1、關(guān)于總提取及免疫組化第1頁，共49頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)43分，星期三一、真核細(xì)胞的總RNA 1、mRNA: 1-5% 2、tRNA: 10-15% 3、rRNA: 80-85% 大亞基60S: 28S=4718nt 5S=120nt 5.8S=160nt 小亞基40S: 18S=1874nt第2頁，共49頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)43分，星期三二、RNA提取的注意事項(xiàng) RNA酶：廣泛存在：灰塵、人體唾液、實(shí)驗(yàn)器材表面。 生物活性非常穩(wěn)定：耐熱、耐酸、耐堿。 1、 盡量避免外源性RNase 污染 A. 操作環(huán)境空氣潔凈。帶手套、口罩。 B. 用新開封的化學(xué)試劑。（試劑應(yīng)該專

2、用） C. 一次性塑料器材最好是新開封， (DEPC水處理后）高壓滅菌。 D. 玻璃器材、水都應(yīng)該經(jīng)過去RNase 處理。 對(duì)玻璃器材還應(yīng)該進(jìn)行高溫烘烤。 2、抑制內(nèi)源性RNase 活性： RNase 抑制劑。 RNA分離的關(guān)鍵因素：避免RNA酶的污染。第3頁，共49頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)43分，星期三1) 樣品處理： （）培養(yǎng)細(xì)胞：收獲細(xì)胞 1-510 7 ，移入 1.5ml 離心管中，加入 1ml Trizol ，混勻，室溫靜置 10min 。 （）組織：取 50-100mg 組織（新鮮或 -70 及液氮中保存的組織均可）置 1.5ml 離心管中，加入 1ml Trizol 充

3、分勻漿，室溫靜置10 min 。三、RNA提取的實(shí)驗(yàn)操作 第4頁，共49頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)43分，星期三2)加入200 l氯仿， 震蕩混勻20-30s，室溫放置5min（此期間液體開始分層，此時(shí)不要輕易攪動(dòng)液體）。3)10000 rpm，離心5min。RNA (清澈透明)DNAProtein4) 將清澈透明的上層水相 轉(zhuǎn)移至另一離心管中。三、RNA提取的實(shí)驗(yàn)操作 第5頁，共49頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)43分，星期三5) 沉淀RNA： 加入0.5ml異丙醇，上下顛倒混勻，室溫放置10min。 10000rpm，離心10min。棄上清。6) 加1ml 75%乙醇洗滌管壁。

4、 (注意貼管壁在沉淀的對(duì)側(cè)緩慢加入，不要攪動(dòng)沉淀)7) 7500rpm離心1min，棄上清。 再離心幾秒鐘，將管壁液體（用加樣器）完全移凈。用TriZol試劑提取總RNA時(shí)，全程均在室溫進(jìn)行。當(dāng)RNA沉淀用水溶解后，應(yīng)該注意在冰上操作，操作要迅速。第6頁，共49頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)43分，星期三8)室溫干燥35min。 （干燥的時(shí)間由RNA沉淀大小決定） （干燥后的沉淀應(yīng)該是無色膠樣透明狀，沉淀要充分干燥但避免過分干燥，此步驟非常關(guān)鍵）注意事項(xiàng)：RNA:避免放在37 C孵箱中過度干燥以防無法溶解。RNA沉淀必須絕對(duì)干燥，微量乙醇?xì)埩簦菀自斐蒖T的失敗，但過分干燥又是造成RNA不

5、溶解的主要原因 。判斷RNA沉淀是否充分干燥但又不是過分干燥是逆轉(zhuǎn)錄成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。RNA pellet：透明膠樣干燥后應(yīng)該無色透明第7頁，共49頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)43分，星期三9） RNA的溶解：用加樣器吸取冰冷DEPC-H2O 20-30l，加到RNA上，反復(fù)吹打溶解RNA沉淀。溶解的RNA應(yīng)置冰上保存。10) 吸出 2-3 l溶液放到冰上備用(將用于電泳)。11) 剩余溶液放到冰上備用 （將用于RTPCR）。注意： RNA沉淀的溶解一定要耐心充分，一定要用加樣器反復(fù)多次吹打方可。但由于溶液體積非常小，要避免出現(xiàn)氣泡影響RNA的溶解。避免氣泡的方法：用加樣器的第一擋每次吹打

