1、分子診斷技術的臨床應用詳解演示文稿第一頁，共二十八頁。（優(yōu)選）分子診斷技術的臨床應用第二頁，共二十八頁。根據(jù)分子診斷技術特征劃分為三類：一、基于分子雜交為基礎的分子診斷技術 兩條同源核酸分子（DNA或RNA）可以在堿基互補的原則下形成異質(zhì)雙鏈是遺傳物質(zhì)最重要的化學特征，這一過程亦被稱為分子雜交。分子雜交是所有分子生物學技術的基礎，從最初的印跡雜交到聚合酶鏈反應（PCR），從基因芯片再到高通量的DNA測序技術，都離不開堿基互補的分子雜交反應。第三頁，共二十八頁。二、基于測序技術為基礎的分子診斷技術 DNA的序列分析是分子診斷學的金標準，各種遺傳疾病，病毒或細菌的感染與變異，在基因表達水平上的個性

2、化用藥，多基因疾病的診斷與預測，最終都可以借助基因測序平臺的應用。第四頁，共二十八頁。三、基于擴增技術為基礎的分子診斷技術 1983年Mullis發(fā)明了聚合酶鏈反應（Polymerase chain reaction，PCR），使體外擴增DNA成為可能，開啟了體外擴增和操作DNA或RNA技術的發(fā)展。到現(xiàn)在，擴增DNA的技術已經(jīng)成為分子診斷應用最廣的技術之一，并發(fā)展變化了數(shù)十種核酸擴增檢測技術。第五頁，共二十八頁。二、PCR概述（一）PCR概念 PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶鏈反應，是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，通過變性

3、、退火、延伸等步驟，體外復制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程。是一項體外核酸擴增技術，能快速特異地在體外擴增任何目的DNA。第六頁，共二十八頁。 PCR技術能在一個試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時內(nèi)擴增至十萬乃至百萬倍，使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定。二、PCR概述第七頁，共二十八頁。九十年代中期PCR臨床應用在國內(nèi)全面展開1998年 熒光定量PCR技術開始在中國應用于臨床檢測PCR 發(fā)展簡史1983 Mullis于12月16日成功發(fā)明了PCR1985 關于PCR 的文章首次由 Mullis及其同事等

4、人 在Science雜志上發(fā)表1989 12月Science雜志將PCR和它所使用的Taq DNA聚合酶命名為第一個“年度分子”。1993 10月13日 Mullis獲諾貝爾化學獎 1995 熒光定量PCR技術出現(xiàn)第八頁，共二十八頁。PCR技術 PCR核心技術是從水棲高溫菌中分離到能耐高溫的Taq酶，使擴增反應不需要每一個循環(huán)加一次DNA聚合酶，從而實現(xiàn)了自動化，使應用領域迅速擴大，PCR技術成為了分子生物學中的一項突破性技術。第九頁，共二十八頁。PCR概述2000至2013年發(fā)表論文1280748篇第十頁，共二十八頁。二、PCR概述（二）原理雙鏈DNA 變性 退火 延伸 （膜板） （雙鏈分成

5、單鏈） （膜板與引物雜交） （DNA合成）不斷重復PCR循環(huán)次數(shù)與DNA產(chǎn)量關系第十一頁，共二十八頁。高靈敏度高特異性簡便快捷高效擴增、忠實復制！PCR反應的特點第十二頁，共二十八頁。三、熒光定量PCR技術的臨床應用病毒性肝炎（HBV、HBV-YMDD、HCV）的基因檢測性病相關病原體（CT、NG、UU、HPV、HIV）的基因檢測優(yōu)生優(yōu)育項目診斷：人巨細胞病毒（HCMV）、單純皰疹病毒（HSV）、弓形蟲（TOX）、風疹病毒（RUB）其它病原體檢測：結(jié)核桿菌、肺炎支原體、EB病毒、傷寒桿菌、幽門螺旋桿菌等一 病原體檢測第十三頁，共二十八頁。常規(guī)結(jié)核病實驗室診斷方法及不足1. 痰涂片作抗酸染色：陽

