1、關(guān)于微生物學(xué)新技術(shù)在環(huán)境領(lǐng)域中的應(yīng)用第1頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)59分，星期三 固定化微生物，用制備固定化酶的方法將微生物固定在載體上，即成固定化微生物。 固定化細(xì)胞比游離細(xì)胞穩(wěn)定性高，催化效率比離體酶高，且比固定化酶操作簡(jiǎn)便，能完成多步酶反應(yīng)。第2頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)59分，星期三 二、酶的分離提純 利用微生物生產(chǎn)酶制品可以分為菌種選育、發(fā)酵培養(yǎng)、分離提取和酶制品保存四個(gè)步驟。 1純化： 鹽析法，絕大多數(shù)情況采用（NH4）2SO4。 有機(jī)溶劑沉淀法， 乙醇或丙酮 層析法，吸附層析法、離子交換層析法、分子篩過(guò)濾層析法、等電點(diǎn)沉淀法第3頁(yè)，共44頁(yè)，2

2、022年，5月20日，14點(diǎn)59分，星期三 三、固定化方法 固定化方法有載體結(jié)合法、交聯(lián)法、包埋法和逆膠束酶反應(yīng)系統(tǒng)。第4頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)59分，星期三第5頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)59分，星期三 1、載體結(jié)合法 將酶固定在非水溶性載體上。載體有葡聚糖、活性碳、膠原、瓊脂糖、多孔玻璃珠、高嶺土、硅膠、氧化鋁、羧甲基纖維素等。 2、交聯(lián)法 利用雙功能試劑或多功能試劑使酶與酶發(fā)生交聯(lián)而進(jìn)行固定。交聯(lián)劑有：戊二醛、雙重氮聯(lián)苯胺和六甲撐二異氰酸酯。第6頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)59分，星期三 3、包埋法 將酶包埋在凝膠格子（格子型）中，或

3、由半透性的聚合物膜組成的膠囊內(nèi)（微膠囊型）的方法。 格子型的包埋材料：聚丙烯酰胺（PACAM）凝膠、聚乙烯醇（PVA）、瓊脂、硅膠等。 微膠囊型的包埋材料：尼龍、乙基纖維素和硝酸纖維素 第7頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)59分，星期三 4、逆膠束酶反應(yīng)系統(tǒng) 表面活性劑的兩性分子在有機(jī)溶劑中自發(fā)形成聚集體，其親水一端連接成逆膠束的極性核，水分子插于核中，其疏水性的一端進(jìn)入主體有機(jī)溶劑中，酶分子溶于逆膠束中，組成逆膠束酶系統(tǒng)。 對(duì)微生物細(xì)胞的固定化最適合用凝膠包埋法。第8頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)59分，星期三四、固定化酶和固定化微生物在環(huán)境工程中的應(yīng)用 英國(guó)采用固

4、定化細(xì)胞反應(yīng)設(shè)備處理含氰廢水。 中國(guó)應(yīng)用固定化細(xì)胞技術(shù)降解含直鏈烷基苯磺酸鈉（LAS）廢水，去除率和酶活性保存率均在90%以上。 德國(guó)將9種降解對(duì)硫磷農(nóng)藥的酶共價(jià)固定在多孔玻璃珠、硅膠珠上，制成酶柱處理對(duì)硫磷廢水，獲得95%以上的去除效果。第9頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)59分，星期三 第二節(jié) 微生物絮凝劑 傳統(tǒng)的絮凝劑有無(wú)機(jī)和有機(jī)高分子兩類，第三類為微生物絮凝劑。加量為200mg/L 一、微生物絮凝劑的特點(diǎn) 1、來(lái)源廣泛，生產(chǎn)周期短且效率高。 2、具很高的絮凝效果，與聚鐵、聚丙烯酰胺等絮凝劑比，絮凝速度大，沉淀易過(guò)濾。 3、對(duì)人體和動(dòng)物無(wú)危害。 4、具可生化性，可防止絮凝后對(duì)

