本文格式為Word版，下載可任意編輯——用于牛肉摻雜肉成分檢測的熒光PCR方法研究湛寶萍

本文采用熒光PCR法對牛肉摻雜肉成分進行檢驗，以不同比例混合的牛肉、豬肉與鴨肉為樣品，分別采集樣品DNA，根據(jù)不同源性設(shè)定特異性引物和探針。根據(jù)試驗結(jié)果可知，該方法可有效檢測出同等質(zhì)量下三種肉質(zhì)的DNA濃度差異、質(zhì)量百分比，且誤差不超過5%，通過該檢測方式的應(yīng)用，可對牛肉中摻雜肉成分進行確切有效檢測。

材料與方法

試劑與設(shè)備本試驗主要試劑為動物基因DNA提取試劑盒、TapDNA聚合酶、分析純、引物和探針合成、人工全基因合成、無水乙醇。儀器為熒光PCR儀、高速冷凍離心機、絞肉機、電泳系統(tǒng)、恒溫混勻儀、電子天平。

試驗方法

（1）樣本制備。本試驗采用牛肉、豬肉和鴨肉，依照不同比例制備樣品;

（2）DNA提取。選擇50g動物肌肉樣本，用絞肉機攪碎后，先將樣本選取特定量放入2ml離心管內(nèi)，將3.8μL蛋白酶K溶液放入混均儀中，溫度設(shè)定66℃，時間為60min，間隔15min取出顛倒混勻后取出;提煉樣本中的上清液，將其提煉出后沉淀晾干，參與49μL超純水使其完全溶解，放入-18℃冰箱內(nèi)存儲存用。

（3）熒光PCR檢測。PCR反應(yīng)體系為35μL，循環(huán)參數(shù)設(shè)置為95℃，變性4min，再運行35個循環(huán)，每個循環(huán)94℃，變性30s;將各樣本熒光PCR檢測設(shè)定為平行樣本，擴增Ct值選出兩個樣品的Ct值取均值;引物和探針階段，為檢測樣本內(nèi)牛肉、豬肉的質(zhì)量百分比，以牛源性、豬源性、鴨源性基由于靶基因，設(shè)置特異性引物與探針[1]。

試驗結(jié)果

特異為檢驗該試驗中設(shè)計引物的特異性，以豬、鴨、牛的DNA為模板，利用引物和探針擴增樣本。根據(jù)試驗結(jié)果可知，牛源性基因特異性引物和探針與其他物種的DNA沒有反應(yīng)，僅與牛DNA產(chǎn)生擴散曲線;豬源性基因特異性與其他DNA無反應(yīng)，僅與豬DNA產(chǎn)生擴散曲線;鴨源性基因特異性與其他DNA無反應(yīng)，僅與鴨DNA產(chǎn)生擴散曲線。由此可見，該試驗中引物與探針擁有良好的特異性。

不同樣品DNA濃度差異采用PCR技術(shù)進行樣本檢測，對多種動物源性質(zhì)量比值進行分析，得出一致質(zhì)量下豬肉、鴨肉與牛肉中DNA濃度差值。選取0.02g的牛肉、鴨肉與豬肉、0.04g的牛肉、鴨肉和豬肉進行測試，并采用以下公式對不同肉樣品質(zhì)量與樣品DNA質(zhì)量比值進行計算。

式中，d為不同樣品質(zhì)量與DNA質(zhì)量比值。根據(jù)試驗結(jié)果可知，在質(zhì)量為0.02g狀況下，牛d為926.5，豬d為158，鴨d為42.7。在質(zhì)量為0.04g狀況下，牛d為925.7，豬d為583.5，鴨d為185.6。在質(zhì)量存在差異時，d值可能因操作與儀器等原因產(chǎn)生一定誤差，取兩次試驗均值，即牛d為932.42，豬d為156.24，鴨d為11.53。

質(zhì)量百分比采用熒光PCR檢測五個樣本中不同動物源性成分質(zhì)量比值含量，分別從樣本中選取0.04g樣品進行PCR檢測，獲得質(zhì)量百分比結(jié)果如下。樣品一：牛肉質(zhì)量0.36，豬肉0.004，實際檢測質(zhì)量比值為87.9%與12.1%;樣品二：牛肉質(zhì)量0.028，鴨肉0.012，實際檢測質(zhì)量比值為68.2%與31.8%;樣品三：牛肉質(zhì)量0.026，豬肉0.014，實際檢測質(zhì)量比值為63.5%與36.5%;可見，采用PCR檢測法可確切測出全部樣本中摻入的豬肉與鴨肉，且比值誤差不超過5%，與摻雜肉成分檢測需求相符合。

綜上所述，本試驗采用熒光PCR技術(shù)對