1、1 第三章 人類基因組學(xué)(human genomics)概述: 第一節(jié) 人類基因組和基因組學(xué)基因組(genome):一個生命體遺傳信息的總和(單倍體細胞內(nèi))人類基因組(括:核基因組和mt基因組。通常指)基因組學(xué)(genomics):在整個基因組的層次上總體研究某一物種的所有基因的結(jié)構(gòu)與功能,以及所有物種細胞的基因組在結(jié)構(gòu)、功能上的異同關(guān)系。 結(jié)構(gòu)基因組學(xué)：數(shù)量 位置距離 序列基因組學(xué) 功能基因組學(xué)：表達 調(diào)控 功能 比較基因組學(xué)：比較不同物種基因組的異同2第二節(jié) 人類基因組計劃（ human genome project，HGP)20世紀90年代重大科學(xué)項目三大計劃一、計劃的提出及任務(wù)1986

2、 Renato Dulbecco1990.10 美國啟動該計劃 30億美元 15年最初目標：1）構(gòu)建人類基因組遺傳圖和物理圖。2）確定人DNA全部核苷酸序列。3）定位全部基因。4）對其他生物進行類似研究。93年，增人類基因組的鑒定和分離。98年，增基因組多樣性、強化功能基因組的研究。后基因組 生物系統(tǒng)學(xué)3二、參與研究者美、英、日、法、德、中、私人企業(yè)、研究公司、制藥集團。三、研究狀況2000年.6.23，6國科學(xué)家公布：人類基因組序列“工作框架圖”（working draft）（90%），引起強烈反響。2001.2.12,國際人類基因組組織（6國）和Celera公司分別在Nature和 Sci

3、ence公布人類基因組序列工作草圖（99%）。32億bp 3千部紅樓夢我國科學(xué)家 3p測序2004.10，公布人類基因組完成圖。4四、HGP的意義理論意義：測序 基因數(shù) 基因功能醫(yī)學(xué)意義：提供一個可資借鑒的正常人類基因信息庫 先知先覺產(chǎn)前基因診斷.治療藥學(xué)意義附:我國水稻基因組研究2002,4,4, 中科院 Science 繪制完成水稻基因組序列總數(shù)：46022-55615 打破“生命越高級，基因數(shù)越多”的誤區(qū)。5五、基因組作圖和DNA測序概述 HGP任務(wù)：構(gòu)建遺傳圖、物理圖、確定DNA序列、定位基因基因組作圖（genome mapping）：將基因組這一巨大研究對象分解成較易操作的小的結(jié)構(gòu)區(qū)

4、域，分析研究。（一）遺傳圖（genetic map）或連鎖圖（lingkage map） 將每條染色體上的基因或遺傳標記的相對位置經(jīng)連鎖分析確定下來構(gòu)成的圖。 經(jīng)計算連鎖的遺傳標志間的重組率，確定基因的相對距離，用厘摩表示（centrimorgan，cM）， 1厘摩（cM）=減數(shù)分裂時兩個基因間重組率為1%。例：A和B間的重組率為2連鎖圖ABC2357第三代遺傳標志：即單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP） （1996） SNP定義：基因組中某一堿基的變異，頻率大于1%。數(shù)量多（300多萬），覆蓋密度高。作用：用于遺傳作圖；多樣性研究；識別、定位

5、疾病相關(guān)基因。8（二）物理圖（physical map） 即確定各遺傳標志之間的物理距離的圖譜，以堿基對數(shù)量表示（bp，kb，mb（兆堿基）。物理圖含兩方面含義：其一：指以一段已知核苷酸序列的DNA片段（即稱為序列標簽部位，sequence tagged site,STS）為“位標”，以Mb或Kb作為圖距的g圖.例：對STS的要求：（1）在g組中有明確的位置（2）一段已知的序列，可用PCR擴增的單拷貝序列位標A位標B位標C3kb2Mb10 構(gòu)建物理圖時，先用限制酶將染色體DNA切成一個個片段，將之插入載體進行克隆化。這些載體包括：（1）酵母人工CS（yeast artificial chrom

6、osome,YAC）插入片段長度：0.52個Mp大片段.（2）細菌人工CS（bacterial artificial chromosome,BAC）插入片段:80300kb（3）P1噬菌體（bacteriophage P1）插入片段,最大125kb.（4） P1來源的人工CS（P1-deriverd,PAC）插入片段,300kb多用BAC構(gòu)建克隆，然后對BAC克隆逐一測序。將隨機長度的DNA片斷在染色體上的排列順序確定下來。這些克隆DNA片斷連接起來，形成重疊克隆群（Conting），再將一個個（Conting)相連成線狀，覆蓋整個染色體。11（三）序列圖（sequence map) 經(jīng)對基因

