33/33分子生物學考試總結(jié)PARTⅠ基因

（略）

PARTⅡ原核基因表達體系

第五章細菌轉(zhuǎn)錄

1、簡介：轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA鏈代表了DNA雙鏈的一條鏈。新合成的RNA鏈為5’-3’，而模板鏈為3’-5’。轉(zhuǎn)錄出來的RNA排列與編碼鏈相同。RNA合成由RNA聚合酶催化。轉(zhuǎn)錄起始于RNA聚合酶與DNA上的特定區(qū)域的結(jié)合——啟動子（promoter），這作為轉(zhuǎn)錄的開始。從啟動子開始，RNA聚合酶沿著模板鏈移動合成RNA，直到到達終止子（terminator）序列。這一反應(yīng)決定了轉(zhuǎn)錄單位的形成，即從啟動子至終止子的序列均為轉(zhuǎn)錄單位，這一區(qū)域可能包含不止一個基因。序列優(yōu)先從起始點（轉(zhuǎn)錄RNA的第一個堿基）。起始點以上的被稱為上游，以下的被稱為下游。轉(zhuǎn)錄的直接產(chǎn)物被稱為初始轉(zhuǎn)錄本。它包含了從啟動子至終止子的5’-3’的全部信息。然而，轉(zhuǎn)錄起始本通常被直接修飾。原核細胞中，它直接被降解（mRNA），或者切割成為成熟的tRNA或者rRNA。轉(zhuǎn)錄只是基因表達以及調(diào)控的第一階段。調(diào)控蛋白決定了到底是哪一部分的基因能夠被RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄。這一步驟決定了基因的轉(zhuǎn)錄與否。本章需要談?wù)摰膯栴}主要有兩個。1、RNA聚合酶究竟是怎樣找到DNA上的啟動子序列的？推廣這一問題為：究竟蛋白質(zhì)是怎樣閱讀DNA上的序列來找到特定的結(jié)合位點的？

2、調(diào)控蛋白是怎樣與RNA聚合酶相互作用來啟動或者抑制轉(zhuǎn)錄的起始、延長、或者終止過程的？

2、轉(zhuǎn)錄發(fā)生在轉(zhuǎn)錄泡中：在通常意義上的轉(zhuǎn)錄過程中，RNA一般合成于“轉(zhuǎn)錄泡”中，轉(zhuǎn)錄泡為解開雙螺旋的DNA雙鏈。RNA鏈沿著5’-端向3’-端合成。游離核苷酸的3’-OH與DNA鏈上的核苷酸的5’-P相互作用，合成RNA鏈。RNA聚合酶與啟動子結(jié)合后就會解離DNA雙鏈形成轉(zhuǎn)錄泡。當RNA聚合酶沿著DNA模板移動時，其沿著解旋點（unwindingpoint）解開DNA雙螺旋，并且在重旋點（rewindingpoint）重旋DNA。轉(zhuǎn)錄泡的長度一般為12-14bp，但是RNA-DNA雜交鏈區(qū)域的長度為8-9bp。

3、轉(zhuǎn)錄反應(yīng)有三個階段：轉(zhuǎn)錄可以被簡單的分為三個階段，起始階段：啟動子識別、轉(zhuǎn)錄泡的形成、以及RNA合成開始。延長階段：轉(zhuǎn)錄泡沿著DNA移動。終止階段：RNA轉(zhuǎn)錄本釋放、轉(zhuǎn)錄泡關(guān)閉。

起始階段開始于模板識別，RNA聚合酶與DNA雙鏈上的啟動子結(jié)合形成閉合復(fù)合體。之后，RNA聚合酶使DNA雙鏈解旋形成開放復(fù)合體，使模板鏈能夠進行接下來的核糖核苷酸合成。轉(zhuǎn)錄泡從啟動子開始進行局部解旋形成，RNA聚合酶催化這一過程。接下來是RNA核苷酸鍵的合成。RNA聚合酶保留在啟動子區(qū)域同時合成最初的9bp的核苷酸鍵。RNA聚合酶釋放最初合成的短的轉(zhuǎn)錄本，之后開始重新合成RNA。起始階段的終止于聚合酶成功的延伸最初序列以及啟動子序列的確定。

延長階段：延長階段中，聚合酶沿著模板DNA鏈從3’-5’合成5’-3’的RNA鏈。核苷酸加到3’-自由的羥基上。

終止階段：聚合酶與終止子結(jié)合，此時，不需要額外的堿基加到鏈中。若要終止轉(zhuǎn)錄，磷酸二酯鍵的形成必須終止。轉(zhuǎn)錄復(fù)合體必須分離。酶以及RNA分離，DNA序列恢復(fù)雙螺旋。

4、酶移動依賴于其晶體結(jié)構(gòu)：1）RNA聚合酶包含一個小溝使得DNA在其中通過，細菌聚合酶的小溝可以容納16bp，而真核聚合酶能夠容納25bp長度。聚合酶表面主要是負電荷覆蓋，而小溝里面則為正電荷（主要是激活位點富集的Mg++），因此可以和DNA表面帶負電荷的磷酸基團相互作用。2）RNA聚合酶主要由以下結(jié)構(gòu)組成：鉗子（clamp）、蛋白舵（Rudder）、蛋白墻（Wall）、蛋白橋（Bridge）以及蛋白頜（jaw）。3）DNA在蛋白頜的引導(dǎo)下進入小溝，在激活位點附近DNA雙鏈解開，蛋白鉗子將上面一條鏈夾住，蛋白橋通過自身構(gòu)象的彎曲-直立，使得下面一條DNA

模板鏈的構(gòu)象改變，使DNA堿基朝外，每配對一個核苷酸，就翻過來一個，以此來來控制核苷酸進入激活位點。在蛋白墻的作用下模板鏈形成DNA-RNA雜交鏈，RNA在蛋白舵的作用下以單鏈的形式脫離聚合酶，同時DNA恢復(fù)雙螺旋。

5、噬菌體T7RNA聚合酶是一種很重要的模式系統(tǒng)：T3以及T7噬菌體RNA聚合酶有單個亞基，能夠以最低限度的活性識別很小數(shù)量的噬菌體啟動子。T7RNA聚合酶有一種特定的環(huán)（β折疊絲帶）能夠和啟動子的-7~-11結(jié)合，同時-1~-4進入激活位點。

6、細菌RNA聚合酶有多個亞基組成：1）E.coli中有一種單獨類型的RNA聚合酶表現(xiàn)出了幾乎所有的mRNA、rRNA、tRNA合成活性。2）RNA聚合酶全酶由四種亞基組成，2個α亞基（每個40kD），功能為酶的組裝、啟動子的識別、與一些激活因子結(jié)合；β、β’亞基（160kD）催化中心，模板鏈以及編碼鏈都與β、β’亞基作用，位點主要位于轉(zhuǎn)錄泡以及下游序列；σ亞基（32-90kD）與啟動子的識別有關(guān)。

7、啟動子識別依賴于一致性的序列：細菌啟動子主要由四種保守元件（或者五種）組成。1）起始點（startpoint）：

通常>90%情況下為一個嘌呤（起始位點為5-9bp長）。2）-10區(qū)序列：起始點上游有6bp的序列在幾乎所有的啟動子中都能夠找到，這六個序列中間一個到起始點相隔10bp，因此稱為-10區(qū)，其六個一致性序列為TATAAT。3）-35區(qū)序列，六序列：TTGACA。4）-35區(qū)與-10區(qū)之間為分隔區(qū)，占到了啟動子序列的90%，從15bp到20bp不等。這段距離對于RNA聚合酶的幾何學距離有很大作用。5）有一些啟動子在上游遠一些的距離還有一段A-T富集序列。這被稱為UP元件。它與RNA聚合酶的α亞基作用，在編碼rRNA的基因中較多。

8、突變能引起啟動子效率的上調(diào)或者下降：1）-35區(qū)的突變通常影響RNA聚合酶與DNA的最初識別。因此我們可以將-35區(qū)視為識別結(jié)合域。2）-10區(qū)域的突變通常影響DNA的解鏈，會將開放復(fù)合體閉合。因此我們可以將-10區(qū)視為解鏈區(qū)。因為-10區(qū)A-T富集，使其打開需要的能量較少。3）RNA聚合酶結(jié)合過程：首先與-35區(qū)的RNA聚合酶最初接觸，其次閉合包圍啟動子區(qū)域，最后在-10區(qū)解鏈DNA形成開放復(fù)合體。

9、替換σ因子可能控制轉(zhuǎn)錄起始：1）E.coli有很多σ因子，每一種都會使得RNA聚合酶與不同的啟動子結(jié)合。2）σ70被用于一般性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。其他的σ因子只在特殊條件下被激活。3）σS用于逆境脅迫、σ32用于熱擊作用、σE同樣用于熱擊作用、σ54用于氮素缺乏、σ28用于鞭毛合成。4）σ因子調(diào)控啟動子的識別：σ70全酶識別一種啟

動子，當替換σ因子之后則導(dǎo)致聚合酶識別另一種啟動子。

10、σ因子直接與DNA互作：1）E.coli的σ70因子由一些保守序列組成，2.1，2.2區(qū)與核心酶互作，2.3作用于DNA解鏈，2.4,4.2與-10區(qū)、-35區(qū)的啟動子元件相作用。1.1,1.2區(qū)的N-端序列阻止沒有核心酶的情況下2.4,4.2區(qū)與DNA的結(jié)合。其中，2.4區(qū)組成α-螺旋與-10區(qū)編碼鏈的特定堿基作用。Thr、Gln→T，Trp、Tyr→A。2）σ因子的N端序列與DNA結(jié)合域結(jié)合其與DNA的結(jié)合。當開放復(fù)合體形成之后，N-端序列繞過20A的距離，與DNA結(jié)合域分離。