5、環(huán)境造成的二次污染。 5、能廣泛應(yīng)用于各種污水的處理。第10頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)59分，星期三 二、微生物絮凝劑的結(jié)構(gòu)組成、化學(xué)本質(zhì) 1、微生物絮凝劑的結(jié)構(gòu)組成 具有絮凝性的微生物涉及各類微生物，有細(xì)菌、放線菌、霉菌、酵母菌，原生動(dòng)物等（表11-1）。 微生物絮凝劑的組成和結(jié)構(gòu)見表11-2。 第11頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)59分，星期三第12頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)59分，星期三第13頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)59分，星期三 2、微生物絮凝劑的化學(xué)本質(zhì) 微生物所產(chǎn)生的絮凝劑主要是微生物代 謝過(guò)程中所產(chǎn)生的多聚糖類

6、，有些是蛋白質(zhì)（或多肽），或者是含有蛋白質(zhì)（或多肽）。第14頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)59分，星期三三、微生物絮凝劑的絮凝機(jī)理 “橋聯(lián)作用”機(jī)理：絮凝劑大分子借助離子鍵、氫鍵和范德華力，同時(shí)吸附多個(gè)膠體顆粒，在顆粒之間產(chǎn)生“架橋”，從而形成一種網(wǎng)狀的三維結(jié)構(gòu)而沉淀下來(lái)。 絮凝劑的分子結(jié)構(gòu)、形狀、相對(duì)分子質(zhì)量和所帶基團(tuán)會(huì)影響其絮凝效果。第15頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)59分，星期三 四、微生物絮凝劑的合成和應(yīng)用 1、微生物絮凝劑的合成 一般認(rèn)為，微生物多在其生長(zhǎng)的中后期釋放絮凝劑形成絮體，但到了靜止期后期，細(xì)胞不再產(chǎn)生新的絮凝物質(zhì)，甚至?xí)捎诔霈F(xiàn)解絮凝酶而導(dǎo)致

7、絮凝活性下降。 培養(yǎng)基的組成、初始pH、培養(yǎng)溫度、通氣狀況等會(huì)影響絮凝劑的合成。 提取方法：凝膠色譜，有機(jī)溶劑提取和堿提取。第16頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)59分，星期三2、微生物絮凝劑的應(yīng)用(1)高濃度有機(jī)水廢水的處理 NOC-1生物絮凝劑加Ca2+處理畜業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)生的廢水； C-62菌株產(chǎn)生的絮凝劑處理？革廢水。（2）染料廢水的脫色 用于造紙黑液、糖蜜廢水、墨水廢水的脫色。第17頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)59分，星期三 (3)乳化液油水分離 用廣泛產(chǎn)堿菌（Alcaligenens latus ）培養(yǎng)物易將棕櫚酸從其乳化液中分離出來(lái)。（4）活性污泥的處理 從

8、紅平紅球菌 （Rhodococcus erythropolis ）分離得到的絮凝劑可促進(jìn)污泥的沉降。第18頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)59分，星期三 第三節(jié) 分子生物技術(shù)在環(huán)境領(lǐng)域中的應(yīng)用 一、核酸探針和PCR技術(shù) 1、核酸探針 在適當(dāng)條件下，單鏈DNA片段能與另一段與之互補(bǔ)的單鏈片段結(jié)合，這個(gè)過(guò)程稱為核酸雜交。利用這一特性，將最初的DNA片段進(jìn)行標(biāo)記，即可做成核酸探針。 利用核酸探針技術(shù)可以檢測(cè)環(huán)境中是否存在某些特定種類的微生物，如致病菌和病毒。第19頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)59分，星期三 2、PCR技術(shù) PCR(Polymerase chain reac

9、tion)稱為DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是對(duì)特異性DNA片段在體外進(jìn)行擴(kuò)增的一種非?？焖俣?jiǎn)便的方法。 （1）PCR的原理：第20頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)59分，星期三第21頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)59分，星期三 （2） PCR技術(shù)的操作方法： 加熱變性 將待擴(kuò)增的DNA置于9495的高溫中加熱5min，使雙鏈DNA解鏈為單鏈DNA，分開的兩條單鏈DNA作為擴(kuò)增的模板。 退火 將加熱變性的單鏈DNA溶液的溫度緩慢下降至55 后，在這過(guò)程中引物的DNA的堿基將與單鏈模板DNA一端堿基配對(duì)。 第22頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)59分，星期三 延伸

