1、溶瘤病毒載體制備及純化策略HIV 病毒）、腺病毒、腺病毒伴隨 EB病毒）、甲病毒等被成功地改造基因治療（ gene therapy ）是指將外源正常基因?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補償缺陷和異 常基因引起的疾病，以達到治療目的。也包括轉(zhuǎn)基因等方面的技術(shù)應(yīng)用。也就是將外 源基因通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將其插入病人的適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中，使外源基因制造的產(chǎn)物 能治療某種疾病。從廣義說，基因治療還可包括從 DNA 水平采取的治療某些疾病的措 施和新技術(shù)。 2017 年 10 月 19 日，美國政府批準(zhǔn)第二種基于改造患者自身免疫細(xì)胞的 療法（ yescarta 基因療法）治療特定淋巴癌患者。（選自搜狗百科） 近 20 年

2、來，只有少數(shù)幾種病毒如反轉(zhuǎn)錄病毒（包括 病毒、皰疹病毒（包括單純皰疹病毒、痘苗病毒及 成為基因轉(zhuǎn)移載體并開展了不同程度的應(yīng)用。逆轉(zhuǎn)錄病毒 (retrovirus vectors ， RVJ 載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)包括兩部分：一部分是用外源基因替換病毒結(jié)構(gòu)基因的 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體；另一部分是包裝細(xì)胞的基因組 DNA 中整合了逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)基因。 到目前為止， RV 載體是基因治療臨床試驗使用最多的載體，較常用的是基于moloney鼠白血病病毒 (MMLV)改造而來的各種 Rv 載體。 RV載體具有基因表達持久而穩(wěn)定、轉(zhuǎn) 染效率較高等優(yōu)點，但只能感染分裂期細(xì)胞，載體容量 8kb ，與宿主細(xì)胞

3、基因組的隨 機整合可引起基因突變及產(chǎn)生可復(fù)制的野生型病毒等危險故需要進一步的改造完善。腺病毒 (adenovirus ， AV) 載體腺病毒載體自 1993 年首次被應(yīng)用于臨床試驗以來，迄今為止大約有40 基因治療臨床試驗方案采用腺病毒為載體，僅次于 RV載體_3 J。至今 AV載體已經(jīng)發(fā)展了 4 代， 第 2、 3代腺病毒去除 EI、E2和 E4編碼序列，與第一代相比，有更低的免疫原性和更 大的載體容量。第四代腺病毒僅含有反向末端重復(fù)序列 (1TRs) 和包裝信號，載體容量 達 37kb ，進一步降低了免疫原性，被稱為 “高容量 ”載體。 AV 載體具有宿主范圍廣、基 因轉(zhuǎn)移效率高、對非分裂

4、細(xì)胞也有感染性、比較容易制備和操作、理化性質(zhì)穩(wěn)定、遺 傳毒性較低及比較安全等優(yōu)點。腺相關(guān)病毒 (adeno-associated virus ， AVV) 載體腺病毒相關(guān)病毒 (AAv) 是一種缺陷型的單鏈 DNA 病毒，只有在輔助病毒如腺病毒、單 純皰疹病毒、痘苗病毒等存在的情況下，才能進行最佳復(fù)制，產(chǎn)生新的病毒顆粒，否 則只能進行潛伏感染。從 v 載體既可以轉(zhuǎn)染分裂細(xì)胞又可以轉(zhuǎn)染非分裂細(xì)胞，在宿主 體內(nèi)以定向整合的方式存在， 70 以上的整合位點位于第 19 號染色體 q13 3-qter 區(qū)，且對人體無致病性，故 AAv 重組體在細(xì)胞內(nèi)能長期穩(wěn)定地表達，還可避免隨機整 合可能引起的抑癌基

5、因失活和原癌基因激活的危險，且在體內(nèi)不引起明顯的病理變化， 表明 AAV是一種很有前途的基因治療載體 _9j 。AAv 載體在多種組織已進行了成功的轉(zhuǎn) 染，如肝、腦、心肌、骨骼肌、視網(wǎng)膜和呼吸道上皮等組織，未發(fā)現(xiàn)對機體有致病性。慢病毒 (1eraivlrus) 載體慢病毒屬逆轉(zhuǎn)錄病毒科，為二倍體 RNA 病毒，分為靈長類病毒如人類免疫缺陷病毒一 1(HIV-1) 、猴免疫缺陷病毒 (SIV)和非靈長類病毒如馬傳染性貧血病毒 (EIAV) ，但它與 逆轉(zhuǎn)錄病毒不同，能感染非分裂細(xì)胞。單純皰疹病毒 (herpes si 衛(wèi)叩 Iex virus ， I-ISV) 載體單純皰疹病毒是一種雙鏈 DNA