10、σ因子可能有組織的進行級聯(lián)反應(yīng)：1）在噬菌體SPO1感染枯草芽孢桿菌的過程里面，涉及到基因表達的三個階段，早期基因、中期基因、晚期基因，他們之間的換轉(zhuǎn)是通過σ因子來調(diào)控的。2）早期基因表達時，σ43引導(dǎo)細菌全酶識別噬菌體的啟動子。之后，基因28表達新的σ因子替換細菌σ43因子。中期時，gp28-核心酶轉(zhuǎn)錄噬菌體中期基因，中期基因33和34編碼新的σ因子替換gp28σ因子。晚期時，gp33-gp34核心酶轉(zhuǎn)錄噬菌體晚期基因。但是這其中的機理目前還不得而知。

11、轉(zhuǎn)錄的終止——細菌RNA聚合酶在分離的位點終止：1）對于終止子我們并沒有一個準確的定義，轉(zhuǎn)錄通常表現(xiàn)為3’-末端的初始轉(zhuǎn)錄本被切割，之后并不特別表現(xiàn)為在某一位點RNA轉(zhuǎn)錄停止。因此，我們只是找到了兩類轉(zhuǎn)錄終止子的特征。1、細菌以及噬菌體中終止子的序列與最后加到RNA上的序列不同，終止依賴于模板或者產(chǎn)物的校正機制。2、許多終止子需要一種發(fā)夾結(jié)構(gòu)來停止RNA轉(zhuǎn)錄。這意味著轉(zhuǎn)錄終止并不僅僅依賴于DNA序列的校正機制，還依賴于RNA產(chǎn)物自身的結(jié)構(gòu)。2）一些終止子的終止作用會被抗終止而導(dǎo)致酶繼續(xù)轉(zhuǎn)錄終止子之后的序列。這一過程被稱為通讀。

12、E.coli中兩種類型的終止子：1）第一類為內(nèi)在終止子（intrinsicterminator），這類終止子可以在核心酶缺乏其他因子的情況下終止轉(zhuǎn)錄；第二類為Rho-依賴型的終止子，這類終止子需要外源的Rho（ρ）因子來協(xié)助終止。2）內(nèi)在終止子的終止機制：內(nèi)在終止子有7-20bp的回文序列區(qū)來幫助形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，發(fā)夾結(jié)構(gòu)環(huán)中主要為G-C富集區(qū)，發(fā)夾結(jié)構(gòu)之后為一系列的U殘基。這兩段通常距離很短，一般大約為7-9bp。點突變的研究結(jié)果表明，發(fā)夾結(jié)構(gòu)減慢了RNA聚合酶的合成速度，之后下游的U-富集區(qū)域使DNA-RNA雜交鏈不穩(wěn)定化，通常情況下，rU-dA鍵堿基配對結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，容易解鏈，因此我們可以看到RNA上U-富集區(qū)域與DNA鏈上A-T對相對應(yīng)，這說明A-T對在轉(zhuǎn)錄起始以及終止過程均起到重要作用。3）入噬菌體的終止因子：Nus因子在轉(zhuǎn)錄終止中起作用。內(nèi)在轉(zhuǎn)錄終止子需要NusA，NusB-S10蛋白參與Rho-依賴型的轉(zhuǎn)錄終止。NusB-S10蛋白與nus的boxA序列結(jié)合，NusA與nus的boxB序列結(jié)合。NusA增加了RNA聚合酶在轉(zhuǎn)錄終止子附近暫停的趨勢（其對其他二級結(jié)構(gòu)也起到同樣的作用）。NusB以及S10組成的二聚體與包含boxA的RNA結(jié)合。NusG可能起到降所有的Nus因子組裝成復(fù)合體從而與RNA聚合酶結(jié)合的作用。4）內(nèi)在終止子與Rho-依賴型的終止子需要不同的Nus因子，內(nèi)在終止子需要NusA因子，這個終止作用被pN蛋白阻斷。Rho-依賴型的終止需要所有四種Nus因子，同樣pN可以阻斷這種終止作用。通常認為pN蛋白與NusA因子結(jié)合從而起到抗終止的作用。

13、Rho因子究竟是怎樣起作用的？1）Rho依賴型的終止子占到大腸桿菌終止子的一半左右，Rho因子需要與車轍序列（rutsequence）結(jié)合來發(fā)揮作用。車轍序列為一段C富集G缺乏序列，位于轉(zhuǎn)錄終止子上游。2）Rho因子分為兩部分，N-端RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及C-端ATP酶結(jié)構(gòu)域。組成一個六聚體結(jié)構(gòu)，其5’-端與RNA結(jié)合形成二級結(jié)構(gòu)，RNA繞其一圈，從5’-端出去。3）作用過程：1、RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄DNA。2、Rho與RNA上的車轍序列結(jié)合。3、Rho沿RNA運動。4、RNA聚合酶在發(fā)夾結(jié)構(gòu)處停止，之后Rho因子追上。5、Rho因子解旋DNA-RNA雜交鏈。6、終止

作用：所有的組分釋放。4）Rho因子可能將轉(zhuǎn)錄以及翻譯產(chǎn)生聯(lián)系，在野生型中，核糖體與mRNA結(jié)合會抑制Rho因子的結(jié)合或者運動，當翻譯完成之后，核糖體脫落，Rho因子追上RNA聚合酶，轉(zhuǎn)錄終止，所有組分脫落。

14、抗終止作用是一種調(diào)控：1）抗終止是一種轉(zhuǎn)錄控制機制，其阻止轉(zhuǎn)錄終止于終止子，使RNA聚合酶越過終止子繼續(xù)轉(zhuǎn)錄。2）通讀：轉(zhuǎn)錄以及翻譯中的通讀現(xiàn)象發(fā)生于RNA聚合酶或者核糖體由于模板或者是輔助因子作用而忽視終止信號的現(xiàn)象。3）抗終止蛋白允許RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄終止子之后的序列。4）最佳的研究例子為入噬菌體。宿主RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄入基因并且在t位點終止。N基因控制噬菌體早早期基因以及晚早期基因的轉(zhuǎn)錄，pN允許其通讀到終止子之后的L以及R1單位，這樣晚早期基因就會轉(zhuǎn)錄。Q基因控制噬菌體晚期基因的表達，pQ允許其通讀到R’終止子。pN作用于nut位點，pQ作用于qut位點，這些位點都位于轉(zhuǎn)錄單位的不同位置。nutL位于起始位點附近，nutR位于終止子之前。Qut位于啟動子之間。5）抗終止蛋白的作用位點：抗終止子蛋白與轉(zhuǎn)錄終止子上游的序列結(jié)合?？菇K止子的結(jié)合位點可以是啟動子部分也可以是轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)序列。6）pN以及pQ的終止機理：pN蛋白與RNA鏈上的boxB序列結(jié)合，再與Nus因子復(fù)合體中的NusA、RNA聚合酶結(jié)合，這樣就形成了一種環(huán)狀結(jié)構(gòu)，pN蛋白與NusA的結(jié)合降低了RNA聚合酶在發(fā)夾結(jié)構(gòu)處暫停的時間，這樣就使其越過終止子，繼續(xù)下面基因的轉(zhuǎn)錄。pQ蛋白與pN蛋白的機理不同，qut位點位于晚期基因轉(zhuǎn)錄單位的起始，qut位點上游為啟動子，下游為轉(zhuǎn)錄區(qū)，這意味著pQ與DNA鏈上的區(qū)域以及RNA聚合酶相作用，pQ與聚合酶的結(jié)合大大降低了其在發(fā)夾結(jié)構(gòu)處暫停的時間，從而使其快速越過終止子，轉(zhuǎn)錄下面的基因。

第六章操縱元（Theoperon）

1、簡介：1）基因的表達需要很多階段的調(diào)控，這些過程大體上分為轉(zhuǎn)錄、修飾以及翻譯。第一個階段就是轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，通常這一過程發(fā)生于終止時RNA聚合酶是否越過終止子來轉(zhuǎn)錄下面的基因。在真核細胞中，RNA的操作通常為修飾、剪切、轉(zhuǎn)運或者穩(wěn)定。細菌中mRNA一旦被合成就可以開始翻譯，但是這一時間段并不包含修飾操作。翻譯也是可以調(diào)控的，發(fā)生在翻譯起始以及終止過程（類似于轉(zhuǎn)錄）。2）兩種DNA序列，一種為編碼反式作用產(chǎn)物的序列，另一種為順式作用序列，在DNA內(nèi)部發(fā)揮作用?；蚧钚酝ㄟ^反式作用產(chǎn)物與順式作用序列之間的特定作用的調(diào)控。3）一段DNA序列編碼能夠分散出去的產(chǎn)物，這一產(chǎn)物可能為蛋白或者為RNA。其具有一種重要的特性：產(chǎn)物自從其合成位點被合成之后，能夠分散并且尋找特定的作用位點起作用，這種作用被稱為反式作用（trans-acting）。4）以DNA位點的形式起作用，并且只與與其有物理上聯(lián)系的DNA起作用（在有些情況下順式作用序列以RNA的形式而起作用）

