1、細菌光修復實驗的設(shè)計和改進摘要：目前關(guān)于DNA損傷和修復的實驗教學尚屬空白，學生在學習相關(guān)知識過程中難以深入 掌握知識點.設(shè)計切實可行的相關(guān)實驗教學方法，是生物化學實驗教學過程中一個迫切需要解決的 問題.該文設(shè)計了一種高效直觀的細菌光修復實驗.首先利用碘化鉀一碘酸鉀化學光強計方法測量 低壓汞燈紫外光強，并在紅色LED光源照明下對菌液進行紫外光照.紫外損傷后的菌液利用白色 LED光源進行光修復，然后對經(jīng)過紫外損傷和光修復后的菌液進行梯度稀釋，取稀釋的菌液進行點 板，隔日進行菌落計數(shù)并進行數(shù)據(jù)分析.實驗結(jié)果表明，細菌在經(jīng)過紫外損傷后菌落數(shù)逐漸減少，而 經(jīng)過光修復后菌落數(shù)逐漸恢復.該方法可以直觀地觀

2、察細菌的紫外損傷和光修復，并且實驗操作簡 便、成本低、效率高，具有較強的實用價值.關(guān)鍵詞：紫外損傷；光修復；實驗教學；點板法；菌落計數(shù)DNA是包括人體在內(nèi)絕大多數(shù)生物體的 遺傳物質(zhì)，其穩(wěn)定性是遺傳保守性的基礎(chǔ).然 而，多種因素可能導致DNA出現(xiàn)損傷，進而影 響遺傳信息的表達和傳遞，導致細胞生長停 滯、衰老、死亡，使機體引起炎癥、甚至腫瘤等 多種疾病.DNA損傷的修復，是生物體維持 DNA正常結(jié)構(gòu)，保持細胞正常功能，防止一系 列疾病發(fā)生的重要手段1-2.由于DNA修復的 重要性，該領(lǐng)域的研究日益受到人們的關(guān) 注.2015年，科學家托馬斯林達爾、保羅莫 德里克、阿齊茲桑賈爾被授予諾貝爾化學 獎，以

3、表彰他們在DNA修復方面的卓越研究 成果3-5.目前，在本科生物化學課程的理論 教學中，DNA的損傷和修復內(nèi)容已單獨列為 一個章節(jié)進行講解.然而，關(guān)于DNA損傷和 修復的實驗教學，目前尚屬于空白.這使得學 生在學習相關(guān)知識的過程中，出現(xiàn)理論和實 踐的脫節(jié)，難以深入掌握相關(guān)知識點.設(shè)計切 實可行的相關(guān)教學實驗，是生物化學教學中 亟待解決的課題.中短波紫外線（波長200 nm315 nm）可 導致DNA鏈上相鄰的嘧啶堿基發(fā)生共價交 聯(lián)，形成嘧啶二聚體損傷.很多生物體存在光 修復酶（photolyase），可吸收利用波長為315 nm 500 nm的長波紫外線和可見光的能量，直接 修復紫外線造成的嘧

4、啶二聚體損傷，此過程 稱為光修復，也是阿齊茲桑賈爾獲諾貝爾獎 的研究內(nèi)容之一.我們以光修復現(xiàn)象為出發(fā) 點，設(shè)計了細菌的光修復實驗，并對實驗進行 了合理改進，使實驗更加便捷、高效，以適合 本科實驗教學的需要.同時該實驗方法也適 用于光修復的相關(guān)科學研究.1材料與方法1.1器材超凈工作臺、培養(yǎng)箱、恒溫空氣搖床、臺 式離心機、高壓滅菌鍋、-80 t冰箱、分光光度 計、試管、培養(yǎng)皿、接種環(huán)、涂棒、酒精燈、計時 器、低壓汞燈（發(fā)射波長254 nm）、白色LED光 源、紅色LED光源（發(fā)射波長635 nm）、手術(shù)盤 蓋、遮光窗簾、微量移液器、紫外護目鏡、防護 手套.1.2菌株和試劑菌株為大腸桿菌DH5a，

