第2章微生物發(fā)酵制藥工藝1本章內(nèi)容2.1微生物發(fā)酵與制藥2.2制藥微生物生長與生產(chǎn)關(guān)系2.3制藥微生物菌種的建立2.4培養(yǎng)基制備2.5滅菌工藝2.6微生物發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)2.7發(fā)酵工藝過程的控制2.8抗生素生產(chǎn)工藝2.9氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)工藝2.10維生素生產(chǎn)工藝22.1微生物發(fā)酵與制藥3一發(fā)酵概念發(fā)酵概念：通過微生物培養(yǎng)而獲得產(chǎn)物的過程。發(fā)酵種類：用產(chǎn)品說明，冠以產(chǎn)物名而成，如青霉素發(fā)酵，維生素發(fā)酵；發(fā)酵工程按需氧分為好氧發(fā)酵和厭氧發(fā)酵。初級代謝產(chǎn)物：在初級代謝過程中形成的產(chǎn)物，包括各種小分子前體、單體和多糖、蛋白質(zhì)、脂肪、核酸等。生長所必須的。幾乎所有生物初級代謝基本相同。氨基酸，核苷酸，有機酸。次級代謝產(chǎn)物：比較復(fù)雜的化合物，不是細胞生長必需的，對生命活動有意義（抗逆境條件）?？股兀舅?，色素。4發(fā)酵制藥種類微生物菌體發(fā)酵微生物菌體發(fā)酵是以獲得微生物菌體為目的，如：面包的酵母發(fā)酵、單細胞蛋白發(fā)酵（利用各種碳源）、真菌類（各種蘑菇、冬蟲夏草）、生物防治劑（蘇云金桿菌，伴孢晶體可以毒殺鱗翅目、雙翅目害蟲）。微生物酶發(fā)酵微生物酶發(fā)酵是以獲得酶為目的的發(fā)酵，如青霉素酰化酶，用于半合成青霉素時，制備中間體6－氨基青霉烷酸。微生物代謝產(chǎn)物發(fā)酵初級代謝產(chǎn)物：氨基酸，核苷酸，維生素，有機酸。次級代謝產(chǎn)物：最主要的是抗生素。微生物轉(zhuǎn)化發(fā)酵利用微生物的一種或多種酶把一種化合物轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)構(gòu)相關(guān)的更有價值的產(chǎn)物的生化反應(yīng)為轉(zhuǎn)化發(fā)酵。5制藥微生物的種類生產(chǎn)藥物的天然微生物主要包括細菌、放線菌和絲狀真菌三大類。細菌主要生產(chǎn)環(huán)狀或鏈狀多肽類抗生素，如芽孢桿菌(Bacillus)產(chǎn)生桿菌肽（bacitracin），多黏芽孢桿菌（Bacilluspolymyxa）產(chǎn)生黏菌肽（colistin）和多黏菌素（polymyxin）。細菌還可以產(chǎn)生氨基酸和維生素，如黃色短桿菌（Brevibacterium

flarum）產(chǎn)生谷氨酸，大小菌生產(chǎn)維生素C。放線菌主要產(chǎn)生各類抗生素，以鏈霉菌屬最多，諾卡菌屬較少，還有小單孢菌屬。生產(chǎn)的抗生素主要有氨基糖苷類（鏈霉素、新霉素、卡那霉素等）、四環(huán)類（四環(huán)素、金霉素、土霉素等）、放線菌素類（放線菌素D）大環(huán)內(nèi)酯類（紅霉素、螺旋霉素、柱晶白霉素）和多烯大環(huán)內(nèi)酯類（制霉菌素、抗滴蟲霉素等）。酸性、堿性和中性，但以堿性為多。真菌的曲菌屬產(chǎn)生桔霉素，青霉素菌屬產(chǎn)生青霉素和灰黃霉素等，頭孢菌屬產(chǎn)生頭孢霉素等。脂環(huán)芳香類或簡單的氧雜環(huán)類，多為酸性化合物。6發(fā)酵制藥的基本過程菌種選育發(fā)酵工段提煉工段成品工段孢子制備種子制備發(fā)酵控制預(yù)處理分離提取濃縮純化成品工段包裝原料藥實驗室、種子庫發(fā)酵車間提煉車間包裝車間72.3制藥微生物菌種的建立8新藥生產(chǎn)菌的選育自然分離自然選育誘變育種雜交育種基因工程技術(shù)育種基因組shuffling技術(shù)92.8抗生素生產(chǎn)工藝以青霉素為例10一概述－發(fā)現(xiàn)1929:Fleming在葡萄球菌培養(yǎng)皿中，污染的霉菌周圍出現(xiàn)透明的抑菌圈。殺菌物質(zhì)，斷言太不穩(wěn)定，無法分離并用作藥物。1939：牛津病理家HowardFlorey化學(xué)家ErnstChain,Norman