2、負調(diào)控以及正調(diào)控：1）一個典型的細菌負調(diào)控為：阻遏蛋白阻止基因表達。反式作用的阻遏子與順式作用的操縱基因結(jié)合關(guān)閉了轉(zhuǎn)錄。操縱基因緊挨啟動子，當阻遏蛋白（repressorprotein，即阻遏蛋白）與操縱基因結(jié)合之后，RNA聚合酶就從轉(zhuǎn)錄最開始被阻斷，基因表達之后被關(guān)閉。2）另一個模型為正調(diào)控，缺省狀態(tài)下某種基因是關(guān)閉狀態(tài)的，RNA聚合酶自身不能直接啟動轉(zhuǎn)錄。一些反式作用因子在啟動子附近有作用位點，與這些因子的結(jié)合可以協(xié)助RNA聚合酶開啟這段基因轉(zhuǎn)錄。3）調(diào)控因子識別的序列長度小于10bp。4）基因組織的形式上，細菌的結(jié)構(gòu)基因是成簇的，真核則是分散的。簇狀的結(jié)構(gòu)基因受到單個啟動子調(diào)控。單個啟動子決定這些結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄與否。

3、原核細胞的結(jié)構(gòu)基因是協(xié)同調(diào)控的：典型的例子為細菌的三個lac結(jié)構(gòu)基因——lacZYA。Lac操作元由6000bpDNA組成，最左側(cè)的lacⅠ基因有自己的啟動子以及終止子。lacⅠ之后為lacZYA結(jié)構(gòu)基因的啟動子PO，后面依次排列l(wèi)acZ、lacY、lacA結(jié)構(gòu)基因。lacA后面為終止子。三個結(jié)構(gòu)基因有各自的功能。lacZ編碼β-半乳糖苷酶，lacY編碼通透酶，lacA編碼轉(zhuǎn)乙酰酶。lacⅠ則編碼阻遏蛋白。操縱元：細菌基因表達以及調(diào)控的單位，包括結(jié)構(gòu)基因以及識別DNA的調(diào)控元件。

4、lac基因由阻遏蛋白調(diào)控（負調(diào)控）：1）阻遏蛋白為lacⅠ基因表達的四聚體蛋白。2）阻遏蛋白與lacZYA基因的啟動子結(jié)合（轉(zhuǎn)錄起始點-5~+21），結(jié)合區(qū)域與RNA聚合酶結(jié)合區(qū)以及操作元區(qū)域重疊。3）當阻遏蛋白與啟動子結(jié)合的時候，lacZYA就不能被轉(zhuǎn)錄。

5、lac操縱元可以被誘導(dǎo)（induced）：向細菌中加入β-半乳糖，則會與阻遏蛋白相連，使其脫落，進而激活lac操縱元，促使lacmRNA短時間內(nèi)大量表達，β-半乳糖苷酶的合成則與mRNA合成有一定的間隔。誘導(dǎo)物：通過與調(diào)控蛋白相連而激活基因表達的小分子。誘導(dǎo)：對外界特定底物相應(yīng)而表達相應(yīng)酶的過程。

6、阻遏蛋白受到小分子誘導(dǎo)物的調(diào)控：1）阻遏蛋白有兩個結(jié)合位點，一個為操縱基因結(jié)合位點，另一個為誘導(dǎo)物結(jié)合位點。2）誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合后會導(dǎo)致阻遏蛋白構(gòu)象上發(fā)生改變，使其不能再與操縱基因結(jié)合。這種調(diào)控稱為變構(gòu)調(diào)控（allostericregulation）。3）有一些誘導(dǎo)物能夠與lac操縱元作用，但是不能被酶催化，這種誘導(dǎo)物被稱

為安慰誘導(dǎo)物（gratuitousinducers），例如IPTG（慧能大師實驗中用到的東東）。4）然而，我們注意到操縱元的調(diào)節(jié)中有一個潛在的矛盾（paradox），乳糖操縱元包含結(jié)構(gòu)基因lacZ編碼β-半乳糖苷酶，其同樣包含lacY基因，編碼將誘導(dǎo)物運進細胞的通透酶。如果操縱元處于抑制狀態(tài)，那么，lacY就不會表達通透酶，因此，誘導(dǎo)物就不會進入細胞，那么誘導(dǎo)過程就根本不可能發(fā)生。有兩個事實確保了上述矛盾不會發(fā)生，一是細胞中存在著極少數(shù)的通透酶使得誘導(dǎo)物足以進入細胞激活誘導(dǎo)過程，二是操縱元即使被抑制也能在低水平下表達一部分通透酶，即使不被誘導(dǎo)，況且一些誘導(dǎo)物有著其他的運輸途徑。

7、組成型順式作用突變可以鑒別操縱基因：1）操縱基因（oprator）的突變?yōu)榻M成型的，因為操縱基因不能再與阻遏蛋白相連，使得操縱基因不受誘導(dǎo)物的影響并且RNA聚合酶能夠沒有限制的與啟動子結(jié)合。Oc突變?yōu)轫樖阶饔?，因為它影響與自己直接相連的結(jié)構(gòu)基因。2）操縱基因是典型的順式作用，能否起作用受到反式作用因子的調(diào)控。操縱基因控制與其相鄰的基因，與其等位基因無關(guān)。因此，操縱基因位點上的突變?yōu)轫?顯性（cis-dorminant）。

8、反式作用突變可以鑒別調(diào)節(jié)因子：1）lacⅠ基因的突變?yōu)榉词阶饔枚視绊懰胠acZYA基因的表達。2）突變導(dǎo)致lacⅠ功能消失導(dǎo)致組成型表達，這一突變是隱性的。3）阻遏蛋白DNA結(jié)合位點的突變導(dǎo)致組成型表達。4）阻遏蛋白誘導(dǎo)物結(jié)合位點的突變阻止其被誘導(dǎo)物變構(gòu)，這導(dǎo)致了去誘導(dǎo)化（uninducibility）。5）啟動子的突變時去誘導(dǎo)化的以及順式作用的。

9、阻遏蛋白與操縱基因結(jié)合：1）阻遏蛋白與DNA雙鏈上的操縱基因結(jié)合。2）操縱基因由26bp的回文序列組成。3）每一個顛倒的重復(fù)與一個阻遏蛋白的DNA結(jié)合位點結(jié)合。

10、阻遏蛋白單體由許多結(jié)構(gòu)域組成：1）阻遏蛋白亞基可以被分為N-端DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，鉸鏈區(qū)，以及蛋白的核心區(qū)。2）DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域由兩個短的α-螺旋區(qū)組成，與DNA的大溝結(jié)合。3）誘導(dǎo)物結(jié)合位點以及多聚化位點則位于核心區(qū)域。

11、阻遏蛋白是兩個二聚體組成的四聚體：阻遏蛋白四聚體由兩個二聚體組成，每個二聚體由核心區(qū)域2以及寡聚化的螺旋組成。

12、DNA結(jié)合由異構(gòu)化調(diào)控：1）激活的阻遏蛋白二聚體的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域相繼插入雙螺旋的大溝中。2）誘導(dǎo)物的結(jié)合改變了阻遏蛋白的構(gòu)象，使其幾何學構(gòu)象發(fā)生改變，不能再與DNA雙螺旋結(jié)合。

13、阻遏蛋白與三個操縱基因結(jié)合并與RNA聚合酶相互作用：1）實際上，lac操縱元有三個操縱基因位點，lacZ基因起始的O1操縱基因位點。它有著最強的阻遏蛋白親和力。O2操縱基因位于起始位點下游410bp處，O3在O2上游83bp處。2）每一個阻遏蛋白二聚體都可以與一個操縱基因結(jié)合，因此四聚體可以同時與兩個操縱基因結(jié)合，完全的抑制需要阻遏蛋白與lacZ啟動子的操縱基因以及另外一個上游或者下游的操縱基因結(jié)合，這樣會使DNA雙鏈形成一個環(huán)。3）阻遏蛋白與操縱基因的結(jié)合同時會與RNA聚合酶結(jié)合，但是這會妨礙到轉(zhuǎn)錄。

14、阻遏蛋白總是與DNA結(jié)合：1）蛋白與特定的DNA序列具有高度親和力，對于其他DNA序列有低親和力。2）阻遏蛋白與誘導(dǎo)物結(jié)合構(gòu)象改變之后并不是游離到溶膠中，而是低親和力地與其他DNA序列結(jié)合。

第七章轉(zhuǎn)錄后及翻譯水平調(diào)控：（說明：這部分內(nèi)容在基因Ⅸ中被拆分成了兩章，分別為12章操縱元的12.20-12.25，以及13章調(diào)控RNA）

1、RNA以及蛋白均可以起到調(diào)控的作用：1）蛋白調(diào)節(jié)子：蛋白調(diào)控以變構(gòu)的形式進行。上一章以及討論過調(diào)控蛋白有兩個結(jié)合位點，一個為核苷酸結(jié)合位點，另一個為小分子結(jié)合位點。與小分子的結(jié)合改變了蛋白的構(gòu)象使其與核苷酸位點的親和力改變。2）RNA調(diào)節(jié)子：RNA調(diào)控以兩種方式進行，1、分子內(nèi)的改變?yōu)镽NA自身形成二級結(jié)構(gòu)，對于mRNA來說這可能意味著轉(zhuǎn)錄的終止。

2、分子間的相互作用為RNA調(diào)節(jié)子識別與其符合堿基互補配對的序列，典型的例子為單鏈目標RNA與調(diào)控RNA結(jié)合。這樣的結(jié)合有兩種結(jié)果，一種是原先能夠與單鏈目標RNA結(jié)合的蛋白，在其形成互補雙鏈之后不能再與其識別。更多的情況下，這種雙螺旋會被核酸酶識別而降解，從而阻止目標RNA的表達。