6、性率低 、費時2. 細胞培養(yǎng)“金標準”：周期太長(4-8W)3. 血清學診斷： a. 接種BCG可出現(xiàn)陽性 b. 不能區(qū)分活動性結(jié)核病和治愈后留下?lián)p傷灶的病人 c. 交叉反應，假陽性不能早期診斷！容易漏診、誤診！第十四頁，共二十八頁。熒光定量PCR檢測TB-DNA的意義1. 能穩(wěn)定檢測10copy的TB-DNA ，靈敏度高 ，特異性強2. 早期、快速、準確地診斷結(jié)核病。 痰液、肺及支氣管灌洗液肺結(jié)核 血液播散性結(jié)核和各臟器的結(jié)核病 腦脊液中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核病 宮頸拭子、尿道拭子泌尿生殖道結(jié)核病第十五頁，共二十八頁。3. 熒光定量PCR檢出結(jié)核桿菌陽性率顯著高于痰涂片抗酸染色和改良羅氏培養(yǎng)法。 4

7、. TB-DNA濃度可用于判斷療效： 痰標本中結(jié)核桿菌的數(shù)量呈逐漸下降趨勢 ，TB-DNA拷貝數(shù)下降。根據(jù)病原體DNA濃度，對藥物治療及療效觀察提供參考依據(jù) 熒光定量PCR檢測TB-DNA的意義第十六頁，共二十八頁。二 腫瘤相關基因表達的檢測：1、包括癌基因、抗癌基因2、腫瘤轉(zhuǎn)移基因3、轉(zhuǎn)移抑制基因三、熒光定量PCR技術的臨床應用第十七頁，共二十八頁。三 遺傳病1、等位基因檢測2、多基因遺傳病的突變檢測3、基因表達異常所致遺傳病檢測三、熒光定量PCR技術的臨床應用第十八頁，共二十八頁。四 其它應用1. 法醫(yī)學鑒定2. 抗病毒藥物療效的觀察、指導3. 縮短診斷的窗口期三、熒光定量PCR技術的臨床

8、應用第十九頁，共二十八頁。窗口期：所謂“窗口期”,是指從感染病原體開始,直至用某種檢測方法能夠檢測到該病原體存在為止的這一段時間。美國90以上輸血傳播HIV和HBV以及75以上輸血HCV的危險性均來自“窗口期”感染獻血。第二十頁，共二十八頁。提供直接證據(jù)縮短“窗口期”PCR檢測的臨床意義項目ELISA窗口期項目NAT窗口期HBsAg50HBV20-25抗-HCV70HCV10-14抗-HIV15HIV10第二十一頁，共二十八頁。RNA+ Ab-P24+ Ab -血清陽轉(zhuǎn)后的方法RNAp24Ab血清陽轉(zhuǎn)抗體檢測臨界值 特異性抗體比例時間反應指標感染 血清陽轉(zhuǎn)前的方法怎樣檢測HIV早期感染?第二十

9、二頁，共二十八頁。 嬰幼兒感染HIV診斷：12月內(nèi)核酸檢測，13-17月先抗體，陽性者檢測核酸，18個月以上抗體檢測第二十三頁，共二十八頁。四、PCR檢測的標本采集要求項目標本采集所需容器CT男性： 尿道分泌物：細小棉拭子伸入尿道約24厘米，旋轉(zhuǎn)數(shù)圈取出分泌物（應略帶粘膜），前列腺液、精液。女性： 陰道分泌物：用無菌生理鹽水洗去宮頸外分泌物，再用無菌棉拭子插入宮頸內(nèi)，停5秒后旋動棉拭子采取分泌物。尿道分泌物：同上一次性無菌帶蓋的試管。NGUUTPHPVHSV第二十四頁，共二十八頁。項目標本采集HBV無菌注射器抽取2毫升靜脈血或其它體液注入無菌試管或抗凝管。HCVEB1.鼻咽拭子或體液標本。 2

10、.也可取抗凝血標本,但一般不推薦。CMV1.尿液：中段晨尿20ml于加蓋試管。其他體液標本或咽拭子。也可取抗凝血標本,但一般不推薦。TB1.痰液：患者深部咳痰13ml于無菌加蓋試管。2.其他組織標本：留于無菌試管。3.也可取抗凝血標本,但需分離單個核細胞檢測，陽性率才會高。（于發(fā)熱時抽取）MP 咽拭子第二十五頁，共二十八頁。五、NAT（核酸檢測）技術類型：第二十六頁，共二十八頁。實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術（SAT）實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術（SAT）是將核酸恒溫擴增和實時熒光檢測相結(jié)合的一種新型核酸檢測技術。國內(nèi)公司（上海仁度生物科技有限公司）自主研發(fā)，擁有一整套自主知識產(chǎn)權和核心技術。第二十七頁，共二十八頁。（SAT）技術原理： 同一溫度下（42），以RNA為起始模板