Heatley。發(fā)酵瓶培養(yǎng)霉菌，培養(yǎng)里提取，測活性，青霉素結(jié)晶。11發(fā)展1940：8只鼠注射鏈球菌，提取物對4只治療。未經(jīng)治療鼠在24小時內(nèi)死亡，治療鼠存活數(shù)天至數(shù)周。1941年2月開始治療第一批人類病人。1943：威斯康辛大學(xué)小組，取得突破生產(chǎn)菌表面培養(yǎng)：幾十個單位。深層培養(yǎng)產(chǎn)黃青霉：100U/ml。X、UV誘變育種：1000－1500U/ml。不產(chǎn)色素變種：66000－70000U/ml目前：85000U/ml。12概述－作用機理細胞壁合成中的肽多糖合成的第三階段肽多糖的D-丙氨酰-D-丙氨酸二肽類似物競爭性與轉(zhuǎn)肽酶結(jié)合，使轉(zhuǎn)肽酶不能催化多肽鏈之間的交聯(lián)。生長中的細胞有效，靜止細胞無效高效、安全的抗細菌感染藥物13概述－應(yīng)用臨床抗感染治療：大多數(shù)革蘭氏陽性菌和某些革蘭氏陰性細菌及螺旋體等。毒性小，但需要皮試。各種半合成抗生素的原料：氨芐青霉素，磺芐青霉素，乙氧萘青霉素頭孢菌素母核。14二青霉素生產(chǎn)菌的生物學(xué)特性產(chǎn)黃青霉：Penicillium

chrosogenum孢子:綠色和黃色菌落：平坦或皺褶，圓形。青霉穗:分生孢子鏈狀深層培養(yǎng)菌絲：球狀和絲狀兩種。15發(fā)酵條件下的生長過程第1期：分生孢子萌發(fā)，形成芽管，原生質(zhì)未分化，具有小泡。第2期：菌絲繁殖，原生質(zhì)體具有嗜堿性，類脂肪小顆粒。第3期：形成脂肪包涵體，機理貯藏物，沒有空泡，嗜堿性很強。第4期：脂肪包涵體形成小滴并減少，中小空泡，原生質(zhì)體嗜堿性減弱，開始產(chǎn)生抗生素。第5期：形成大空泡，有中性染色大顆粒，菌絲呈桶狀，脂肪包涵體消失，青霉素產(chǎn)量最高。第6期：出現(xiàn)個別自溶細胞，細胞內(nèi)無顆粒，仍然桶狀。釋放游離氨，pH上升。第7期：菌絲完全自溶，僅有空細胞壁。16鏡檢規(guī)定時間取樣，顯微鏡觀察7個時期的形態(tài)變化，控制發(fā)酵。1－4期為菌絲生長期，3期的菌體適宜為種子。4－5期為生產(chǎn)期，生產(chǎn)能力最強，通過工程措施，延長此期，獲得高產(chǎn)。在第六期到來之前結(jié)束發(fā)酵。17三發(fā)酵工藝過程181生產(chǎn)孢子制備工斜面種子：砂土孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨組成的固體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。米孢子：移植到小米或大米固體培養(yǎng)基上，生長7天，25℃。注意：每批孢子必需進行嚴格搖瓶試驗，測定效價及雜菌情況。192種子罐培養(yǎng)工藝一級種子發(fā)酵：發(fā)芽罐，孢子萌發(fā)，形成菌絲。培養(yǎng)基：葡萄糖，玉米漿，碳酸鈣，玉米油，消沫劑等?？諝饬髁?：3（體積比）；300-350rpm；pH自然，溫度27±1℃,40h二級種子罐：繁殖罐，大量繁殖。接種量10％培養(yǎng)基：葡萄糖、玉米漿，玉米油，消沫劑等。1:1-1.5；250-280rpm；pH自然，25±1℃。10-14h質(zhì)量：菌絲致密，菌絲粗壯，III期，倍增期6-8h203生產(chǎn)罐培養(yǎng)工藝三級罐：生產(chǎn)罐；接種量20％。