2、大腸桿菌的葡萄糖/乳糖調(diào)控模型：1）大腸桿菌表面的PTs系統(tǒng)用于運輸Glucose。一旦葡萄糖被運入，那么運輸乳糖的通道就被關(guān)閉，ⅡAGlc蛋白去磷酸化，無法激活腺苷酸環(huán)化酶，從而無法產(chǎn)生cAMP，于是CRP蛋白處于失活狀態(tài)，lacgenes不表達。2）一旦沒有g(shù)lucose，而加入乳糖，那么ⅡAGlc蛋白磷酸化，進而激活腺苷酸環(huán)化酶，產(chǎn)生cAMP，cAMP激活CRP使其形成二聚體，之后CRP與DNA上的兩個CRP結(jié)合位點結(jié)合（lac系統(tǒng)中位于promoter上游），使得DNA彎曲90°，方便RNA聚合酶與DNA結(jié)合，從而使lac相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄。（注：CRP有兩個結(jié)構(gòu)域，一個為DNA結(jié)合域，另一個為轉(zhuǎn)錄激活域，可以與lac操縱元結(jié)合）

3、r-protein合成的自我調(diào)控：當rRNA存在的時候，r-protein與rRNA結(jié)合，mRNA的翻譯繼續(xù)；一旦沒有rRNA的話，r-protein積累，一個r-protein與mRNA結(jié)合并且阻止翻譯。

4、T4噬菌體p32蛋白的自調(diào)控循環(huán)：p32作為一種單鏈結(jié)合蛋白(SSB)與DNA中的單鏈結(jié)合，使自己繼續(xù)轉(zhuǎn)錄并且翻譯，一旦缺乏單鏈DNA，p32就會與mRNA上起始密碼子AUG附近的A-T富集區(qū)域結(jié)合，阻止核糖體的識別、翻譯。

5、嚴謹反應(yīng)（stringentresponse）：1）當細菌發(fā)現(xiàn)環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)不能使其合成足夠的蛋白時會大幅度的減弱一系列活性，這種反應(yīng)稱為嚴謹反應(yīng)。2）嚴謹反應(yīng)會減弱rRNA以及tRNA的合成，并且會使得兩種不尋常的核苷酸積累ppGpp、pppGpp，這些核苷酸是典型的小分子效應(yīng)因子，其通過與靶蛋白結(jié)合來改變蛋白活性。3）ppGpp由核糖體產(chǎn)生：當沒有相應(yīng)的氨酰-tRNA與相應(yīng)的密碼子結(jié)合的話，那么空載的tRNA就可以進入A位，這樣就阻斷了核糖體的移動，并且會激活無效反應(yīng)（idlingreaction），進入A位的空載tRNA還可以與嚴謹因子（stringentfactor）RelA結(jié)合，進而合成ppGPP。4）ppGpp的功能：其一為通過抑制操縱元中的啟動子來抑制編碼rRNA的轉(zhuǎn)錄，其二為減少噬菌體轉(zhuǎn)錄的延長階段（提前終止轉(zhuǎn)錄）。

6、枯草芽孢桿菌的色氨酸調(diào)控：1）trp存在時，trp與TRAP結(jié)合形成四聚體，從而與mRNA上的UAG或者GAG結(jié)合，使mRNA形成hairpin結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄終止，trp不再合成。2）trp缺失時，空載的tRNAtrp與mRNA結(jié)合，從而使其不能形成hairpin結(jié)構(gòu)，RNA聚合酶向前推進，轉(zhuǎn)錄anti-TRAPgene。之后，空載的tRNAtrp促進mRNA的翻譯，翻譯出的anti-TRAP將TRAP包裹起來，阻止其繼續(xù)發(fā)揮功能。

7、大腸桿菌的色氨酸調(diào)控模型：1）trp不存在時，核糖體在翻譯leaderpeptide時由于缺乏trp，因此核糖體停在trp處，從而使衰減子區(qū)域的part1與2配對，part3與part4配對，阻止part2與3形成hairpin結(jié)構(gòu)，RNA聚合酶順利轉(zhuǎn)錄。2）trp存在時，核糖體翻譯出leaderpeptide，繼續(xù)前進翻譯衰減子區(qū)域的part1，從而使part2與3形成hairpin結(jié)構(gòu)，RNA聚合酶脫落，核糖體解聚。

8、反義RNA用于抑制基因表達：反義基因轉(zhuǎn)錄反義mRNA，反義mRNA與mRNA配對阻止其發(fā)揮功能。

9、3種小RNA的調(diào)控模型：1）與RNA上的蛋白結(jié)合位點互補，阻止蛋白與目標RNA的結(jié)合。2）與目標RNA互補成雙鏈，之后被內(nèi)切酶識別，將目標RNA降解。3）與目標RNA互補，阻止其形成二級結(jié)構(gòu)。例子：Lin4編碼microRNA與lin14的mRNA互補，使其不能發(fā)揮功能。

10、RNAinterference（RNAi）與基因沉默相關(guān)：RNAi為雙鏈RNA導(dǎo)入細胞之后終止或者減弱目標基因的活性技術(shù)。DsRNA被切割成siRNA，siRNA與mRNA配對，之后核酸酶mRNA降解。

第八章、噬菌體策略

1、裂解由一系列的反應(yīng)來控制：裂解的三個階段：1）早期，噬菌體基因由宿主的RNA聚合酶編碼合成，中期需要的RNA聚合酶、σ因子以及抗終止子。2）中期，由早期產(chǎn)物中的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄中期基因，包括σ因子、結(jié)構(gòu)基因，復(fù)制酶等。中期的基因調(diào)控分為兩種，第一種在起始調(diào)控，那么早期基因的轉(zhuǎn)錄就與中期無關(guān)。若是以一種抗終止子的形式來調(diào)控，那么早期與中期的基因就會一起轉(zhuǎn)錄。3）晚期，晚期基因由中期基因產(chǎn)物來編碼，編碼結(jié)構(gòu)基因以及噬菌體組分。

2、T4以及T7噬菌體的基因組表現(xiàn)為功能上的簇狀：T4噬菌體中期的promoter缺乏-30區(qū)序列，但是有motA結(jié)合位點，通過與motA的結(jié)合來幫助RNA聚合酶與其識別。

3、λ噬菌體早期基因以及晚期基因與溶原性以及裂解循環(huán)相關(guān)：1）早早起基因包括N和cro，N編碼抗終止子，其與nut序列結(jié)合并進行抗終止作用。Cro有雙重功能，一方面阻止合成阻遏蛋白（repressor，阻遏蛋白是溶源性循環(huán)所必需的）。另一方面關(guān)閉早早起基因的表達。2）晚早期基因包括2個復(fù)制基因，7個重組基因以及3個調(diào)節(jié)子。CⅡ-CⅢ-pair與RNApolymerase結(jié)合，使cⅠ轉(zhuǎn)錄合成阻遏蛋白，調(diào)控溶原性。Q基因編碼一個抗終止子，其可以使宿主RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄晚期基因。

4、裂解循環(huán)依賴于抗終止子作用：1）pN為一個抗終止因子，其允許RNA聚合酶繼續(xù)轉(zhuǎn)錄兩個早早期基因（N以及cro）后面的晚早期基因。2）pQ為晚早期基因Q的產(chǎn)物，也是一個抗終止子，其允許RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄晚期基因。3）λ噬菌體的表達順序：λ噬菌體一旦進入宿主細胞，其基因組就會形成環(huán)狀，早早期基因N向左表達，早早期基因cro向右表達。剛開始宿主的RNA聚合酶分別從PL以及PRpromoter表達N以及cro，N轉(zhuǎn)錄mRNA進而翻譯產(chǎn)生pN蛋白。pN為抗終止子，作用位于N基因左側(cè)的nutL以及位于cro基因右側(cè)的nutR識別位點，使其繼續(xù)向后表達晚早期基因。N基因后面的基因為晚早期基因cⅢ、Rec基因，cro后面的為晚早期基因cⅡ、O、P、Q，pQ為抗終止子，作用于終止子tR3，是晚期基因表達，晚期基因位于晚早期基因Q之后，包括S、R、A、W以及Head&tail基因。

5、溶原性由阻遏蛋白（repressor）保持：1）cⅠ基因的突變不能保持溶原性。2）cⅠ基因編碼一種阻遏蛋白蛋白，其作用于OL以及OR操縱基因（operators）來阻斷早早期基因的轉(zhuǎn)錄。3）早早期基因啟動一個調(diào)控流程，其阻止裂解循環(huán)的進行。

6、阻遏蛋白以及其操縱基因決定了免疫區(qū)（immunityRegion）：1）一些λ噬菌體有著不同的免疫區(qū)。2）阻遏蛋白以及其旁邊的操縱基因，組成免疫區(qū)，防止其余λ噬菌體基因轉(zhuǎn)錄裂解期基因。（通過阻遏蛋白與OL以及OR的操縱基因相結(jié)合。之后其余的λ噬菌體會被限制在溶源期。）

7、阻遏蛋白的DNA結(jié)合形式為二聚體：1）一個阻遏蛋白單體有兩個獨特的區(qū)域。2）N-端為DNA結(jié)合位點。3）阻遏蛋白的C端為二聚化位點。4）與操縱基因的結(jié)合需要阻遏蛋白二聚化，因此兩個DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以同時與操縱基因結(jié)合。5）阻遏蛋白的N端與C端之間的切割可以導(dǎo)致與操縱基因的親和力下降，進而進入裂解循環(huán)。

8、阻遏蛋白使用Helix-turn-Helixmotif來與DNA結(jié)合：1）每一個阻遏蛋白都與DNA上操縱基因中的半位點（half-site）結(jié)合（類似于CRP）。2）阻遏蛋白的DNA結(jié)合位點包括兩個短的α-螺旋區(qū)，他們相繼和DNA的大溝結(jié)合。3）DNA結(jié)合位點為部分的回文序列。4）總結(jié)：操縱基因沿中間形成2個對稱的回文結(jié)構(gòu)，每個阻遏蛋白的N端識別一半回文序列。阻遏蛋白的N端由5段α-helix組成，2、3段結(jié)合DNA，3與DNA同面而2則穿過DNA的大溝。

