1、乙型肝炎?。℉BV NA PCR ABI7300）檢側(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作程序飛 INFORMATIONFORTE檢測(cè)信息項(xiàng)目名稱(chēng)乙型肝炎病毒核酸方法聚合酶鏈反映方法依據(jù)項(xiàng)目名稱(chēng)乙型肝炎病毒核酸方法聚合酶鏈反映方法依據(jù)（2006）七篇第六章第一節(jié)聚臺(tái)酶鏈?zhǔn)椒从常≒CR可關(guān)于特定核苷酸片段進(jìn)行指數(shù)級(jí)的擴(kuò)增， 而實(shí)PCFPCF反映體系中加入熒光基團(tuán)，利 用熒光信號(hào)積淀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè) PCR進(jìn)程，最后經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)關(guān)于未知模 板進(jìn)行定量分PCR反映中，引入了一種熒 光化學(xué)物質(zhì)，熒光TaqMan熒光探針的檢PCRT增時(shí)，Taq 5 3外切酶活 性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基NA鏈，就有一個(gè)熒光分 子形成

2、，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加（圖一）。這樣就可以經(jīng)過(guò)熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)圖3- atwnch-ftr三、操作步驟（一）試劑配制1、進(jìn)入試劑準(zhǔn)備區(qū)，開(kāi)啟冰箱冷凍層取出HBV-NA僉測(cè)試劑盒。查看外包裝盒（囊括生產(chǎn)批號(hào)、有效期），無(wú)誤后拆開(kāi)試劑盒，取出核酸 提Taq（HBVPCTaq與試劑外包裝盒批號(hào)是否一致）（1）,不一致則不可使用， 需更換新的20min2000rpm離心備用。關(guān)于及關(guān)于及a有i取0.5ml離心管架置于超凈工作臺(tái)（開(kāi)機(jī)前用紫外線(xiàn)消毒30分鐘，用右手拿起鑷子逐個(gè)將離心管放入離心管架（注意應(yīng)夾住離 心管外壁，不能碰到管內(nèi)壁），擺放順序?yàn)闄M列從左往右擺

3、，豎列為 從上往下隔行排，離心管個(gè)數(shù)為二樣本+關(guān)于照+質(zhì)控品完成后將鑷子放回原（ 2）。從左往右找詩(shī)入朝詢(xún)用移液器準(zhǔn)確吸取核酸提取液 50ul0.5m1（左 上角3-4次（3）從左往右找詩(shī)入朝詢(xún)加完一架后用右手拿鑷子將離心管拿起，左手大拇指和中指夾 緊離心管下部，然后用食指將蓋子蓋上，順序?yàn)椋簭挠蚁陆堑谝粋€(gè)開(kāi) 始，從右住左依次蓋上（圖 4）區(qū)。3HBV-N反映液的配制每批需設(shè)置空白關(guān)于照、陰性關(guān)于照、臨界陽(yáng)性關(guān)于照（同時(shí)檢測(cè)低值 陽(yáng)性Sn=+陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品+配制如下表：試劑試劑HBV PC阪應(yīng)液Taq酶用量（ul ）35.70.3每盒HBV-NA32人份，根據(jù)每日需檢測(cè)標(biāo)本份數(shù)計(jì)算出HBVPCFT

4、aq酶用量（111310ulTaqHBV PCR 反映液中，另有111-3*32=15HBVPCFTaq例吸取至 1.5m1離心管中配制（5）。HBV PCRTaq酶，按上述要求配制 后用旋渦振蕩器振蕩混勻5-10sec2000rpm離心10sec（ 6）。HBV-HA（200u1槍 頭盒）至超凈工作臺(tái)內(nèi)，打開(kāi)配制盒并且用記號(hào)筆在相應(yīng)的孔位右旁按 順序編號(hào)（圖 7）（如有高值則標(biāo)為H,低值為陰性關(guān)于照品孔位編“-應(yīng)的孔位編“ B”，1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品關(guān)于應(yīng)的孔位編“S1” 2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品關(guān)于應(yīng)的孔位編“ S2”依此類(lèi)推編號(hào)完畢后，用右手拿起鑷子夾起反映管（ABI7300使用的是八 聯(lián)一薄壁反映管，鑷子應(yīng)夾