6、 病毒，作為基因治療載體具有以下優(yōu)點： 容納外源基 因的長度達 4o50I ，是目前容量最大的病毒載體。 具嗜神經(jīng)性，可在神經(jīng)元中建 立終生潛伏性感染，非常適用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病如帕金森病、 Azheimer 病等。 滴度高 可感染分裂期和非分裂期細(xì)胞。基因治療病毒載量的制備將外源基因包裝到病毒殼粒中，是病毒載體生產(chǎn)的核心技術(shù)。一般地，病毒載體的制 備包括以下要素：宿主細(xì)胞雖然現(xiàn)在已有可能對有些病毒載體(如 AAV 載體)進行體外(無細(xì)胞)包裝( Zhou XH et al . 1998; Ding L et al. 1997 )，但是這種包裝系統(tǒng)仍然需要細(xì)胞提取物，并且 包裝效率相當(dāng)?shù)?，遠(yuǎn)遠(yuǎn)達不

7、到可生產(chǎn)水平。至今為止，病毒載體的包裝主要是在對該病毒敏感的宿主細(xì)胞中進行的。宿主細(xì)胞不 但提供了病毒復(fù)制和包裝的環(huán)境條件，許多細(xì)胞成分還直接參與了病毒復(fù)制和包裝的 過程。病毒復(fù)制和包裝所必需的順式作用元件和外源基因的表達盒 一般地，病毒復(fù)制和包裝 所必需的順式作用元件和外源基因的表達盒由細(xì)菌質(zhì)粒攜帶，組成病毒載體質(zhì)粒，是 被包裝的對象。由于病毒復(fù)制方式的不同，有些病毒載體如單純皰疹病毒擴增子 (HSV amplicon )載體在包裝時，整個載體質(zhì)粒都被包裝進入病毒顆粒中；而有些病 毒載體如反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒伴隨病毒載體的質(zhì)粒骨架部分并不被包裝到病毒顆粒中， 只有病毒復(fù)制和包裝所必需的順式作用

8、元件和外源基因表達盒被包裝到病毒顆粒中。構(gòu)建重組型病毒載體時，病毒復(fù)制和包裝所需的順式作用元件存在于病毒基因組中 (病毒基因組可以由具有感染性的病毒顆粒提供，也可以質(zhì)粒形式提供)。先將外源 基因表達盒插入穿梭質(zhì)粒攜帶的病毒同源序列中；將重組穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，再 用輔助病毒超感染；或?qū)⒅亟M穿梭質(zhì)粒與病毒基因組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞；重組質(zhì)粒與病 毒基因組在細(xì)胞中進行同源重組而產(chǎn)生表達外源基因的重組病毒。重組腺病毒 (Graham FL and Prevec L 1995 )和重組單純皰疹病毒( Pyles RB et al. 1997 ； Kramm CM et al. 1997 )的傳統(tǒng)制備方法都

9、是采用這種方式。 為了使病毒載體的生產(chǎn) 更為方便，病毒復(fù)制和包裝所必需的順式作用元件和外源基因的表達盒除了可以用質(zhì) 粒攜帶以外，也可以用另一種病毒(往往是輔助病毒)或生產(chǎn)細(xì)胞來攜帶。輔助元件包括病毒復(fù)制和包裝所必需的所有反式作用元件。這些元件一般包括病毒基因轉(zhuǎn)錄調(diào) 控基因、病毒 DNA 合成和包裝所需的各種酶類的基因、病毒的外殼蛋白基因等。輔助元件的表現(xiàn)形式可以多種多樣。常用的形式有：輔助質(zhì)粒( helper plasmid )，如用于產(chǎn)生重組腺病毒的質(zhì)粒 JM17 ，用于重組 AAV 包裝的輔助質(zhì)粒 pAAV/Ad (Rolling F and Samulski J 1995 )等；輔助病毒