9、識別螺旋決定DNA的特異性：1）識別螺旋上的氨基酸序列決定其與操縱基因上的特定序列結(jié)合。2）Helix-3主要靠氨基酸與暴露的堿基部分形成的氫鍵來與DNA結(jié)合。3）Helix-2除了靠氨基酸與磷酸骨架部分形成的氫鍵外，還靠氨基酸與磷酸骨架之間形成的離子間相互作用。4）從Helix-3determinesDNA-bindingspecificity這幅圖中可以分析得到，Repressor-OR1的repressor只有helix-3與DNA結(jié)合，Helix-2不結(jié)合。而Cro-OR3中，Helix-2有一個Thr與DNA結(jié)合，OR2的結(jié)合情況目前還不知道。

10、阻遏蛋白二聚體與DNA結(jié)合的協(xié)同作用：1）一個阻遏蛋白與DNA結(jié)合之后會增加第二個阻遏蛋白與DNA的親和力。2）OL1以及OR1的親和力是其它操縱基因的10倍以上。3）每個操縱基因都有三個阻遏蛋白結(jié)合位點

（OL1-OL3;OR1-OR3）每個結(jié)合位點之間為一小段A-T富集區(qū)，位點1對阻遏蛋白的親和力遠遠大于位點2以及位點3。阻遏蛋白首先與位點1結(jié)合，之后由于二聚體效應(yīng)會協(xié)助位點2與阻遏蛋白結(jié)合。位點1與部分promoter序列重疊，這使得阻遏蛋白一旦與位點1結(jié)合就會阻止RNA聚合酶與promoter的結(jié)合。

11、與OR2結(jié)合的阻遏蛋白可以與RNA聚合酶在PRMpromoter處相互作用：1）與OR2結(jié)合的阻遏蛋白的DNA-結(jié)合區(qū)與RNA聚合酶相互作用，并且將其穩(wěn)定在PRMPromoter處。這是阻遏蛋白自調(diào)控的基礎(chǔ)。2）Helix-2外部位于Helix-2和Helix-3之間的部分為負電荷，其可以與RNA聚合酶的σ70亞基相結(jié)合，σ70正好也與DNA的promoter的-35區(qū)相結(jié)合，這樣就使很少量的repressor也可以很高效的調(diào)節(jié)cⅠrepressor的轉(zhuǎn)錄。

12、協(xié)同作用增加了調(diào)控的敏感性：1）與OR1和OR2結(jié)合的repressor與OL1和OL2結(jié)合的repressor結(jié)合形成四聚體，使得OL3與OR3之間的cⅠ基因彎曲形成環(huán)狀，從而方便cⅠ基因的表達翻譯。2）一旦OL3以及OR3與repressor結(jié)合，因為OR3與cⅠpromoter有重疊部分，因此，cⅠ基因的RNA聚合酶不能再與OR3以及OR2上的repressor結(jié)合導(dǎo)致cⅠ基因合成終止。

13、cⅡ以及cⅢ基因與建立溶原性相關(guān)：1）晚早期基因產(chǎn)物cⅡ以及cⅢ是RNA聚合酶在PREpromoter處啟動轉(zhuǎn)錄所必需的。2）cⅡ直接與promoter作用，而cⅢ保護cⅡ不被降解。3）從PRE開始的轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致repressor的合成并且阻斷了cro的轉(zhuǎn)錄。4）事實上，在λ噬菌體進入宿主細胞后，宿主細胞中并沒有repressor。因此，RNA聚合酶均可以與PL以及PRpromoter結(jié)合，從而轉(zhuǎn)錄早早期N基因以及cro基因。N基因翻譯出pN抗終止子蛋白，從而與nutL、nutR序列結(jié)合，開始轉(zhuǎn)錄晚早期基因cⅢ以及cro后面的cⅡ。CⅡ蛋白與RNA聚合酶結(jié)合，從而使其與cro以及cⅡ基因之間的PREpromoter結(jié)合，向反方向轉(zhuǎn)錄cro的反義鏈，一直轉(zhuǎn)錄到cⅠ基因。其中，cro基因的反義mRNA與cro的正義mRNA鏈雜交，使其不能發(fā)揮功能，阻止λ噬菌體進入裂解期。而cⅠ基因的mRNA則翻譯出repressor

開始進入溶源性的自我調(diào)控循環(huán)。由于cⅡ蛋白極不穩(wěn)定，會被宿主的HflA蛋白降解。因此cⅢ蛋白與cⅡ蛋白結(jié)合，穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)，防止其被HflA蛋白降解。

14、一個弱啟動子需要cⅡ蛋白：1）PRE有著不尋常的-10、-35區(qū)序列。2）RNA聚合酶只有在cⅡ蛋白存在的情況下才會與PREpromoter結(jié)合。3）cⅡ蛋白與-35區(qū)附近的序列結(jié)合。4）總結(jié)：PREpromoter天生有缺陷，其-10區(qū)的一致性很差而且-35區(qū)沒有一致性序列，這就使得PREpromoter自身無法直接與RNA聚合酶結(jié)合。CⅡ蛋白可以與PREpromoter上的-25~-45區(qū)相結(jié)合，覆蓋了promoter的-35區(qū)，因此在cⅡ蛋白的幫助下，PREpromoter可以與RNA聚合酶形結(jié)合。Bytheway，RNA聚合酶同樣覆蓋了promoter的-10區(qū)。

15、溶源性需要一些列的事件來完成：1）cⅡ以及cⅢ導(dǎo)致repressor的合成以及激活了對晚期基因的抑制作用。2）

阻遏蛋白與OL1以及OR1結(jié)合進而關(guān)閉了早早期以及晚早期基因的表達。3）阻遏蛋白開啟了自身合成循環(huán)。4）λDNA在建立溶源性的最后一步中整合到細菌染色體上。5）總體過程：λ噬菌體開始侵入→N，cro表達→cⅡ、cⅢ表達→λ噬菌體位點特異性重組插入到細菌染色體中→啟動repressor自主性調(diào)控。6）cⅡ蛋白維持溶源性的措施：1、cⅡ蛋白啟動Panti-Q’promoter的轉(zhuǎn)錄。Panti-Q’promoter位于Q基因內(nèi)部。其轉(zhuǎn)錄出Q基因的反義mRNA，與正義mRNA

形成雜交雙鏈，阻止Q基因發(fā)揮功能。2、cⅡ蛋白啟動PRE到cro反義mRNA的表達，阻止cro基因發(fā)揮功能。3、補充：cⅡ蛋白除了可以與PREpromoter作用維持溶源性之外還可以與int基因的啟動子PI’相作用，原理同PRE一樣。CⅢ-cⅡ與RNA聚合酶結(jié)合從而使int基因轉(zhuǎn)錄，噬菌體進入插入環(huán)節(jié)。

16、什么決定了溶源性以及裂解循環(huán)之間的平衡？λ噬菌體是否進入裂解期取決于cro還是repressor占領(lǐng)操縱基因。若是細菌在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上生長，那么細菌中的蛋白酶活性高，另一方面cⅢ對cⅡ蛋白具有雙重性，其雖然可以幫助cⅡ抵抗宿主細胞中蛋白酶的進攻，但其并不能完全保證cⅡ不被降解。綜合上面兩方面原因，宿主細胞中的蛋白酶一旦降解cⅡ蛋白，那么對cro的抑制就解除了。那么cro就開始編碼cro蛋白。Cro蛋白首先與OR3操縱基因結(jié)合，從而阻止repressor與其結(jié)合，間接抑制了RNA聚合酶與repressor的結(jié)合，終止了溶源性的自主循環(huán)。之后cro蛋白與OR1、OR2以及OL1、OL2操縱基因結(jié)合，關(guān)閉了早期基因的表達。之后進入裂解期基因的表達。

PARTⅢ真核基因表達體系

第九章真核細胞的啟動子以及增強子（PromotersandEnhancers）

1、原核生物和真核生物轉(zhuǎn)錄起始的區(qū)別：原核轉(zhuǎn)錄以及真核轉(zhuǎn)錄的主要區(qū)別是RNA聚合酶以及輔助因子。細菌中，RNA聚合酶直接識別promoter中鄰近起始位點的短的一致性序列。在某些情況下，輔助因子可以幫助或者穩(wěn)定RNA聚合酶與promoter的結(jié)合。而在真核中，promoter中的短一致性序列位于起始位點的上游，與原核不同，其promoter由轉(zhuǎn)錄因子識別而不是RNA聚合酶。轉(zhuǎn)錄因子僅參與轉(zhuǎn)錄的開始階段。RNA聚合酶通過與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合而與起始位點結(jié)合。

2、真核生物的RNA聚合酶包括：三種類型，每一種都轉(zhuǎn)錄不同的RNA聚合酶。RNA聚合酶Ⅰ轉(zhuǎn)錄rRNA，RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄mRNA，RNA聚合酶Ⅲ轉(zhuǎn)錄tRNA以及其他小RNA。每一種RNA聚合酶都與其相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子相互作用，RNA聚合酶Ⅰ以及Ⅲ的轉(zhuǎn)錄因子相對簡單，而RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄因子比較復(fù)雜，其組成的復(fù)合體稱為basalapparatus。

3、RNA聚合酶Ⅱ的啟動子特征：所有的RNA聚合酶Ⅱpromoters都有著靠近起始位點的序列元件，并且與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合形成basalapparatus，之后啟動轉(zhuǎn)錄。在上游遠一些的序列決定promoter是否在特定細胞類型中表達。管家基因的上游序列元件被無處不在的activators識別。