6、都不要打出氣體判斷溶解程度：吹打時(shí)液體流動(dòng)不拐彎為止。第8頁，共49頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)43分，星期三 將 RNA 進(jìn)行 1% 瓊脂糖凝膠電泳 9 l RNA 樣品 23 l 上樣液輕輕混勻， 上樣 電泳: 120伏，1020分鐘 注意: 電泳槽的清潔及新的電泳液！ 瓊脂糖凝膠要新鮮配制！ 紫外透射儀觀察電泳結(jié)果第9頁，共49頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)43分，星期三RNA電泳結(jié)果 rRNA可以作為內(nèi)部Marker分子，通過觀察rRNA的兩條帶（28S和18S）的比例，可以判斷所提取mRNA是否存在降解。 RNA電泳并不能判斷mRNA是否提取成功，也不作為鑒定RNA提取質(zhì)量

7、的常規(guī)方法，因?yàn)樵陔娪具^程中RNA可能發(fā)生降解。第10頁，共49頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)43分，星期三RNA純度的判斷 280、230、260nm下的吸光度分別代表了核酸、鹽濃度和蛋白等有機(jī)物的值 A260/A280 1.82.0 1.8表明有蛋白質(zhì)、苯酚的污染 2.2表明RNA已經(jīng)水解成單核酸 A260/A230 2.0 2.0表明酚鹽離子，硫氰酸鹽或其他有機(jī)化合物污染第11頁，共49頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)43分，星期三免疫組化的原理及流程介紹2015-07-21第12頁，共49頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)43分，星期三主要內(nèi)容免疫組化原理及流程介紹一.免疫組化的

8、原理二.免疫組化的基本流程三.免疫組化的結(jié)果分析第13頁，共49頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)43分，星期三免疫組化的原理 應(yīng)用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，對(duì)組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原進(jìn)行原位定位、定性及定量檢測的技術(shù)。免疫組化原理及流程介紹第14頁，共49頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)43分，星期三直接法Tissue AntigenLabeled Antibody將熒光、酶直接標(biāo)記在一抗上優(yōu)點(diǎn)：簡單方便缺點(diǎn)：靈敏度低每種一抗都需要進(jìn)行標(biāo)記 免疫組化原理及流程介紹直接法第15頁，共49頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)43分，星期三間接法Tissue AntigenPrimary Antibo

9、dySecondary Antibody將熒光、酶等標(biāo)記在二抗上優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高只需要少數(shù)標(biāo)記的二抗可以和相應(yīng)的一抗反應(yīng) 免疫組化原理及流程介紹間接法第16頁，共49頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)43分，星期三免疫組化SP法SP法-鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶法 （streptavidin-peroxidase）一抗生物素標(biāo)記的二抗Streptavidin-HRP（HRP標(biāo)記的鏈霉親和素）簡化實(shí)驗(yàn)步驟減少非特異性背景免疫組化原理及流程介紹免疫組化SP法第17頁，共49頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)43分，星期三 ABC法 (Avidin Biotin-peroxidase Comple

10、x)一抗生物素標(biāo)記的二抗Avidin-Biotin-HRP Complex（親和素-HRP標(biāo)記的生物素）親和素與HRP標(biāo)記的生物素混合，放置30分鐘。一個(gè)親和素分子具有可與生物素結(jié)合的四個(gè)部位。大大增加了結(jié)合到生物素上的過氧化物酶，提高了顯色反應(yīng)的 靈敏度。免疫組化ABC法免疫組化原理及流程介紹免疫組化ABC法第18頁，共49頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)43分，星期三三 免疫組化的基本流程免疫組化原理及流程介紹1.脫蠟與水化2.細(xì)胞通透、封閉內(nèi)源性過氧化物酶 3.抗原修復(fù)、暴露抗原決定簇 4.封閉非特異性蛋白 5.一抗孵育 6.二抗孵育 7.SP 反應(yīng) 8.顯色 9.復(fù)染、脫水、透明、封

11、片 2.細(xì)胞通透、封閉內(nèi)源性過氧化物酶 第19頁，共49頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)43分，星期三免疫組化原理及流程介紹1.脫蠟與水化 脫蠟與水化的目的是確?？贵w等其他試劑能夠充分與組織中抗原等結(jié)合發(fā)生反應(yīng)。若脫蠟和水化不全易出現(xiàn)局灶性反應(yīng)和浸洗不全，而產(chǎn)生非特異性背景著色。第20頁，共49頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)43分，星期三60 20 minXylene：2 10 minutes； 100% absolute ethanol： 2 5 minutes；95% ethanol 2 minutes； 80% ethanol 2 minutes； 70% ethanol 2 mi