培養(yǎng)基：花生餅粉，葡萄糖，尿素，硝酸銨，硫代硫酸鈉，苯乙酰胺，CaCO3,玉米油,硅油。參數(shù)條件：通氣量1：0.8-1.2；150-200r/min；前60小時:pH6.4-6.6，26℃；60小時后:pH6.7,24℃。214發(fā)酵培養(yǎng)與過程控制操作方式：反復(fù)分批式發(fā)酵。發(fā)酵罐：100M3，裝料80M3。帶放:6-10次，帶放量10％，間隔24h。發(fā)酵周期：180-220h。22（1）過程控制——補料分批操作控制基質(zhì)濃度前40小時：培養(yǎng)基中的主要營養(yǎng)物40小時后：低速連續(xù)補加葡萄糖、氮源和苯乙酸等，維持一定的最適濃度。半饑餓狀態(tài)：延長合成期，提高產(chǎn)量。碳源占成本12％以上，采用糖化液流加,降低成本。糖與6APA結(jié)合形成糖基-6APA，影響青霉素產(chǎn)量。23流加碳源控制根據(jù)殘?zhí)?、pH、尾氣中CO2和O2含量。葡萄糖的波動范圍較窄，濃度過低使抗生素合成速度減慢或停止，過高則導(dǎo)致呼吸活性下降，甚至引起自溶。殘?zhí)?.3-0.6％左右，pH開始升高時流加糖。濃度：500kg/m3，流速:1.0-2.5kg/m3·h。24流加氮源控制玉米漿:最好，含有多種氨基酸及其前體苯乙酸和衍生物。補加無機氮源：硫酸銨、氨水、尿素。氨基氮濃度：0.01-0.05%。25鹽離子控制無機鹽：硫、磷、鎂、鉀等。鐵對青霉素合成有毒，30-40ug/ml以下。罐壁涂環(huán)氧樹脂保護層。26（2）添加青霉素側(cè)鏈前體時期：合成階段。種類：苯乙酸及其衍生物，苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸。毒性：抑制細胞生長和青霉素合成。策略：低濃度流加。濃度：苯乙酸0.1%，苯乙酰胺0.05-0.08%?？刂疲罕３止?yīng)速率略大于生物合成需要。27提高產(chǎn)量的其他物質(zhì)流加表面活性劑：新潔爾滅、聚氧乙烯、山梨糖醇酐、單油酸酯、單月桂酸酯、三油酸酯可溶性高分子化合物：聚乙烯醇、聚丙烯酸鈉、聚乙二胺、聚乙烯吡咯烷醇其他：剪切保護劑；分散劑28（3）溫度控制適宜菌絲生長溫度30℃，分泌青霉素20℃。20℃青霉素破壞少，周期很長。變溫控制，不同階段不同溫度。生長階段:較高溫度，縮短生長時間；生產(chǎn)階段適當(dāng)降低溫度，以利于青霉素合成。前期控制26℃左右，后期降溫控制24℃。29（4）pH控制合成適宜pH6.4－6.6左右，避免超過7.0直接加酸或堿：自動控制流加葡萄糖：恒速；變速，依賴pH變化快慢。pH下降：補加CaCO3、通氨、尿素或提高通氣量pH上升：補加糖、生理酸性物質(zhì)（硫酸銨、油脂）30（5）溶氧控制＜30％飽和度，產(chǎn)率急劇下降；＜10％，造成不可逆的損害。臨界溶氧濃度：30％。通氣比：1：0.8－1.5。適宜的攪拌速度:保證氣液混合，提高溶氧。調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速:各階段的生長和耗氧量不同。31（6）消沫天然油脂：玉米油；化學(xué)消沫劑：泡敵。策略：少量多次。注意：前期不宜多加入，影響呼吸代謝。32四提煉工藝過程青霉素不穩(wěn)定，遇酸、堿、熱分解失活水溶液中不穩(wěn)定，非極性溶劑中穩(wěn)定易溶于有機溶劑，水中溶解度很小青霉素鹽很穩(wěn)定；降解產(chǎn)物具有致敏性防止降解，條件溫和、快速。331預(yù)處理青霉素的存在部位：發(fā)酵液。濃度較低：10－30kg/m3。含有大量雜質(zhì)：菌體細胞、核酸、雜蛋白質(zhì)、細胞壁多糖等、殘留的培養(yǎng)基、色素、鹽離子、代謝產(chǎn)物等。