4、增強子：增強子是起始過程中另一種類型。它是一段可以激活起始的序列，但是其分布在距離起始位點較遠的地方。增強子元件經(jīng)常作為組織特異性或者是時序調(diào)控的位點。

5、真核的RNA聚合酶由很多亞基組成：1）RNA聚合酶Ⅰ在核仁處合成rRNA。2）RNA聚合酶Ⅱ在核質(zhì)中合成mRNA。3）RNA聚合酶Ⅲ在核膜上合成小RNA。4）所有的真核RNA聚合酶有12個亞基并且能夠達到500kD。5）RNA聚合酶Ⅱ最大的亞基有一個CTD（carboxy-terminaldomain）由多個七聚體組成。5）RNA聚合酶Ⅱ在核質(zhì)區(qū)合成mRNA以及hnRNA，其包含CTD區(qū)（羧基-端結(jié)構(gòu)域），其由7個氨基酸組成重復(fù)型一致性序列組成，可以被高度磷酸化ser/thr，從而參與起始反應(yīng)。

6、RNA聚合酶Ⅰ有著兩種promoter組成：1）RNA聚合酶Ⅰ的promoter由一個核心promoter以及一個上游控制元件組成（UPE）。2）UBF1因子將DNA旋轉(zhuǎn)從而使得核心promoter以及UPE接近。3）SL1包括TBP因子，其可以參與到三種RNA聚合酶的起始轉(zhuǎn)錄過程中。4）RNA聚合酶在核心promoter與UBF1-SL1復(fù)合體結(jié)合。5）真核的RNA聚合酶Ⅰ的promoter由核心啟動子序列組成，核心啟動子包圍轉(zhuǎn)錄起始點，從-45區(qū)~+20區(qū)均為G-C富集序列，而靠近起始位點的位置有部分A-T富集序列，被稱為Inr序列。其上游為UPE元件，為G-C富集序列，可以與UBF結(jié)合，UBF使得UPE彎曲，從而增加與核心promoter的親和力。SL1因子與UBF相連，同時也與corepromoter相連。TBP與RNA聚合酶結(jié)合，但是不直接與corepromoter相結(jié)合。

7、RNA聚合酶Ⅲ使用下游以及上游的promoter：1）RNA聚合酶Ⅲ有兩種promoter。2）內(nèi)部啟動子由轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)的短的一致序列組成。并且使得起始發(fā)生在上游固定的位置。3）上游promoter在起始位點附近包含3個短的一致序列，而且其被轉(zhuǎn)錄因子包圍。4）總結(jié)：RNA聚合酶Ⅲ轉(zhuǎn)錄5s基因promoter位于內(nèi)部，轉(zhuǎn)錄起始點下游。轉(zhuǎn)錄SnRNA的位于起始點的上游。RNA聚合酶Ⅲ的promoter是分隔的，位于起始點下游的分別為boxA以及boxB?？偣灿腥N類型的聚合酶Ⅲ啟動子，類型1為起始點下游分隔boxA以及boxC。類型2為起始點下游分隔boxA以及boxB。類型

3為起始點上游分隔Oct、PSE以及TATAbox。

8、TFⅢB為聚合酶Ⅲ的定型（commitment）因子：1）TFⅢA以及TFⅢC與一致性序列相結(jié)合并且使得TFⅢB能夠與起

始位點結(jié)合。2）TFⅢB包括TBP亞基，并且其與RNA聚合酶相結(jié)合。3）聚合酶Ⅲ的類型2的promoter中首先是TF

ⅢC與起始位點下游的boxA以及boxB相結(jié)合。之后起始位點上游TFⅢB與TA

TAbox相結(jié)合。TFⅢC脫落，TFⅢB與TBP組成的起始復(fù)合體與聚合酶Ⅲ相連。其中，TFⅢA/C為組裝因子或被稱為轉(zhuǎn)錄因子。4）類型1promoter使用TFⅢA/C，其中，TFⅢA首先與boxA序列結(jié)合，之后招募TFⅢC與boxC相結(jié)合，之后TFⅢB與起始點上游的TATAbox結(jié)合，TFⅢA/C脫落，TFⅢB與TBP組成的起始復(fù)合體與聚合酶Ⅲ相結(jié)合。

9、RNA聚合酶Ⅱ的起始位點：1）RNA聚合酶Ⅱ需要一般的轉(zhuǎn)錄因子（稱為TFⅡX）來起始轉(zhuǎn)錄。2）RNA聚合酶Ⅱ

的promoters一般由一個短的保守序列Py2CAPY5（起始子InrR）在起始位點。3）TATAbox為RNA聚合酶Ⅱ啟動子的常規(guī)組成成分，并且還包含一個A-T富集的四聚體區(qū)域位于起始位點上游25bp處。4）DPE為RNA聚合酶Ⅱ的常規(guī)組成成分，這種啟動子其不含TATAbox。5）RNA聚合酶Ⅱ的核心啟動子一般包含Inr以及TATAbox或者一個DPE。

10、TBP為一個廣泛（Universal）因子：1）TBP是一個位點識別因子，每一種類型的RNA聚合酶都需要其與promoter相結(jié)合。2）RNA聚合酶Ⅱ的TFⅡD包括TBP以及11個TAFs。3）聚合酶Ⅱ的promoter中，TFⅡD單獨與TATAbox結(jié)

合。TFⅡD包含TTATA-結(jié)合蛋白TBP以及TBP-結(jié)合因子TAFs，不含TATAbox的promoter不需要其他蛋白組成的復(fù)合

體來與DNA相連。

11、TBP與DNA以一種不尋常的方式結(jié)合：1）TBP與DNA小溝上的TATAbox結(jié)合。2）TBP將DNA彎曲80°形成馬蹄形。3）有一些TAFs組裝組氨酸可能形成組氨酸八聚體。具體來說為TAFⅡ42以及TAFⅡ62與H3以及H4組成復(fù)

合體，幫助TFⅡD與DNA的結(jié)合。

12、BasalApparatus在啟動子附近組裝：1）TFⅡD與TATAbox的結(jié)合是起始的第一步。2）其他轉(zhuǎn)錄因子以一定的順

序與復(fù)合體結(jié)合，延長受保護的DNA的長度。3）當RNA聚合酶Ⅱ與復(fù)合體結(jié)合后，轉(zhuǎn)錄就開始。4）TATA-boxpromoter的啟動轉(zhuǎn)錄過程：TFⅡD與DNA小溝結(jié)合，TFⅡA與TAF230結(jié)合，激活TBP。之后TFⅡB與彎曲后的DNA結(jié)合，包括

TATA下游序列以及上游的BRE序列。并且TFⅡB對RNA聚合酶Ⅱ起到定位的作用。TFⅡF通過自身與TFⅡD復(fù)合體的

結(jié)合，從而知道RNA聚合酶Ⅱ與復(fù)合體的結(jié)合。TBP、TAFs均可以與RNA聚合酶Ⅱ的CTD尾相互作用。5）TATA-box缺失的promoter中，TFⅡD中的TAFs與Inr以及下游的DPE序列相結(jié)合，類似于聚合酶Ⅰ以及聚合酶Ⅲ的過程。

13、啟動轉(zhuǎn)錄之后跟隨的是啟動子的清空：1）TFⅡE以及TFⅡH參與DNA的解旋來允許聚合酶的移動。2）磷酸化CTD

可以啟動延長過程。3）對于某些啟動子來說，進一步磷酸化CTD可以終止流產(chǎn)起始。4）CTD可以調(diào)控RNA轉(zhuǎn)錄的過程。5）總結(jié)：RNA聚合酶Ⅱ想要進一步轉(zhuǎn)錄還需要3個轉(zhuǎn)錄因子，TFⅡH以及TFⅡJ和TFⅡE。TFⅡE與復(fù)合體的結(jié)合

使下游到+30的序列被保護起來，而TFⅡH及TFⅡJ的加入并不改變DNA結(jié)合的模式。TFⅡH有多種酶的活性，包括ATPase、

解旋酶、以及CTD序列的激酶活性。TFⅡH還具有DNA的修復(fù)功能。其中，TFⅡH的XPB亞基涉及DNA解旋。而TFⅡE的ATPase及TFⅡH的解旋酶活性共同使DNA解旋，并開始轉(zhuǎn)錄。TFⅡH是CTD尾部磷酸化，但是如果沒有其他因子

的幫助，聚合酶Ⅱ開始轉(zhuǎn)錄一小段就會從DNA上脫落，那一小段RNA也會被迅速的降解。但是這也與細菌中的流產(chǎn)序列不同。若要使RNA聚合酶Ⅱ進入延長階段，則需要P-TEFb激酶進一步磷酸化CTD尾部。一旦進入到延長階段，那么起始復(fù)合體就會脫落，只剩下磷酸化CTD尾的RNA聚合酶Ⅱ在DNA上移動。

CTD尾部的磷酸化與許多過程相關(guān)聯(lián)，磷酸化CTD尾部可以與鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶相結(jié)合（cappingenzyme）。磷酸化的CTD還可以與SCAFs蛋白相結(jié)合SCAFs蛋白再與剪切因子相結(jié)合。磷酸化的CTD還可以與多聚腺嘌呤作用的酶結(jié)合從而介導(dǎo)加polyA尾的反應(yīng)。奇怪的是加polyA尾的酶在一開始就與CTD相結(jié)合，這說明RNA聚合酶Ⅱ從一開始就已經(jīng)具備了加A尾的能力。