7、組進行序列分析所建的圖。亦指對g組的大規(guī)模測序。32億bp。1、 g組DNA大規(guī)模測序（DNA測序的策略）（1）基于BAC連續(xù)克隆系的測序概括：在構(gòu)建好BAC連續(xù)克隆系后（確定每一BAC所對應(yīng)CS的區(qū)域）,對BAC逐一測序.步驟：1) 將待測BAC克隆隨機切成小片段（約1.52kb）2) 將小片段克隆入測序載體3)對小片段DNA進行810倍左右覆蓋率的測序4) 將相互重疊的讀出序列（reads）組裝成連續(xù)的重疊線。5) 從質(zhì)量最高的讀出序列中取得序列。6) 利用引物延伸或其他方法對BAC克隆中還存在的縫隙（gap）進行填補(gap filling)12（2）全g組的“鳥槍法”測序此策略不需要先

8、構(gòu)建YAC、BAC重疊群 直接將g組DNA分解成2kb左右的小片段進行隨機測序，再用計算機進行策略組裝。 例Celera公司測序自動化2、cDNA測序?qū)θ祟恎組中能轉(zhuǎn)錄表達的序列（即g）進行測定。2%【概括序列圖過程（兩種技術(shù)路線）（參考）： （1）公共序列路線：即在物理圖基礎(chǔ)上，將各個BAC克隆片段切成更短的片段，形成亞克隆分別進行測序，再將相互重疊的讀出序列組裝成連續(xù)重疊線。 （2）“鳥槍法”測序路線：即直接將基因組DNA分割成20kb左右的小片段進行隨機測序，再用超級計算機組裝成重疊線。所形成的序列圖稱celera序列。 ACGTCCGATCGGTTCATGCC TCGGTTCATGCC

9、AATGCCGTCC】14（2）人類g組測序1、2001-2-15，6國完成人類g組工作草圖。95%2、2000-4-6，Celera，某男g(shù)組序列，99%3、1999-12，英、日、美、加、瑞科學(xué)家完成22號CS測序（33.4Mb），545g、134假g。4、2000-4，日、美、德完成21號CS測序。5、2004.10，公布人類基因組計劃完成圖。2006.5.18，英美完成1號CS測序，2.23億bp，3142個基因，基因突變與350中疾病有關(guān)。15（四）基因圖（gene map)據(jù)序列圖，用不同方法預(yù)測出基因所在位置的圖。方法：（一）CpG島的應(yīng)用CpG島指每個基因5端轉(zhuǎn)錄起點處富含Cp

10、G的一段DNA。故，測序中，每發(fā)現(xiàn)一CpG島，即意味此處有一基因。（二）計算機的應(yīng)用用計算機預(yù)演系統(tǒng)GRAIL可從未知DNA中確認外顯子。（三）cDNA策略 分離出mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA片段，此為表達序列標簽（expressed sequence tag,EST),定位后構(gòu)成的圖稱轉(zhuǎn)錄圖(transcriptinal map,又稱表達圖expression map)（基因圖雛形）據(jù)此可估計基因組中基因數(shù)。人基因組中基因數(shù)：2-2.5萬。不同個體間基因編碼差異：0.01%一、人類基因組多樣性計劃（human genome diversity project，HGDP）人類基因數(shù)量約2-2.5

11、萬個人類基因組DNA含3109bp不同個體基因編碼僅有0.01%差異種族多樣性族群多樣性個體特異性人類基因組的多樣性與同一性二、功能基因組學(xué)功能基因組學(xué)（functional genomics）概念：研究基因組多樣性、表達調(diào)控、對蛋白質(zhì)表達和功能的研究、模式生物基因組的研究等。轉(zhuǎn)錄圖基因表達圖：三維轉(zhuǎn)錄圖。 不同時間不同基因不同表達水平不同發(fā)育期不同組織不同表達水平同一組織同一基因三、比較基因組學(xué)（comparative genomics）各種模式生物基因組序列的比較生物種類 基因組大小 預(yù)測基因組數(shù)目 基因平均長度 大腸桿菌4.6Mb 1800 約1kb 酵母 12Mb 5800 約2kb

12、秀麗線蟲 97Mb18500 約5.3kb 果蠅 116Mb 13600 約10kb 小鼠 3000Mb40000約30kb 人 3164Mb 2-2.5萬27kb 生物基因組進化的連續(xù)性分析 21%的基因原核生物和真核生物共有 32%的基因真核生物共有而原核生物沒有 24%的基因動物所共有 22%的基因脊椎動物特有四、環(huán)境基因組學(xué)（enviromental genomics）是研究與環(huán)境因素相關(guān)的疾病易感性基因的。環(huán)境相關(guān)的疾病易感基因基因多態(tài)性 分類 環(huán)境成份 相關(guān)疾病 CYP1A1 激活吸煙 肺癌GST 解毒 吸煙 肺癌NAT2 解毒吸煙 膀胱癌、乳腺癌 TCF2轉(zhuǎn)錄因子母親吸煙 唇裂、

