ICS65.020.20CCSB35

DB36江 西 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB36/T1654—2022飲用菊花脫毒原種苗繁育技術(shù)規(guī)程Technicalregulationsofbreedingofchrysanthemumvirus-freeseedseedlings2022092620230401江西省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布DB36/T1654DB36/T1654—2022DB36/T1654DB36/T1654—2022目 次前言 II1圍 12范引文件 13語(yǔ)定義 14本求 25室造隔離 26原繁殖 27原鑒定 38種室殖 39量測(cè) 4附錄A（范）RNA的反錄合鏈反（RT-PCR）檢方法 5II前言本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件起草單位：江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所。IIII飲用菊花脫毒原種苗繁育技術(shù)規(guī)程范圍（Chrysanthemummorifolium(RamatTzveL.）本文件適用于飲用菊花脫毒原種苗的生產(chǎn)。下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T8321（所有部分）農(nóng)藥合理使用準(zhǔn)則GB/T51057種植塑料大棚工程技術(shù)規(guī)范GB/T51183農(nóng)業(yè)溫室結(jié)構(gòu)荷載規(guī)范NY/T496肥料合理使用準(zhǔn)則通則NY/T525有機(jī)肥料NY/T1224農(nóng)用塑料薄膜安全使用控制技術(shù)規(guī)范NY/T1591菊花切花種苗等級(jí)規(guī)格NY/T496肥料合理使用準(zhǔn)則通則NY/T525有機(jī)肥料NY/T1224農(nóng)用塑料薄膜安全使用控制技術(shù)規(guī)范NY/T1591菊花切花種苗等級(jí)規(guī)格NY/T1657花卉脫毒種苗生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程香石竹、菊花、蘭花、補(bǔ)血草、滿天星3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1飲用菊花DrinkableChrysanthemum用于泡飲的多年生草本植物菊的頭狀花序。3.2脫毒種苗（virus-freeseedlings）經(jīng)RT-CRBCV（TV（CM）3.3原原種（breederseed）1育種家選育的性狀穩(wěn)定純正的用于繁殖原種的材料或種苗。3.4原種（foundationseed）由原原種繁殖的用于繁育生產(chǎn)用種的材料或種苗。產(chǎn)地環(huán)境符合NY/T391的規(guī)定。選擇排灌方便，地下水位較低，土層深厚、肥沃、疏松，3年內(nèi)未種過(guò)茄科作物、5年內(nèi)未種過(guò)菊科植物的中性或微酸性土壤地塊，且周圍800m范圍內(nèi)無(wú)其它菊科和茄科植物種植。應(yīng)符合GB/T8321（所有部分）的要求。應(yīng)符合NY/T496和NY/T525的要求。60GB/T51057和GB/T51183/℃/20℃2d，每晝238℃/30℃40d，沖洗1h。濾干，移入無(wú)菌操作臺(tái)，用20%的次氯酸鈉滅菌8min～10min，取出后用無(wú)菌水沖洗3～5將制備好的MS+6-BA0.1mg/L培養(yǎng)基溶液分裝于培養(yǎng)瓶，每瓶30ml，瓶口蓋緊瓶蓋。在121℃，1.1MPa條件下滅菌20min，冷卻后放入無(wú)菌操作臺(tái)待用。在無(wú)菌條件下，在解剖鏡下剝?nèi)∫褱缇牧系纳L(zhǎng)點(diǎn)0.3mm～0.5mm，接種到已滅菌的培養(yǎng)基上，置于26℃，光強(qiáng)2000lx～3000lx，光照時(shí)間16h/d條件下培養(yǎng)，一周左右莖尖轉(zhuǎn)綠并萌動(dòng)，20d～30d形成帶芽莖段。2在無(wú)菌條件下將已分化的帶芽莖段剪成小段，每段帶1～2個(gè)腋芽，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基（MS+6-BA0.1mg/L）中進(jìn)行增殖，3～4周后獲30～40個(gè)帶腋芽芽段。取繼代培養(yǎng)壯芽或葉片提取RNA，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)方法鑒定，沒有病毒宜繼續(xù)培養(yǎng)，脫毒不徹底應(yīng)棄之不用。具體操作見附錄A。將繼代培養(yǎng)的莖段轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基（MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.1mg/L）誘導(dǎo)生根，培養(yǎng)溫度25℃～26℃，3～4周后95%均生根。煉苗瓶苗株高6cm～7cm，5～6片平展葉，生根5條以上3cm～4cm長(zhǎng)的根時(shí)即可煉苗，幼苗煉苗1d～2d后，定植在營(yíng)養(yǎng)缽或苗床，于具60目防蟲網(wǎng)的防蟲網(wǎng)室或防蟲溫室內(nèi)進(jìn)行培育。