5、住反映管外壁，不可接觸到內(nèi)壁。按（圖 8）所方向依次將一切反映管（反映管數(shù)二n）隔列擺放到配置盒上。TaqPCF反映液，用移液器（量程調(diào) 至36ul），準(zhǔn)確吸取反映液并且按從上到下、從左至右的順序依次加至 反映管中，注意：吸頭應(yīng)深入到反映管底部，放液時(shí)應(yīng)緩慢，切勿形成氣泡（9）。全部加樣完畢后將配制盒經(jīng)過(guò)傳遞窗轉(zhuǎn)移至樣本處 理區(qū)。（二）標(biāo)本處理1、標(biāo)本、質(zhì)控品及關(guān)于照品的處理從冰箱冷凍室取出HBVNAK性質(zhì)控品陰性關(guān)于照品室溫平衡待其完全融化。核關(guān)于標(biāo)本和原始申請(qǐng)單的條形碼和試驗(yàn)項(xiàng)目，無(wú)誤后依次粘貼 上相應(yīng)的流水號(hào)，如AICON P 00012016-01-122、從傳遞窗中取出試劑準(zhǔn)備區(qū)分裝

6、好核酸提取液的離心管架，移至 生物全柜內(nèi)在管蓋上用記號(hào)筆寫(xiě)上阿拉伯?dāng)?shù)字12、3、，陽(yáng)性質(zhì)控管標(biāo)上“Q（如有高值則標(biāo)為H,低值為L(zhǎng)上“-”1,就表 示該管要加入P0001的標(biāo)本（10）。注意：每個(gè)離心管的編號(hào)方向都應(yīng)朝向管口開(kāi)啟的方向。（圖11）3、去除標(biāo)本管蓋：將標(biāo)本從前處理取至標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū)，按排列順序依次去除樣本管上的橡膠塞。具體操作為：在生物安全柜中，左手拿起 血清管并且固定，右手拇指和中指涅緊橡膠塞，右手食指輕輕頂住橡膠 塞頂部凹（注意：手指切勿接觸到血清管口或碰觸到血清，如手 套上有血清則需即時(shí)跟換新的手套；待一切樣本管蓋都去除完畢后，也需更換新的手套。）4、樣本及關(guān)于照品的處理:a20

7、0u150u1（3-5 次；吸樣時(shí)移液器套筒不可接觸到樣本管內(nèi)壁）（13）（切勿不可將樣本放回原 試管架位）（14）。再用左手按前面所述樣本流水號(hào)和離心管編號(hào)的關(guān)于應(yīng)關(guān)系拿起相 應(yīng)的離心管，打開(kāi)離心管蓋（注：?jiǎn)问植僮?，食指和中指固定離心管， 拇指稍向后上方發(fā)力打開(kāi)管蓋，手指切勿碰到離心管口和管蓋內(nèi)側(cè)）（圖 15）。管蓋完全打開(kāi)后，用左手食指、拇指和中指固定離心管，將吸頭中 的樣本全部打入離心管底部，輕輕吸打混勻3-5次。（圖16）加樣完畢后棄槍頭干盛有消毒液的垃極桶中（注：一個(gè)吸頭只能用 于一個(gè)樣本的吸樣，禁止使用一個(gè)吸頭反復(fù)吸取不同樣本）。同時(shí)蓋（位繼續(xù)處理下一個(gè)樣本。關(guān)于照品和質(zhì)控品同病人

8、樣本一樣處理。（圖 17）秒。10-15左手將混勻后的離心管轉(zhuǎn)移至恒溫金屬浴上（注：離心管需關(guān)于稱(chēng)的 放置在恒溫金屬浴相匹配的孔槽內(nèi)100C誤差不超過(guò)士1C10min（誤差不超過(guò)士 30sec）。（18）rr削熱扎叼離心件18汕迤圖詁個(gè)干浴時(shí)用離心管架置于加熱的離心管上，防止離心管蓋因加熱爆開(kāi)導(dǎo) 致標(biāo)本間的污染（19）。浴中拿出離心管（20）。I.要將離心管開(kāi)口朝內(nèi)，蓋上轉(zhuǎn)子蓋及離心機(jī)蓋后， 12,OOOrpm10min（注：離心時(shí)需在轉(zhuǎn)子孔內(nèi)放置 0.5m1離心管專(zhuān)用適配器（21）j.待離心結(jié)束后，取出離心管并且按編號(hào)順序依次擺放在離心管架上 （參照20C條 件 （10）20C條 件 12,OOOrpm 10mi n。5、待全部樣本加樣完畢更換手套，左手用鑷子夾起反映管蓋的一側(cè)的延伸段（不要碰到管蓋），然后用右手大拇指從左住右依次蓋緊管蓋 （不要碰到其他未蓋的反映管口 ）（如圖 22）。6、將反映