目的：濃縮目的產(chǎn)物，去除大部分雜質(zhì)，改變發(fā)酵液的流變學(xué)特征，利于后續(xù)的分離純化過程。預(yù)處理:發(fā)酵液加少量絮凝劑沉淀蛋白。342過濾鼓式真空過濾機過濾：一次濾液：pH6.2-7.2，略渾，棕黃或綠色，蛋白質(zhì)含量0.5-2.0%。板框式過濾機過濾：硫酸調(diào)節(jié)pH4.5-5.0，加入0.07%溴代十五烷吡啶，0.07%硅藻土為助慮劑。二次濾液：澄清透明，用于提?。ㄊ章?0％）353、溶劑萃取原理：青霉素游離酸易溶于有機溶劑，而霉素鹽易溶于水。萃取劑：青霉素分配系數(shù)高的有機溶劑。工業(yè)上通常用：醋酸丁酯和醋酸戊酯。除去蛋白質(zhì)：加0.05-0.1%乳化劑PPB。萃取：2－3次。36逆流萃取過程正相萃取：酸化pH1.8-2.0，濾液：醋酸丁酯＝1：0.3，碟片式離心機分離（濃縮1.5-2.1）反相萃?。簆H6.8-7.4（磷酸鹽、碳酸鹽緩沖液）。把青霉素從丁酯中提取到緩沖液中。反復(fù)萃取2－3次，達到結(jié)晶要求。萃取條件：10℃下。萃取罐冷凍鹽水冷卻。374脫色萃取液中添加活性炭，除去色素。過濾，除去活性炭。385結(jié)晶——直接結(jié)晶加醋酸鈉－乙醇溶液反應(yīng)：得到結(jié)晶鈉鹽。加醋酸鉀－乙醇溶液：得到青霉素鉀鹽。395結(jié)晶——共沸蒸餾結(jié)晶萃取液，再用0.5MNaOH萃取pH6.4-6.8下得到鈉鹽水濃縮液。加3-4倍體積丁醇，16-26℃，真空0.67-1.3KPa）下蒸餾。水和丁醇形成共沸物而蒸出。鈉鹽結(jié)晶析出。結(jié)晶經(jīng)過洗滌、干燥（60℃真空16h），磨粉，裝桶，得到青霉素產(chǎn)品。402.9氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)工藝41一氨基酸類藥物得基本概念α氨基酸42氨基酸及其衍生物在醫(yī)藥中的應(yīng)用氨基酸的營養(yǎng)價值及其與疾病治療的關(guān)系必需氨基酸—人和哺乳動物自身不能合成，需要由食物供應(yīng)，稱為必需氨基酸。賴氨酸，色氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，蘇氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸等8種。治療消化道疾病的氨基酸及其衍生物谷氨酸及其鹽酸鹽，谷氨酰胺，乙酰谷酰胺鋁，甘氨酸及其鋁鹽，硫酸甘氨酸鐵，維生素U及組氨酸鹽酸鹽等。治療肝病的氨基酸及其衍生物精氨酸鹽酸鹽，磷葡精氨酸，鳥天氨酸，谷氨酸鈉，蛋氨酸，乙酰蛋氨酸，瓜氨酸，賴氨酸鹽酸鹽，及天冬氨酸等。43治療腦及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的氨基酸及其衍生物谷氨酸鈣鹽及鎂鹽，氫溴酸谷氨酸，色氨酸，5－羥色氨酸、左旋多巴等。用于腫瘤治療的氨基酸及其衍生物偶氮絲氨酸，氯苯丙氨酸，磷天冬氨酸及重氮氧代正亮氨酸等。其它氨基酸類藥物的臨床應(yīng)用44二氨基酸類藥物的生產(chǎn)方法1發(fā)酵法2水解法3酶法轉(zhuǎn)化45L－異亮氨酸的制備培養(yǎng)液滅菌滅菌培養(yǎng)液菌種培養(yǎng)接種發(fā)酵發(fā)酵液過濾上層液酸化濾液離子交換洗脫液減壓蒸餾濃縮液活性炭脫色濾液減壓濃縮濃縮液氨水中和沉淀水結(jié)晶干燥L(fēng)－異亮氨酸成品1發(fā)酵法46工藝過程1）菌種培養(yǎng)種子培養(yǎng)基組成（％）為：葡萄糖2，尿素0.3，玉米漿2.5，豆餅水解液0.1，pH6.5。二級種子培養(yǎng)基加菜籽油，其余同一級種子培養(yǎng)基。一級種子培養(yǎng)：1000ml三角燒瓶中培養(yǎng)基裝量為200ml，接種一環(huán)牛肉膏斜面AS1.998菌種，搖床30℃16h。