9cm×9cm︰1︰70施肥。氣溫不足時(shí)采取小拱棚膜和大棚相結(jié)合的雙膜覆蓋方式。白天保持25℃～26℃，夜間18℃～20℃。成活后白天保持25℃～27℃，夜間16℃～18隨機(jī)抽取每批次脫毒苗5～10株，以其母株為對(duì)照種植至開花。觀察比較其主要生物性狀，與母株無(wú)差異者則可確認(rèn)為原原種，有差異則淘汰。原種繁育田要求育苗環(huán)境除應(yīng)符合NY/T391燥，土層深厚、肥沃、疏松，陽(yáng)光充足，通風(fēng)條件好，3年內(nèi)未種過(guò)茄科植物、5年內(nèi)未種過(guò)菊科植物800m育苗地于冬前深耕曬垡，每667平方米施入完全腐熟的農(nóng)家肥500kg，扦插前一周左右平整土地，清除雜草，畦面做到平、細(xì)、碎。育苗畦高25cm～30cm，畦面寬100cm，畦間距40cm。苗床四周開寬50cm的深溝，便于排水。3苗床先利用太陽(yáng)光暴曬消毒，均勻噴灑廣譜殺菌劑和滅線劑至畦面上預(yù)防雜菌和根結(jié)線蟲病，再每平方米用茶枯餅0.03kg殺滅地下害蟲。在整平的畦面上均勻鋪上5cm～10cm厚的河沙。原種母株定植行株距應(yīng)為45cm×45cm，從煉苗移栽成活的原原種上取健壯枝條扦插于苗床上，于網(wǎng)室中擴(kuò)繁。當(dāng)原種母株長(zhǎng)到7～8片葉時(shí)，從基部留3～4片葉處剪下頂芽進(jìn)行扦插。0℃7cm～8cm1NY/T496和NY/T525NY/T1657脫毒原種苗質(zhì)量檢測(cè)參照NY/T1591中5.1.3進(jìn)行抽樣檢查，并按照NY/T1591中5.2的內(nèi)容進(jìn)行檢測(cè)，確定種苗的質(zhì)量等級(jí)。44RNARNATaaRainETPantNAEtraconiPrtoco-I1.0%的瓊脂糖凝膠對(duì)總RNA提取結(jié)果進(jìn)行電泳檢測(cè)，利用微量核酸測(cè)定儀檢測(cè)RNA濃度，測(cè)量A260與A280cDNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript?II1stStrandcDNASynthesisKit）說(shuō)明書進(jìn)行。PCR5附錄A（規(guī)范性）RNA病毒的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測(cè)方法A.1主要儀器設(shè)備與試劑、耗材表A.1各步驟主要儀器設(shè)備與試劑、耗材步驟/類別主要儀器設(shè)備主要試劑盒與試劑（試劑均使用分析純?cè)噭┲饕牟腞NA提取量核酸測(cè)定儀RNA提取試劑盒：TaKaRaMiniBESTPlantRNAExtractionKit試劑：無(wú)水乙醇、液氮無(wú)RNA酶的離心管（1.5，2mL、移手套、乳膠手套第一鏈cDNA合成水浴鍋、制冰機(jī)、PCR擴(kuò)增儀器反轉(zhuǎn)錄試劑盒：PrimeScript?II1stStrandcDNASynthesisKitRNAPCRPCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增儀器、制冰機(jī)微量移液器、微量離心機(jī)PremixTaq?(TaKaRaTaq?Version2.0plusdye)、引物、礦物油RNAPCR凝膠電泳電子天平、微波爐、電泳儀、水平電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)瓊脂糖、1×TAE緩沖液、DNAMarker梳子、乳膠手套PCR10L（0mM，.410M5LPremixTaqaKTaerson.0lusdye)0.0ULDNA（20n/L，3LddOPCR按照以下程序進(jìn)行：1）94℃預(yù)變性4min；2）94℃變性45s；3）按表A.2推薦的引物退火溫度，退火45s；4）72℃延伸45s；5））～356）72℃延伸7min；7）4℃保存。PCR配制1.0%1mmRT-PCR檢測(cè)時(shí)，設(shè)定陽(yáng)性和陰性對(duì)照，當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照有目標(biāo)帶出現(xiàn)，陰性對(duì)照無(wú)帶時(shí)，檢測(cè)的結(jié)果為有效。檢測(cè)樣品有與陽(yáng)性對(duì)照相同的目標(biāo)帶出現(xiàn)時(shí)為陽(yáng)性，無(wú)目標(biāo)帶為陰性。表A.2菊花病毒的特異性引物RT-PCR檢測(cè)時(shí)，設(shè)定陽(yáng)性和陰性對(duì)照，當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照有目標(biāo)帶出現(xiàn)，陰性對(duì)照無(wú)帶時(shí)，檢測(cè)的結(jié)果為有效。檢測(cè)樣品有與陽(yáng)性對(duì)照相同的目標(biāo)帶出現(xiàn)時(shí)為陽(yáng)性，無(wú)目標(biāo)帶為陰性。表A.2菊花病毒的特異性引物6病毒名稱引物序列（5’-3’）退火溫度產(chǎn)物（bp）菊花B病毒（CVB）P1:ACCGAATTCTTAGTCACAATGCCTCCCP2:TCCGAGCTCATAGAGACGGCATACCGG55℃650番茄不孕病毒（TAV）P1:CCATCCCTTCAACATCCGACTTP2:GGAGCGTTGAAGCGGAAGGAAT52℃499黃瓜花葉病毒（CMV）P1:GTAGTGAA