5、為本實驗室保 存.LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨（10g/L）,酵母提取物 （5 g/L），NaCl（10g/L）；固體培養(yǎng)基加1%瓊脂 粉，滅菌后倒平板.生理鹽水：0.9% NaCl.化學 光強計母液 A 液：NazBO, - 10H2O 0.38g，KI 9.96 g，定容到 50 mL ；B 液：KIO3 2.14 g，定容 到 50 mL.1.3實驗操作（1）低壓汞燈紫外光強的測量.方法根據(jù) 文獻8改編.取化學光強計母液A液和B液 各2.5 mL混合，加入敞口的培養(yǎng)皿（直徑7 cm）， 置于低壓汞燈垂直下方50 cm處，用手術(shù)盤蓋 住.打開低壓汞燈預熱5 min，其間操作者戴 好紫外護目鏡和防護

6、手套.揭開手術(shù)盤，同時 計時光照.計時結(jié)束同時將手術(shù)盤蓋上，關(guān) 燈，取少量樣品稀釋10倍后檢測352 nm吸光 度變化.重復若干次，記錄光照時間和352 nm 吸光度，并作圖分析計算光強.（2）細菌培養(yǎng)和菌落計數(shù).取凍存保種菌 在LB固體培養(yǎng)基平板進行劃線培養(yǎng)，37 2培 養(yǎng)過夜，長出單菌落后，從平板上挑取一個單 菌落接于2 mL LB液體培養(yǎng)基的試管中，37 2 振蕩培養(yǎng)過夜.取培養(yǎng)好的菌液，用生理鹽水 稀釋100倍，然后以10倍梯度連續(xù)稀釋至10-7 倍.取不同稀釋梯度的菌液100 L分別在LB 固體培養(yǎng)基涂板，同時在LB固體培養(yǎng)基上按 照濃度梯度取5 L菌液點板，37 2避光培 養(yǎng)，隔日

7、對平板上菌落進行計數(shù).做三次平行 實驗.（3）細菌的紫外損傷和光修復實驗.將實 驗室的遮光窗簾拉上，創(chuàng)造一個暗環(huán)境，照明 采用紅色LED光源，防止不必要的光修復.取 100 L菌液置于剪下的滅菌EP管蓋中并將 其置于低壓汞燈垂直下方50 cm處，用手術(shù)盤 蓋住.打開低壓汞燈預熱5 min，其間操作者 戴好紫外護目鏡和防護手套.揭開手術(shù)盤同 時光照并計時，計時結(jié)束同時將手術(shù)盤蓋上， 關(guān)燈.將菌液用生理鹽水按不同濃度梯度稀 釋后分別涂板和點板培養(yǎng)，隔日對平板上菌 落進行計數(shù).將紫外照射的菌液在暗處孵育 10 min后放置于白色LED燈垂直下方10 cm 處，用手術(shù)盤蓋住.打開白色LED燈，揭開手

8、術(shù)盤，同時計時光照.計時結(jié)束同時將手術(shù)盤 蓋上，關(guān)燈.將菌液用生理鹽水按不同濃度梯 度稀釋后分別涂板和點板，37 t避光培養(yǎng)，隔 日對平板上菌落進行計數(shù).做三次平行實驗.將紫外照射后部分損傷的菌液放在暗處 孵育0 min、5 min、 10 min、 20 min、 40 min 后開 始白色LED光照并計時，取樣后用生理鹽水 按不同濃度梯度稀釋后點板37 t避光培養(yǎng)， 隔日對平板上菌落進行計數(shù).做三次平行實 驗，探究暗處孵育對紫外損傷后的菌液光修 復的影響.2結(jié)果2.1化學光強計測量紫外光強碘化鉀一碘酸鉀化學光強計的原理是碘 化鉀和碘酸鉀在光子的催化下，生成L，產(chǎn) 物在352 nm具有吸收峰

9、，消光系數(shù)為27 600 L/（mol-cm），量子產(chǎn)率為0.73.測量紫外吸收 光譜時取少量樣品稀釋10倍測量.根據(jù)測量 結(jié)果作圖分析，計算出紫外光強（圖1）.圖1碘化鉀-碘酸鉀化學光強計測量結(jié)果從圖1可以看出，取352 nm處的吸光度對 紫外光照時間作圖后，經(jīng)線性擬合RJ0.987， 斜率0.068 6，表明紫外光強約為2.11 W/m2.計算得到352 nm處I3的生成速率為0.119 6， 因此I3的摩爾數(shù)=0.005xA352 nm/27 600，其中 0.005是樣品體積（5 mL）除以1升（1 000 mL） 的體積的比值，27 600是摩爾消光系數(shù).通過 光強計算公式I = N