14、轉(zhuǎn)錄以及修復(fù)之間的聯(lián)系：1）當轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)生錯配現(xiàn)象時，修復(fù)在RNA聚合酶停止之前就已經(jīng)完成了修復(fù)工作。2）TFⅡH參與修復(fù)過程。3）TFⅡH的XPD亞基的突變會產(chǎn)生三種人類疾病。4）原核的轉(zhuǎn)錄修復(fù)系統(tǒng)：轉(zhuǎn)錄過程

中出現(xiàn)錯誤之后，RNA聚合酶會在錯配位點暫停轉(zhuǎn)錄，Mfd蛋白與暫停的RNA聚合酶結(jié)合。首先Mfd蛋白替代RNA聚合酶與DNA結(jié)合，之后其與UvrABC修復(fù)酶結(jié)合，進行剪切-修復(fù)。DNA修復(fù)完成之后，下一個RNA聚合酶與DNA重新結(jié)合進行轉(zhuǎn)錄。5）真核的轉(zhuǎn)錄修復(fù)系統(tǒng)：真核中TFⅡH包含XPC亞基，其可以識別受損傷的DNA并在內(nèi)切酶復(fù)

合體（XPG、XPF以及ERCC1）的幫助下在RNA聚合酶停止轉(zhuǎn)錄之前將錯誤修復(fù)。

15、核心啟動子上游調(diào)控元件及其結(jié)合的調(diào)控蛋白：RNA聚合酶Ⅱ的啟動子包含兩種區(qū)域，起始位點自身包含在Inr中以及有/無TATAbox。在起始位點上游較遠的序列處包含一種能與激活子結(jié)合提高轉(zhuǎn)錄效率的序列被稱為增強子。

16、短序列元件與激活子相結(jié)合：真核轉(zhuǎn)錄影響啟動子轉(zhuǎn)錄效率的序列分布在3個區(qū)域，-30區(qū)的TATAbox，這個序

列影響效率最低。-75區(qū)的CAATbox，該區(qū)域決定啟動子的效率但是不影響其特異性。還有-90區(qū)域的GCbox。與這些區(qū)域結(jié)合的因子被稱為激活子。

17、啟動子序列短序列的分布是有彈性的但是內(nèi)容最重要：1）沒有那個上游元件對啟動子來說是必需的，雖然多了會提高啟動子的轉(zhuǎn)錄效率。2）有些元件受多個因子調(diào)控。一個激活子結(jié)合的序列通常小于10bp。

18、增強子由兩個方向的元件組成：1）增強子激活離它最近的啟動子，并且其可以在啟動子上游以及下游的任意距離。2）酵母中的UAS（上游激活子序列）類似于增強子，但是其只在啟動子上游的時候發(fā)揮作用。3）啟動子與增強子有著相似的序列。4）增強子組成激活子的復(fù)合體，其直接或者間接的與啟動子作用。5）從操作層面上，我們把DNA上位于起始位點固定的序列稱為啟動子。這樣的話TATAbox以及其他上游元件就都包含在內(nèi)了，但是增強子不包含在內(nèi)。

19、增強子與啟動子有著相似的序列：1）增強子中一致序列的密度比啟動子中要高，與啟動子不同的是，增強子對于激活子有著更強的結(jié)合能力，其可以形成增強體（enhanceosome）。

20、增強作用通過增加啟動子附近的激活子密度來實現(xiàn)：增強子通常以順式構(gòu)象對target啟動子起作用。增強子可以改變模板整體的結(jié)構(gòu)，例如影響超螺旋的密度，他還可以將模板定位到核質(zhì)中，同時增強子還可以為RNA聚合酶或其他蛋白提供一個在染色體上的初始結(jié)合位點。增強子最重要的功能可能是增加啟動子附近激活子的密度，其功能可以被絕緣子阻斷。

21、基因表達通常與去甲基化相連：基因5’末端的去甲基化通常是轉(zhuǎn)錄所必需的。

22、CpG島為調(diào)控位點：1）CpG島環(huán)繞著那些組成型表達的基因的啟動子，當他們?nèi)ゼ谆驝pG島嶼會表達。2）CpG島同樣在那些組織-調(diào)控型基因中找到。3）人類基因組中有著29,000個CpG島。4）CpG島的甲基化阻止其包圍的啟動子的轉(zhuǎn)錄。5）抑制蛋白與甲基化的CpG島結(jié)合同樣會起到抑制轉(zhuǎn)錄的作用。

第十章轉(zhuǎn)錄激活

1、簡介：2個問題，1、轉(zhuǎn)錄因子如何鑒別目標基因？

2、轉(zhuǎn)錄因子活性的激活是內(nèi)部還是外部信號？

2、轉(zhuǎn)錄因子的幾種類型：1）basalapparatus決定轉(zhuǎn)錄的起始。2）激活子決定轉(zhuǎn)錄的效率。3）激活子通過protein-protein接觸來與basalfactor作用。4）激活子可能通過輔助激活子（coactivators）來起作用。5）有一些轉(zhuǎn)錄組分通過改變?nèi)旧w結(jié)構(gòu)來起作用，例如氨?；?。6）basalfactor：基礎(chǔ)因子，與起始位點以及TATAbox結(jié)合，并且與RNA聚合酶組成起始復(fù)合體。7）activators：激活因子，通過與啟動子或者是增強子上的特定短致性序列結(jié)合來增加basalapparatus與RNA聚合酶之間結(jié)合的效率。并且有的有組織-特異性。與激活子相結(jié)合的序列被稱為相應(yīng)元件（responseelement）。8）與細菌相比，真核系統(tǒng)只有basalfactor直接與RNA聚合酶相互作用，而細菌中所用的轉(zhuǎn)錄因子都必須直接與RNA聚合酶起作用。

3、激活子有著獨立的DNA結(jié)合域以及轉(zhuǎn)錄激活域：1）DNA結(jié)合活性以及轉(zhuǎn)錄激活活性由激活子獨立的區(qū)域承擔。2）激活子的DNA-結(jié)合域使得轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域接近啟動子。3）總結(jié)：激活子由DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域組成。DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域與啟動子、增強子以及其他調(diào)控序列中的一致序列結(jié)合，為激活結(jié)構(gòu)域提供一種“栓系”功能，從而確保激活結(jié)構(gòu)域能夠接近起始復(fù)合體。2個結(jié)構(gòu)域之間具有獨立性，可以分開。激活子中DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域之間是通過共價連接的。而激活子與輔助激活子之間是非共價連接的。4）實驗證明：GAL4DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及LexADNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的互換實驗。HIV中的tar蛋白只與RNA中的tar序列結(jié)合從而激活轉(zhuǎn)錄。

4、激活子與basalapparatus相互作用：1）所有的激活子都是DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域決定target啟動子或者增強子的特異性。2）沒有激活結(jié)構(gòu)域的激活子通過與輔助激活因子結(jié)合來啟動轉(zhuǎn)錄激活。3）激活子與basalapparatus中的TF

D

Ⅱ

D與TATAbox中的TAFs相互作用，這也是TAFs的主要功能。不同的TAFs與不同的激活子作用。這一反應(yīng)不僅幫助TF

Ⅱ

結(jié)合，同時也幫助形成TF

D-TATAbox周圍的復(fù)合體。4）酵母中對應(yīng)GAL4以及Gcn4啟動子的為酸性激活子（因為

Ⅱ

B直接相互作用。5）激活子到底是怎樣激活轉(zhuǎn)錄的？1、model1表明激活子單其帶負電）。VP16激活子可以與TF

Ⅱ

獨的作用是增加RNA聚合酶在啟動子附近的有效濃度。2、model2表明激活子還可以一步一步的聚集輔助激活子。Basalfactor進而組成一個復(fù)合體-mediator，其可以與RNA聚合酶的C-端的CTD結(jié)構(gòu)域相互作用，這樣可以將激活/抑制信號從聚合酶上游組分傳至RNA聚合酶之后。Mediator在延長階段可能脫落。還有一些轉(zhuǎn)錄因子可以操縱染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)。

5、一些啟動子-結(jié)合蛋白為阻遏蛋白：抑制作用通常是影響染色體結(jié)構(gòu)，確實有阻遏蛋白通過與特定的啟動子結(jié)合。之后全是例子：1、球狀阻遏蛋白NC2/Dr1/DRAP1為異源二聚體，其與TBP蛋白結(jié)合從而阻止其他basalapparatus相

互作用。2、海膽的H2B啟動子中，在胚胎期，其CAATbox序列與CAAT-displacementprotein（CDP）結(jié)合，從而阻止basalfactor（Oct1/CTF）與之結(jié)合，阻止promoter下游基因的表達。

6、激活子識別響應(yīng)元件：1）響應(yīng)元件位于啟動子以及增強子中。2）每一個響應(yīng)元件都與特定的激活子結(jié)合。3）響應(yīng)元件包括HSE：heatshockresponse。GRE：腎上腺皮質(zhì)激素。SRE：血清應(yīng)答元件。