10、( helper virus )，如用于 HSV 擴增子載體包裝的輔助病毒 HSV1 tsK 株；包裝細(xì)胞系如用于反轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝的PA317 細(xì)胞。這些表現(xiàn)形式之間可以相互轉(zhuǎn)化或合并。例如，輔助病毒可以轉(zhuǎn)化為輔助質(zhì)粒：傳統(tǒng) 的 AAV 載體生產(chǎn)系統(tǒng)常用腺病毒作為輔助病毒。研究發(fā)現(xiàn)，并非腺病毒的所有基因?qū)?AAV病毒的產(chǎn)生都是必需的，只需要腺病毒 E1a, E1b, E2a, E4 和 VA RNA 5 種基因就 行了。因此，將這 5 種基因置于同一個質(zhì)粒中，構(gòu)建成的這種新的輔助質(zhì)粒就完全可 以替代原來的輔助病毒( Xiao X et al. 1998; Grimm D et al. 199

11、8)，不但提高了包裝效率，而且避免了產(chǎn)品中腺病毒污染的問題。上述幾種要素的不同組合，便產(chǎn)生了各種各樣的病毒載體包裝策略。根據(jù)病毒載體生 產(chǎn)系統(tǒng)的組成因素的多少，可將其分成以下幾種：單組成因素生產(chǎn)系統(tǒng)( one-component system )：所有的組成成分都集中在生產(chǎn)細(xì)胞中。經(jīng)典的反轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)系統(tǒng)就是由產(chǎn)病毒細(xì)胞 (VPC)組成，重組反轉(zhuǎn)錄病毒由 VPC 細(xì)胞不斷分泌至培養(yǎng)上清中。這種生產(chǎn)系統(tǒng)操 作最為簡單，但是往往產(chǎn)量不高或不穩(wěn)定。采用這種策略，需要將重組病毒產(chǎn)生所需 要的所有元件都穩(wěn)定地置于生產(chǎn)細(xì)胞中。由于許多病毒基因產(chǎn)物本身對細(xì)胞有破壞作 用或不能在細(xì)胞中穩(wěn)定表達，因此這種策略在

12、許多病毒載體的生產(chǎn)中難以實施。雙組成因素生產(chǎn)系統(tǒng)( two-component system ) 這種生產(chǎn)系統(tǒng)一般由 一株病毒 /一株 細(xì)胞 組成。典型的例子是重組腺病毒生產(chǎn)系統(tǒng)。先用共轉(zhuǎn)染的方法獲得重組腺病毒毒 種，再由該毒種和生產(chǎn)細(xì)胞(如 293 細(xì)胞)組成一個雙組成因素的生產(chǎn)系統(tǒng)使病毒大 量擴增。 多組成因素生產(chǎn)系統(tǒng)( multi-component system ) 是由兩種以上的組成因 素組成的生產(chǎn)系統(tǒng)。傳統(tǒng)的 AAV 載體生產(chǎn)系統(tǒng)就是由載體質(zhì)粒，輔助質(zhì)粒，輔助病毒 和生產(chǎn)細(xì)胞 4 種因素組成。這種策略的缺點是影響因素多，操作復(fù)雜，產(chǎn)量不容易穩(wěn) 定，不利于大規(guī)模生產(chǎn)。以上各種生產(chǎn)系統(tǒng)

13、也可以相互轉(zhuǎn)化。我們實驗室通過將上述 AAV載體生產(chǎn)系統(tǒng)的 4 種 因素進行兩兩合并，即將輔助質(zhì)粒和輔助病毒合并成一種重組的輔助病毒，將載體質(zhì) 粒和生產(chǎn)細(xì)胞合并成 AAV 前病毒細(xì)胞株，成功地將其轉(zhuǎn)化成一種雙組成因素的新型高 效生產(chǎn)系統(tǒng)（伍志堅等， 1999 ）。一般來說，發(fā)展新的包裝策略主要是為了以下幾種目的：（ 1） 減少生產(chǎn)系統(tǒng)中的組成因素，簡化操作過程；（2）提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本；（3）避免或降低野生型病毒的產(chǎn)生；（4）避免使用難以與產(chǎn)品病毒分離的輔助病毒?；蛑委煵《据d體的純化每種病毒載體具有特定的特征，所以某些純化模式更易于發(fā)揮作用。為了純化腺病毒， 即 Ad5 ，可以使用上述所有的色譜方法。由于 Ad 病毒在