12、nutes；distilled water:5 min；PBS 洗 3 3 min。 具體操作第21頁，共49頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)43分，星期三免疫組化原理及流程介紹2.細(xì)胞通透與封閉內(nèi)源性過氧化酶 目的是使抗體能夠充分地進(jìn)入胞內(nèi)進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。一般用Triton X-100、蛋白酶k等通透液。(1)細(xì)胞通透第22頁，共49頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)43分，星期三免疫組化原理及流程介紹(2)封閉內(nèi)源性過氧化酶 其主要目的是降低內(nèi)源性過氧化物酶的活性。在傳統(tǒng)的ABC法和SP法中，免疫組化反應(yīng)結(jié)果容易受到內(nèi)源性過氧化物酶的干擾，必須用過氧化氫等進(jìn)行滅活。 第23頁，共49頁，2

13、022年，5月20日，16點(diǎn)43分，星期三1)用封閉通透液浸潤切片 30 min（RT 避光）。 其配法是用預(yù)熱 40 ml PBS 加120ul TritonX-100 加熱幾分鐘，在臨用前加 400 ul的30H2O2。2)PBS 溶液洗 3 次3 min。 免疫組化原理及流程介紹具體操作:第24頁，共49頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)43分，星期三免疫組化原理及流程介紹3. 抗原修復(fù) 暴露抗原決定簇 由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而失去抗原性；通過抗原修復(fù)，使得細(xì)胞內(nèi)抗原決定簇重新暴露，提高抗原檢測率。 第25頁，共49頁，202

14、2年，5月20日，16點(diǎn)43分，星期三免疫組化原理及流程介紹 常用的修復(fù)方法從強(qiáng)到弱一般分為三種，高壓修復(fù)、微波修復(fù)、胰酶修復(fù)。 抗原修復(fù)的主要方法:酶消化方法一般用于細(xì)胞內(nèi)抗原應(yīng)用高頻電磁波打開蛋白質(zhì)間的交聯(lián)鍵第26頁，共49頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)43分，星期三免疫組化原理及流程介紹將切片放入 0.01 M 檸檬酸鈉緩沖 溶液（pH6.0）后，在微波爐里高火 4 min 至沸騰后，取出，冷卻至室溫，再加熱，約4次，每次間隔補(bǔ)足液體，防止干片。2)PBS 溶液洗 3 次3 min。具體操作（微波修復(fù)）：1)第27頁，共49頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)43分，星期三免疫組化原理

15、及流程介紹4.封閉特異性蛋白組織切片上有些剩余的位點(diǎn)可以與一抗非特異性結(jié)合，造成后續(xù)結(jié)果的假陽性。封閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中有一些動(dòng)物自身的抗體，預(yù)先能和組織中有交叉反應(yīng)的位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合。 第28頁，共49頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)43分，星期三免疫組化原理及流程介紹 將切片取出,周圍水分用濾紙吸干,用組化筆在組織周圍畫上圈,在圓圈內(nèi)組織滴入 5%羊血清（與二抗來源一致）后放入濕盒中,室溫 (約30)下1030min。 具體操作：大一點(diǎn)第29頁，共49頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)43分，星期三免疫組化原理及流程介紹5.一抗孵育一抗:可以特異結(jié)合底物，就是識(shí)別出我們想要檢

16、測的東西。一抗和底物結(jié)合與否用肉眼是看不出來的。 第30頁，共49頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)43分，星期三 一抗孵育條件在免疫組化反應(yīng)中最重要，包括孵育時(shí)間和抗體濃度。 一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果最佳；孵育時(shí)間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37度1-2h，然后4度過夜和從冰箱拿出后37度復(fù)溫45min。具體條件還要摸索。 免疫組化原理及流程介紹1.防止脫片；2.使抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定。第31頁，共49頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)43分，星期三 甩去切片上的羊血清,用濾紙擦干組織周圍殘留血清，直接加入已稀釋的一抗（1：250、500、1000）后，放入濕盒中

