmtm值，mgb探針可以比普通 探針設(shè)計(jì)得更短，既降低了合成成本，也使得探針設(shè)計(jì)的成功率大為提高。因?yàn)樵谀０宓膁na 實(shí)探針對(duì)于富含的模板可以區(qū)分得更為理想。圖 5 taqman mgb 探針sybri熒光染料技術(shù)原理sybridna雙鏈結(jié)合的熒光染料（圖6）。當(dāng)它與dna 雙鏈結(jié)合時(shí)，發(fā)出熒光；從dna 雙鏈上釋放出來時(shí)，熒光信號(hào)急劇減弱。因此，在一個(gè)體系內(nèi)，其信號(hào)強(qiáng)度代表了雙鏈dna分sybr熒光染料法定量sybr 染料與dna雙鏈結(jié)合時(shí)發(fā)出熒光。

9、2、dna變性時(shí)，sybr染料釋放3、在聚合延伸過程中，引物退火并形成 4 染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，定量 加大。6 sybr i dna雙鏈的結(jié)合sybr idna dna 所以特異性不如探針。要想用熒光染料法得到比較好的定量結(jié)果，對(duì)引物設(shè)計(jì)的特異性和反應(yīng)的質(zhì)量要求就比較高。在此前提下，本法是一種成本低廉的選擇。定量儀簡介目前在國內(nèi)使用得比較多的熒光實(shí)時(shí)定量儀有美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司7700等。下面以abi 最新推出的 7000 型為例作簡單介紹。7000 型熒光定量 儀設(shè)計(jì)滿足臨床檢驗(yàn)、醫(yī)學(xué)研究和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的要求， 引物和探針設(shè)計(jì)軟件 非常有用，因?yàn)榈侥壳盀橹惯€沒有其他軟件有能力設(shè)計(jì)定量所需的探針。

10、7000型有實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)和終點(diǎn)讀板兩種運(yùn)行模式。實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)模式用于定量，測定dna或拷貝數(shù)。7000型可以動(dòng)態(tài)顯示擴(kuò)增曲線的生成，定量的線性范圍大于7個(gè)數(shù)量級(jí)，區(qū)分500010000個(gè)拷貝的dna 99.7%。終點(diǎn)讀板模式用于基因型鑒定、點(diǎn)突變檢測和單核苷酸多態(tài)性（snp）分析等。當(dāng)然，7000型也可以作為普通儀使用。已經(jīng)發(fā)124萬個(gè)基因，平均每個(gè)基因37900型開展課題研究創(chuàng)造了絕佳的條件。7000型最大特色是具備多色檢測能力，熒光檢測的波長范圍為 ，能夠有效地分辨/i /、和等熒光染料。多色熒光檢測技術(shù)為多重定量、snp 分析、基因型分型和帶陽性內(nèi)對(duì)照的陰/陽性分析提供了基礎(chǔ)。多重定量即在同一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)對(duì)多個(gè)目標(biāo)基因進(jìn)行定量，可以大大提高精度并節(jié)約成本。7000熒光探針和sybri熒光染料。其熔解曲線擴(kuò)增反應(yīng)是否特異，有無雜帶生成。進(jìn)一步閱讀材料基本方法1ysin opin943-48.1998.2 in 36255-2691998.絕對(duì)定量3d1999to102559-25661999.4dekokuse of to dna 44(10220