10、hv/St計算可得本次實驗的 光強=2.11 W/m2.其中：v表示光的頻率，S為照 射區(qū)域面積，N為時間間隔t內(nèi)照到S上的光 子總數(shù)，h是普朗克常數(shù).2.2細菌的菌落計數(shù)一一涂板法和點板法的 比較涂板法和點板法所得到的菌落數(shù)接近， 但點板法和涂板法相比較，所用的培養(yǎng)皿、實 驗耗材相對較少，所耗時間也比較少，細菌存 活率變化更加直觀，因此我們在后續(xù)的試驗 中均采用點板法進行.2.3細菌的紫外存活率和光修復效率的測定將紫外照射后的菌液梯度稀釋進行點板 培養(yǎng)，隔日進行菌落計數(shù).按照同樣的方法將 紫外照射后的菌液置于白色LED燈下進行光 修復.通過作圖測定出細菌的紫外存活率和 白光的修復效率.DH5

11、a紫外光照后的計數(shù)結(jié) 果及DH5a光修復后的計數(shù)結(jié)果分別如圖2 和圖3所示.（a）菌落照片（b）菌落數(shù)隨紫外劑量變化圖 圖2 DH5 a紫外光照后計數(shù)結(jié)果(a)菌落照片i/min(b)菌落數(shù)隨光修復時間變化圖 圖3 DH5a光修復后計數(shù)結(jié)果3討論與結(jié)論低壓汞燈又名紫外滅菌燈，其發(fā)射波長 為254 nm，正好位于DNA和蛋白質(zhì)吸收峰附 近，容易造成DNA等生物大分子損傷.低波長 紫外線可引起DNA同一條鏈上相鄰的嘧啶堿 基形成二聚體結(jié)構(gòu)(TT)，導致DNA的雙螺旋 結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使復制與轉(zhuǎn)錄過程受阻，從而 抑制細菌生長或殺死細菌9.在大腸桿菌 (DH5a)中存在一種DNA光修復酶(DNA pho

12、tolyase)， 能夠識別并結(jié)合損傷的嘧啶二聚體， 在可見光(400 nm)激發(fā)下，修復紫外造成的 DNA損傷市面的紫外光強計昂貴且準 確度低，不適用于本科實驗教學.在紫外損傷 細菌實驗中，我們采用了碘化鉀一碘酸鉀化 學光強計進行紫外光強的間接測量，科學合 理地測量出不同規(guī)格的低壓汞燈的紫外劑 量，與傳統(tǒng)的草酸鐵鉀光強計12相比，其在紫 外區(qū)準確度更高，且對可見光不敏感，學生能 夠高效簡便地重復實驗.為準確，但是存在可計數(shù)濃度范圍窄、計數(shù)準 確度低、涂布不均和計數(shù)工作量大等問題，容 易造成較大的實驗誤差.與涂板計數(shù)法13相 比，點板法具有所需樣品量少、點樣區(qū)域小， 檢測范圍廣，計數(shù)簡便等優(yōu)點

13、.這種方法不僅 可以直觀地反映不同濃度下菌落數(shù)的變化， 而且可以降低實驗成本，提高實驗效率.為了 讓學生更直觀地了解光修復的原理，采用點 板法設(shè)計細菌紫外損傷和光修復實驗更加合 理.在一定范圍內(nèi)，細菌經(jīng)過紫外損傷后菌落 數(shù)逐漸減少，光修復實驗后菌落數(shù)逐漸增加， 在同一塊培養(yǎng)皿上可以直觀地看出這種變 化.此外，在實驗過程中我們采用紅色LED光 源照明，波長(635 nm)較為單一，可以有效防 止照明光源對細菌的光修復.一定量的紫外線照射后的大腸桿菌黑暗 條件下被保存在緩沖液或鹽水中時，能夠在 復雜培養(yǎng)基上形成菌落的細胞數(shù)量逐漸增 加14-15，這被稱為液體復蘇持有(Liquid holding recovery， LHR).紫外照射后在黑暗處保存不 同的時間開始計時光照，取樣點板，結(jié)果顯 示，短暫的暗處孵育對細菌的光修復影