10、 退火之后，當(dāng)溫度上升至72時(shí)，在耐熱性Taq DNA多聚酶、適當(dāng)?shù)腜H和一定的離子強(qiáng)度下，寡核苷酸引物（引物DNA）堿基延伸和模板DNA結(jié)合構(gòu)成雙鏈DNA。 經(jīng)過(guò)2530次循環(huán)，擴(kuò)增倍數(shù)達(dá)106，可將2kb 的DNA由原來(lái)的1pg擴(kuò)增到0.5 1g。第23頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)59分，星期三第24頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)59分，星期三（3）PCR技術(shù)的應(yīng)用應(yīng)用PCR技術(shù)研究特定環(huán)境中微生物區(qū)系的組成、結(jié)構(gòu)，分析種群動(dòng)態(tài)。應(yīng)用PCR技術(shù)監(jiān)測(cè)環(huán)境中特定的微生物。量化環(huán)境系統(tǒng)中微生物群體的各組成成員。 第25頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)59

11、分，星期三 二、16S rDNA序列及其同源性的分析 通過(guò)對(duì)16S rRNA基因的DNA序列分析，可以分析細(xì)菌的種類信息，并且已經(jīng)逐漸成為微生物分類和鑒定中非常重要而且有用的指標(biāo)和手段。 第26頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)59分，星期三 16s rRNA基因技術(shù)在環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用 鑒定生物降解菌； 研究某一特定環(huán)境中微生物的區(qū)系組成，進(jìn)而了解其種群動(dòng)態(tài)，研究微生物的多樣性。 PCR-DGGE或PCR-TGGE分析微生物的多樣性 第27頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)59分，星期三變性梯度凝膠電泳DGGE 1979年由Fisher和Lerman最先提出的用于檢測(cè)D

12、NA片段中的點(diǎn)突變的一種電泳技術(shù)。 Muyzer 等人在1993 年首次將其應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)研究 。后來(lái)又發(fā)展出其衍生技術(shù)，溫度梯度凝膠電泳（Temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）。第28頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)59分，星期三原理雙鏈DNA 分子在一般的聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)，其遷移行為決定于其分子大小和電荷。不同長(zhǎng)度的DNA 片段能夠被區(qū)分開，但同樣長(zhǎng)度的DNA 片段在膠中的遷移行為一樣，不能被區(qū)分。DGGE/TGGE 技術(shù)在一般的聚丙烯酰胺凝膠基礎(chǔ)上，加入了變性劑（尿素和甲酰胺）梯度或是溫度梯度，從而能夠把同樣長(zhǎng)度

13、但序列不同的DNA 片段區(qū)分開來(lái)。一個(gè)特定的DNA 片段有其特有的序列組成，其序列組成決定了其解鏈區(qū)域(melting domain, MD)和解鏈行為(melting behavior) 。一個(gè)幾百個(gè)堿基對(duì)的DNA 片段一般有幾個(gè)解鏈區(qū)域，每個(gè)解鏈區(qū)域有一段連續(xù)的堿基對(duì)組成。當(dāng)變性劑濃度逐漸增加各區(qū)域依次發(fā)生解鏈。第29頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)59分，星期三顯示的是一個(gè)234bp 長(zhǎng)的DNA 片段的解鏈區(qū)域，橫坐標(biāo)是該DNA 片段的序列，依次從第一個(gè)堿基到第234 個(gè)堿基；縱坐標(biāo)是解鏈溫度。該DNA 片段共有3 個(gè)解鏈區(qū)域。MD1 是解鏈溫度最低的一個(gè)解鏈區(qū)域，MD3 是

14、溫度最高的一個(gè)解鏈區(qū)域。第30頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)59分，星期三不同的雙鏈DNA 片段因?yàn)槠湫蛄薪M成不一樣，所以其解鏈區(qū)域及各解鏈區(qū)域的解鏈溫度也是不一樣的。當(dāng)它們進(jìn)行DGGE時(shí)，一開始變性劑濃度比較小，不能使雙鏈DNA 片段最低的解鏈區(qū)域解鏈，此時(shí)DNA 片段的遷移行為和在一般的聚丙烯酰胺凝膠中一樣。一旦DNA 片段遷移到一定位置，其變性劑濃度使雙鏈DNA 片段最低的解鏈區(qū)域解鏈，部分解鏈的DNA 片段在膠中的遷移速率會(huì)急劇降低。因此，不同的DNA 片段會(huì)在膠中的不同位置處發(fā)生部分解鏈導(dǎo)致遷移速率大大下降，從而在膠中被區(qū)分開來(lái)。第31頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20