二級種子培養(yǎng)：接種量3.5％，培養(yǎng)8h。逐級放大。2）滅菌、發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)液組成（％）：硫酸銨4.5，豆餅水解液0.4，玉米漿2.0，碳酸鈣4.5，pH7.2，淀粉水解還原糖粗糖濃度11.5。滅菌，接種1％菌種（v/v），攪拌，發(fā)酵。473）除菌體，酸化發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液加熱至100℃并維持10min，冷卻過濾，濾液加工業(yè)硫酸和草酸至pH3.5，過濾除沉淀。4）離子交換、吸附分離上述濾液每分鐘以樹脂量1.5％的流速進H＋型732離子交換柱（φ40×100cm),以100L去離子水洗柱，再以60℃,0.5mol/L氨水按3L/min的流速進行洗脫。分部收集洗脫液。5）濃縮趕氨6）脫色、濃縮、中和7）精制，烘干481水解法（一）基本原理蛋白質(zhì)水解方法酸水解法、堿水解法、酶水解法氨基酸分離方法溶解度法、特殊試劑沉淀法、吸附法、離子交換法氨基酸精制方法結(jié)晶，重結(jié)晶49L－胱氨酸的制備：人發(fā)或豬毛水解液L－半胱氨酸粗品濾液L－半胱氨酸粗品濾液L－半胱氨酸鹽酸水解氫氧化鈉中和鹽酸，活性炭氫氧化鈉中和鹽酸，活性炭中和，氨水水解法舉例50延胡索酸＋NH3固定化天冬氨酸酶轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化液L－Asp粗品分離L-Asp精品轉(zhuǎn)化液固定化L－Asp－β－脫羧酶濃縮結(jié)晶L－Ala粗品L－Ala精品精制3酶法轉(zhuǎn)化天冬氨酸和丙氨酸的制備51工藝過程1）菌種培養(yǎng)大腸桿菌（E.coli）AS1.881的培養(yǎng)斜面培養(yǎng)基為普通肉汁培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)基成分（％）：玉米漿7.5，反丁烯二酸2.0，硫酸鎂（7水）0.02，氨水調(diào)pH6.0，煮沸后過濾，500ml三角燒瓶中裝液量50-100ml。從新鮮斜面上或液體中培養(yǎng)種子，接種子于搖瓶培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)24h，逐級擴大培養(yǎng)至1000～2000ml規(guī)模。培養(yǎng)結(jié)束后用1mol/LHCl調(diào)pH5.0，升溫至45℃并保溫1h，冷卻至室溫，離心收集菌體。德阿昆哈假單胞（Pseudomonasdacunhae）68變異株的培養(yǎng)斜面培養(yǎng)基組成（％）為蛋白胨0.25，牛肉膏0.52，酵母膏0.25，NaCl0.5，pH7.0，瓊脂2.0。種子培養(yǎng)基與斜面培養(yǎng)基，不加瓊脂，250ml三角燒瓶中培養(yǎng)基裝量40ml。搖瓶培養(yǎng)基組成（％）為L－谷氨酸3.0，蛋白胨，酪蛋白水解液0.5，磷酸二氫鉀0.05，MgSO4.7H2O0.01，用氨水調(diào)pH7.2，500ml三角燒瓶中培養(yǎng)基裝量為80ml。將培養(yǎng)24h的新鮮斜面菌種接種于種子培養(yǎng)基中，30℃振搖培養(yǎng)8h，再接種于搖瓶培養(yǎng)基中，30℃振搖培養(yǎng)24h，逐級放大。522）細胞固定化Ecoli的細胞固定化取濕菌體20kg，懸浮于生理鹽水中，保溫至40℃，再加入90L保溫至40℃的12％明膠溶液及10L1.0％戊二醛溶液，充分攪拌均勻，放置冷卻凝固，再浸入0.25％戊二醛溶液中。于5℃過夜后，切成3～5mm的立體小方塊，浸入0.25％戊二醛溶液5℃過夜，蒸餾水充分洗滌，濾干得含天冬氨酸酶得固定化。