17、室溫 1 小時(shí)，然后 4 度過夜，冰箱中取出后需37 復(fù)溫 45 min。 免疫組化原理及流程介紹具體做法：第32頁，共49頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)43分，星期三免疫組化原理及流程介紹6.二抗孵育二抗:可以和一抗結(jié)合，并帶有可以被檢測出的標(biāo)記(如帶熒光、放射性、化學(xué)發(fā)光或顯色基團(tuán)），作用是檢測一抗。第33頁，共49頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)43分，星期三 二抗孵育條件：二抗一般室溫或37度30min-1h，具體時(shí)間需要摸索。 但在免疫組化中我們一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間先定下，然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間。 免疫組化原理及流程介紹第34頁，共49頁，2022年，5月20日，1

18、6點(diǎn)43分，星期三 1)將一抗倒掉并用 PBS 洗 5 min5 次； 2)用濾紙將圓圈周圍的水吸去，加入已稀釋的二抗后放入 37恒溫烤箱中 30 min。 3)用 PBS 洗 5 次5 min 免疫組化原理及流程介紹具體操作：第35頁，共49頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)43分，星期三7.SP反應(yīng) SP染色法即鏈霉素抗生物素蛋白 生物素過氧化酶連接法。 該法是ABC法基礎(chǔ)上的進(jìn)一步改良，使卵白素與鏈霉（而非生物素）結(jié)合，而后再結(jié)合PO基。第36頁，共49頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)43分，星期三 免疫組化原理及流程介紹1） 加入 SP 復(fù)合液后放入 37 度烤箱中 30 min。

19、2） 用 PBS 洗 5 次5 min。具體操作：SP染色法的特點(diǎn): 靈敏特異性低，成本低。第37頁，共49頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)43分，星期三免疫組化原理及流程介紹8.顯色 在免疫組化中，由于抗原抗體所形成的復(fù)合物本身沒有顏色，不能直接觀察，只能借助于其他某些化學(xué)基團(tuán)的顯色作用，是復(fù)合物顯色，有利于顯微鏡下觀察。第38頁，共49頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)43分，星期三免疫組化原理及流程介紹 通常在過氧化物酶（HRP）法中，顯色劑為DAB。DAB(3,3-二氨基聯(lián)苯胺顯色液)配法:DAB 50mg 0.05M TB 100ml 30%H2O2 30-40ulABC 法SP法

20、PAP法第39頁，共49頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)43分，星期三免疫組化原理及流程介紹9、復(fù)染、脫水、透明、封片 復(fù)染：目的是形成細(xì)胞輪廓，從而更好地對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行定位，經(jīng)常用的試劑為蘇木素。 片子復(fù)染完后流水振洗，然后置于鹽酸酒精中數(shù)秒（一定動(dòng)作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返藍(lán)即可。第40頁，共49頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)43分，星期三1) 用 PBS 3 次3min 后，用雙蒸水洗 5 min；加一大滴蘇木素染液，（胞核蛋白染幾秒，胞漿或胞膜蛋白染 20 s ），自來水沖洗，雙蒸水洗 5 min，再用 PBS 返藍(lán) 5 min。 2) 脫水：50% ethanol

21、(1-2) min;70% ethanol (1-2) min ;95% ethanol （1-2） min； 95% ethanol （1-2） min； 100% absolute ethanol: (1-2) min； 100% absolute ethanol: (1-2) min。3) 透明：Xylene 1(1-2) minXylene 2(1-2) min 4) 封片：中性樹膠。 免疫組化原理及流程介紹第41頁，共49頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)43分，星期三免疫組化原理及流程介紹四 免疫組化結(jié)果分析免疫組化結(jié)果的判斷原則：1.必須設(shè)對(duì)照。2.抗原表達(dá)必須在特定部位。3.陰性結(jié)果不能視為抗原不表達(dá)。第42頁，共49頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)43分，星期三免疫組化原理及流程介紹1陽性染色特點(diǎn) Ag定位，胞漿、胞核、胞膜、間質(zhì)具有結(jié)構(gòu)性。（非特異性染色 細(xì)胞與組織無區(qū)別） 染色強(qiáng)度不同：顏色深淺不一（非特異性染色 彌散性均勻）。須從以下幾個(gè)方面綜合評(píng)價(jià)：第43頁，共49頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)43分，星期三 2組織切片制作過程的影響 固定不良非