15、日，14點(diǎn)59分，星期三然而，當(dāng)變性劑濃度達(dá)到DNA 片段最高的解鏈區(qū)域溫度時(shí)，DNA 片段會(huì)完全解鏈，此時(shí)它們又能在膠中繼續(xù)遷移，這些片段就不能被區(qū)分開來(lái)。在DNA 片段的一端加入一段富含GC 的DNA 片段（GC 夾子，一般30-50 個(gè)堿基對(duì)）可以解決這個(gè)問(wèn)題。含有GC 夾子的DNA 片段解鏈溫度很高，可以防止DNA 片段在DGGE 膠中完全解鏈。當(dāng)加了GC 夾子后，DNA 片段中每個(gè)堿基處的序列差異都能被區(qū)分開。第32頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)59分，星期三第33頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)59分，星期三當(dāng)用DGGE/TGGE 技術(shù)來(lái)研究微生物群落結(jié)構(gòu)

16、時(shí)，要結(jié)合PCR（polymerase chain reaction）擴(kuò)增技術(shù)，用PCR 擴(kuò)增的16S rDNA 產(chǎn)物來(lái)反映微生物群落結(jié)構(gòu)組成。通常根據(jù)16S rRNA 基因中比較保守的堿基序列設(shè)計(jì)通用引物，其中一個(gè)引物的5-端含有一段GC 夾子，用來(lái)擴(kuò)增微生物群落基因組總DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物用于DGGE/TGGE 分析。由于DGGE/TGGE一般只能分析500 bp 以下的DNA片斷，所以一般選擇擴(kuò)增16S rRNA基因的V3區(qū)或V6-V8區(qū)。第34頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)59分，星期三16S rDNA的高可變區(qū)E. coli 16S rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)及各可變區(qū) V3區(qū) 約1

17、70bp V6-V8區(qū) 約350bp 片段大小不同，攜帶的信息量不同，選擇不同的區(qū)域得到DGGE圖譜不同，群落信息也有差異 不同的片段大小對(duì)應(yīng)的膠濃度也不同根據(jù)需要選擇最合適的提取基因組后，擴(kuò)增16SrDNA高可變區(qū)片段第35頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)59分，星期三確定合適的變性劑范圍對(duì)DNA片段進(jìn)行有效分離根據(jù)變性劑梯度方向與電泳方向相同或不同,DGGE分為： 垂直DGGE 平行DGGE第36頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)59分，星期三常規(guī)的DGGE電泳技術(shù)對(duì)于長(zhǎng)度超過(guò)500bp的DNA片段的序列變化情況,只能有50%的檢出率。 應(yīng)用“GC夾板”技術(shù)可使檢出率

18、提高到100 %。 當(dāng)?shù)乳L(zhǎng)的雙鏈DNA分子在含梯度變性劑(尿素、甲酰胺)聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳時(shí),因其解鏈的速度和程度與其序列密切相關(guān);部分解鏈的DNA分子的遷移速度隨解鏈程度增大而減小。GC-Clamp16SrDNA低濃度高濃度第37頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)59分，星期三DGGE的參數(shù)： 膠濃度 取決于片段大小 ，通常不宜超過(guò)500bp 6%膠濃度： 400 1000bp 8%膠濃度： 200 400bp 10%膠濃度：100 300bp 變性劑范圍 不同的樣品不同 溫度 一般都用60攝氏度 電壓 時(shí)間第38頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)59分，星期三第39頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)59分，星期三環(huán)境樣品分析的流程第40頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)59分，星期三DGGE在微生物分子生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用 對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比、分析或者跟蹤監(jiān)測(cè)。 通過(guò)擴(kuò)增功能基因來(lái)研究功能基因及功能菌群的 多樣性。 跟蹤及檢測(cè)細(xì)菌的富集和分離，評(píng)價(jià)不同的培養(yǎng) 條件對(duì)分離菌種的影響。第41頁(yè)，共44頁(yè)，2022年，5月20日，14點(diǎn)59分，星期三舉