13、腭裂ALAD 生物合成 鉛 鉛中毒 五、疾病基因組學(xué)（morbid genomics） 主要任務(wù)是分離重要疾病的致病基因與相關(guān)基因，并確定其致病機制。1.腫瘤癌基因和抑癌基因的定位與克隆；2.單基因病致病基因的定位與克隆；3.多基因病數(shù)量性狀基因座（QTL）的定位與克隆。七、生物信息學(xué)（bioinformatics） 是生物學(xué)與計算機科學(xué)和應(yīng)用數(shù)學(xué)交叉的一門新興學(xué)科，對生物學(xué)實驗數(shù)據(jù)的獲取、加工、存儲、檢索與分析，進而達到揭示數(shù)據(jù)所含的生物學(xué)意義有重要作用。 國際上三大公共基因數(shù)據(jù)庫： Gene Bank：美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI） EMBL：美國歐洲生物學(xué)信息研究所（EBI） DD

14、BL：日本信息生物學(xué)中心（CIB） 生物信息學(xué)已改變了基礎(chǔ)生命科學(xué)研究的運作方式，極大地提高了工作效率。一、基因定位工作歷史主要方法 連鎖分析（linkage analysis） 體細胞雜交（somatic cell hybridization） 原位雜交（hybridization in situ） 放射雜種（radiation hybrid） 計算機識別（computer identify）1連鎖分析 同一條染色體上的不同基因呈線性連鎖關(guān)系，在減數(shù)分裂后，結(jié)合家系分析，可鑒定子代中的重組體，通過重組值計算，可推斷待定位基因與已定位基因間的連鎖關(guān)系和遺傳距離，而實現(xiàn)基因定位。兩個基因如非連鎖

15、，則重組值=50%，即隨機組合。減數(shù)分裂產(chǎn)生配子發(fā)生交換AbaBAbaBABABabababaBABAb兩個基因如連鎖，則重組值50%，且重組值與遺傳距離成正比。 2.體細胞雜交 人/鼠融合細胞的特點： 融合細胞兼有有雙親細胞染色體，但鼠一方染色體一般全部保留，而人一方染色體在細胞增殖過程中優(yōu)先丟失，以至最后僅剩少數(shù)幾條，乃至1條人染色體是基因定位的好材料。結(jié)合染色體顯帶和生化分析技術(shù)，可把某些生化性狀決定基因定位在保留的一條染色體上。雜種細胞克隆嵌板雜種克隆 保留的人類染色體 12345678A+ B+ + C+ + + + 3.原位雜交 是核酸分子雜交技術(shù)在基因定位中的應(yīng)用。用經(jīng)放射性同位

16、素標記的探針，同染色體標本載玻片上原位變性的染色體DNA進行分子雜交，通過放射自顯影來檢測與探針雜交結(jié)合的染色體同源序列，依據(jù)放射性探針在染色體上的顯影位置進行基因定位。 熒光原位雜交（FISH）4.放射雜種 是用射線輻射人體細胞染色體，使其隨機片段化，再與鼠細胞融合，形成人/鼠細胞放射雜種，人的隨機染色體片段，整合入鼠細胞染色體中。構(gòu)建放射雜種細胞系克隆嵌板，可用于基因定位。二、基因克隆基因克隆的三種策略： 功能克?。╢unctional clonins） 定位克隆（positional clonins） 候選克?。╟ardidate clonins） 1.功能克隆根據(jù)目的遺傳性狀的特征，分

17、析決定基因的功能，推測有關(guān)蛋白質(zhì)。分析純化這一蛋白質(zhì)，并測出部分氨基酸順序。根據(jù)遺傳密碼推測可能的mRNA序列。設(shè)計相應(yīng)的寡核苷酸探針，雜交篩選cDNA或基因組DNA文庫，最終獲得決定基因的基因克隆。 2.定位克隆收集目的遺傳病的家系，選擇遺傳標記進行連鎖分析，建立目的遺傳病與基因組中某染色體區(qū)域中遺傳標記的連鎖關(guān)系。根據(jù)這一位置信息，將遺傳圖中初步確定的位置，轉(zhuǎn)變成物理圖中相應(yīng)區(qū)域的DNA“鄰接克隆群”。從相應(yīng)區(qū)域的“鄰接克隆群”中篩選可表達的結(jié)構(gòu)基因，作為候選基因；在若干個候選基因中進行轉(zhuǎn)錄表達和突變鑒定分析，最終將目的遺傳病的決定基因精確定位和分離克隆該基因。定位克隆(positional clo