假單胞菌體固定取濕菌體20kg，加生理鹽水?dāng)嚢柚料♂屩?0L，另取溶于生理鹽水的5％角叉菜膠溶液85L，兩液均保溫至45℃后混合，冷卻至5℃成膠。浸于600L2％KCl和0.2mol/L已二胺的0.5mol/LpH7.0的磷酸緩沖液中，5℃下攪拌10min，加戊二醛至0.6mol/L濃度，5℃攪拌30min，取出切成3～5mm的立體方塊，用2％KCl溶液充分洗滌后，濾去洗滌液，即得固定化脫羧細胞。533）生物反應(yīng)堆的制備4）轉(zhuǎn)化反應(yīng)5）產(chǎn)品純化與精制54L－脯氨酸4化學(xué)合成法55L－谷氨酸＋乙醇硫酸三乙胺L－谷氨酸－γ－乙酯KBH4還原L－Pro反應(yīng)液五氯酚沉淀氨水解析濾液活性炭濾液乙醚固形物精制L－脯氨酸成品562.10維生素生產(chǎn)工藝57一概述維生素是一類生物生長發(fā)育起調(diào)節(jié)作用的、化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的、小分子有機化合物，人體內(nèi)不能合成，必須從食物等中攝取。人體需求量很少，但不足時，出現(xiàn)相應(yīng)的缺乏癥。已知維生素13種，根據(jù)溶解性，一般分為水溶性和脂溶性維生素兩類。主要維生素的生產(chǎn)有三種方法。2002年我國維生素原料產(chǎn)量達8.2萬噸，其中維生素C超過5萬噸，成為世界上最大的原料藥生產(chǎn)國和出口國。維生素制劑年產(chǎn)量260－280億支/片/瓶，以片劑、注射液和膠囊為主。582維生素C生產(chǎn)工藝目前，工業(yè)上生產(chǎn)維生素C采用二步發(fā)酵法，此法是在1975年由中國科學(xué)院上海生物技術(shù)研究所研究出來的，屬我國首創(chuàng)。發(fā)酵法生產(chǎn)維生素C可以分為發(fā)酵、提取和轉(zhuǎn)化三大步驟。即先從D-山梨醇發(fā)酵，提取出維生素C前體2-酮基-L-古龍酸，再用化學(xué)法轉(zhuǎn)化為維生素C。第一步發(fā)酵黑醋酸菌（Acetobacter

suboxydans）經(jīng)種子擴大培養(yǎng)，接入發(fā)酵罐，種子和發(fā)酵培養(yǎng)基主要包括山梨醇、玉米漿、酵母膏、碳酸鈣等成份，pH5.0~5.2。醇濃度控制在24~27%，培養(yǎng)溫度29~30℃，發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液經(jīng)低溫滅菌，移入第二步發(fā)酵罐作原料。D-山梨醇轉(zhuǎn)化L-山梨糖的生物轉(zhuǎn)化率達98%以上。59第二步發(fā)酵氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter

oxydans，小菌)和巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium，大菌)混合培養(yǎng)。生產(chǎn)維生素C的發(fā)酵罐均在100m3以上，瘦長型，無機械攪拌，采用氣升式攪拌。種子和發(fā)酵培養(yǎng)基的成份類似,主要有L-山梨糖、玉米漿、尿素、碳酸鈣、磷酸二氫鉀等，pH值為7.0。大、小菌經(jīng)二級種子擴大培養(yǎng)，接入含有第一步發(fā)酵液的發(fā)酵罐中，29~30℃下通入大量無菌空氣攪拌，培養(yǎng)72h左右結(jié)束發(fā)酵，L-山梨糖生成2-酮基-L-古龍酸的轉(zhuǎn)化率可達70~85%。

2-酮基-L-古龍酸的分離提純經(jīng)二步發(fā)酵法兩次發(fā)酵以后，發(fā)酵液中僅含8%左右的2-酮基-L-古龍酸，且殘留菌絲體、蛋白質(zhì)和懸浮的固體顆粒等雜質(zhì)，常采用加熱沉淀法、化學(xué)凝聚法、超濾法分離提純。傳統(tǒng)工藝是加熱沉淀