7、DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多種類型：1）激活子可以通過DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域來分類。2）分類：1、鋅指結(jié)構(gòu)（zincfinger）：這一結(jié)構(gòu)最初是在TFⅢA中發(fā)現(xiàn)的是RNA聚合酶Ⅲ轉(zhuǎn)錄5srRNA基因所必需的因子。2、類固醇受體（steroidreceptor）：這類因子一直保持失活狀態(tài)，直到與一個小的配體結(jié)合，才會啟動其活性。3、helix-turn-helixmotif：最初在噬菌體repressor的DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)。一個α-helix與DNA大溝結(jié)合，另一個穿過DNA的雙鏈。4、helix-loop-helixmotif（HLH）最初在一些發(fā)育調(diào)控因子中發(fā)現(xiàn)，剛開始合成2個亞基，處于inactive的狀態(tài)，當改變一個亞基之后，其變成有活性狀態(tài)。5、亮氨酸拉鏈（LeucineZippers）：由一串氨基酸組成，每7個氨基酸有一個Leucine殘基，2條LeucineZipper多肽鏈組成一個二聚體。6、同源異形結(jié)構(gòu)域（homeodomain）：屬于一種組織特異性的因子，在特定細胞中激活，合成homeo-蛋白，之后，其啟動特定基因的轉(zhuǎn)錄。3）激活子的調(diào)控機制：1、組織特異性合成homeo-蛋白。2、磷酸化激活：HSTF熱激轉(zhuǎn)錄因子去磷酸化激活。3、加配體激活：steroidrecepters（類固醇受體），加上配體后可以影響蛋白的定位，導(dǎo)致該蛋白從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到核中。4、釋放抑制因子（inhibitor）激活：NF-kB在細胞質(zhì)中與inhibitor結(jié)合保持其失活狀態(tài)，其釋放inhibitor之后進入激活狀態(tài)，進入核中啟動轉(zhuǎn)錄。5、改變配體激活：HLH6、切割釋放激活因子：sterolresponse失活的蛋白位于核膜/ER膜上，當缺乏固醇時，切除膜上蛋白，釋放factor進入核內(nèi)激活。

8、鋅指結(jié)構(gòu)包括DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域：1）鋅指結(jié)構(gòu)包括23個氨基酸的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，鋅指結(jié)合位點由His以及Cys氨基酸組成。2）鋅指蛋白通常由多個鋅指組成。3）每一個鋅指c-端組成一個α-helix進而與DNA的大溝結(jié)合。4）有一些鋅指蛋白與不僅會與DNA結(jié)合還會與RNA結(jié)合。5）有兩種類型的DNA

-結(jié)合蛋白有這樣的鋅指結(jié)構(gòu)，一種為經(jīng)典的鋅指結(jié)構(gòu)，另一種為steroidreceptors。鋅指結(jié)構(gòu)的中心為Zn2+，周圍由His以及Cys組成四聚體結(jié)構(gòu)。鋅指結(jié)構(gòu)通常幾個連在一起，每兩個鋅指結(jié)構(gòu)之間有7-8個氨基酸連接。鋅指結(jié)構(gòu)的C端形成α-helix，而N端形成β-sheet。每個α-helix與DNA序列有2個結(jié)合點。有的鋅指結(jié)構(gòu)不僅會和DNA結(jié)合，A不光與5s基因結(jié)合，還與5srRNA結(jié)合。轉(zhuǎn)錄起始因子elF2β，與起始密碼子結(jié)合。還會與RNA結(jié)合，例如TF

Ⅲ

9、steroidreceptors有鋅指結(jié)構(gòu)：1）steroidrecepors的DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域有一種鋅指結(jié)構(gòu)，其只有Cys但是沒有His殘基。2）腎上腺皮質(zhì)激素以及雌激素受體由兩個鋅指結(jié)構(gòu)組成，第一個鋅指結(jié)構(gòu)識別DNA中的回文序列，第二個鋅指結(jié)構(gòu)控制鋅指二聚體與DNA之間的空間距離。

10、與配體結(jié)合激活與響應(yīng)元件的結(jié)合：配體與激活子的C端結(jié)構(gòu)域的結(jié)合增加了激活子DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域與DNA

之間的親和力。

11、steroidrecepors通過combinatoralcode識別響應(yīng)元件：1）受體識別的響應(yīng)元件由2個短重復(fù)序列組成，或者是半位點（half-site），半位點可以是回文序列也可以是同向重復(fù)序列。2）第一個鋅指結(jié)構(gòu)識別半位點，第二個鋅指結(jié)構(gòu)用于二聚化，來決定亞基之間的距離。3）同源二聚體識別回文序列，異源二聚體識別同向重復(fù)序列。4）受體分為兩種類型：1、GR（腎上腺皮質(zhì)激素）、MR（鹽皮質(zhì)激素）、AR（雄性激素）、PR（孕酮）均組成同源二聚體，它們識別的響應(yīng)元件的半位點有一致性序列TGTTCT，以回文序列形式排列。ER（雌激素）的模式與上述一樣，但識別的序列為TGACCT。2、RXR（9-順-視黃素）、T3R（甲狀腺激素）、VDR（維生素D）、RAR（視黃素）。這些受體組成的二聚體識別的一致性序列為TGACCT，以同向重復(fù)形式存在。這些受體還可以組成同源二聚體來識別回文序列。（注：RXR為配體激活型受體。）

5）steroidreceptors如何激活轉(zhuǎn)錄？它們不是直接與basalapparatus作用，而是通過與coactivators復(fù)合體作用間接啟動轉(zhuǎn)錄。例子：steroidreceptors、TR以及RAR在缺乏配體的情況下與SMRTcorerepressor結(jié)合。一旦與配體結(jié)合，那么SMRT就會被coactivators復(fù)合體替換，從而與basalapparatus相結(jié)合而啟動轉(zhuǎn)錄。

12、同源域（homeodomain）與DNA上的相關(guān)位點結(jié)合：1）同源域是一個由60個氨基酸組成的DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中包含3個α-helix。2）α-helix3的C端由17個氨基酸組成，并且插入DNA的大溝中。3）同源域的N端插入到DNA的小溝中。4）包含同源域的蛋白有可能是activator也有可能是轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白。

13、helix-loop-helix蛋白與組合起來的附件（accessory）相互作用：1）helix-loop-helix蛋白由40-50個氨基酸組成2個兩性的α-helix。中間被15-16個殘基組成的環(huán)隔開。2）α-helix的主要功能是形成二聚體。3）bHLH蛋白有一個basicsequence，其鄰近HLHmotif，對DNA-結(jié)合起作用。4）bHLH蛋白分為兩種，classA/B，classA普遍表達，classBbHLH蛋白為組織特異性。5）classB通常與classA蛋白組成異源二聚體。6）HLH一旦缺乏basic區(qū)的話，那么就會

阻止HLH與DNA的結(jié)合。

14、亮氨酸拉鏈涉及二聚體的形成：1）亮氨酸拉鏈為一種兩性helix。疏水的亮氨酸殘基位于中間。帶正電的basicregion與DNA結(jié)合，兩個亮氨酸拉鏈組成一種Y形結(jié)構(gòu)。2）二聚化模式為bZIPmotif。

第十一章RNA剪切

1、簡介：1）因轉(zhuǎn)錄出的最初的RNA十分不穩(wěn)定，并且序列上的差異性也很大，這種RNA被稱為核不均一RNA（hnRNA）。其包含前體mRNA以及其他轉(zhuǎn)錄本。hnRNA的物理形態(tài)通常與蛋白結(jié)合形成復(fù)合體。被稱為核蛋白顆粒（hnRNP）。2）幾個問題：1、怎樣確保內(nèi)含子序列被準確的切除？

2、內(nèi)含子從前導(dǎo)序列上被切除是按照特定的順序嗎？

3、成熟的RNA產(chǎn)物是否參與RNA的剪切過程？

3）幾種剪切的模型：1、蛋白、RNA等組成的剪切體（spliceosome）識別內(nèi)含子以及外顯子的交界處的短保守序列，從而切下內(nèi)含子。2、兩類RNA具有自調(diào)控能力，可以自己切割RNA。其區(qū)別在于二級/三級結(jié)構(gòu)的不同。3、酵母中tRNA的成熟需要復(fù)合體的切割以及連接。

2、細胞核中的spliceJunctions為短序列：內(nèi)含子的切割位點位于交界處，且處于內(nèi)含子中。總的模型為外顯子

1-5’GU…….branchsite..嘧啶富集區(qū)….AG3’-外顯子2。被稱為“GU-AGrule”。

3、splicejunction成對讀?。簝?nèi)含子剪切需要GU-AG成對存在。但內(nèi)含子的剪切并不一定按照其基因轉(zhuǎn)錄順序。

4、Pre-mRNAsplicingproceedsthroughalariat（前體mRNA的剪切通過形成套索結(jié)構(gòu)進行）：1）剪切過程：先切5’位點，之后5’內(nèi)含子的末端G會彎曲過來（向3’方向），與3’端上游的branchsite（分支序列）的2’-OH結(jié)合（第一次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)），形成5’-2’鍵。外形上酷似套索。（G與分支位點上的A結(jié)合）最后，切割3’端，兩端的外顯子接起來（第二次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)）。內(nèi)含子降解。2）branchsite在酵母菌中是高度保守的，其包含一致性序列UACUAAC。而在高等真核生物中，branchsite并不是那么具有保守性。但是其中一定包含與5’端形成5’-2’鍵的A。

3）切割內(nèi)含子過程中發(fā)生的化學反應(yīng)（2次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)）：1、branchsite中的A的2位上的-OH進攻5’G與外顯子1之間形成的磷酸二酯鍵，之后G與branchsite上的A形成5’-2’鍵。之前與G形成磷酸二酯鍵的外顯子1的3’端變?yōu)樯斐龅?OH。2、外顯子1伸出的-OH進攻與內(nèi)含子3’端相連的第二個外顯子的磷酸二酯鍵。兩個外顯子之間形成磷酸二酯鍵，內(nèi)含子以套索結(jié)構(gòu)脫落。

5、剪切需要snRNAs：1）剪切體（spliceosome）包括小核蛋白顆粒（snRNPs）之外還包含剪切所需要的額外的蛋白因子。2）小核蛋白顆粒（snRNPs）包括U1、U2、U5、U4以及U6。3）除了U6之外，這些snRNPs均包含一組由8個蛋白組成的核心（core）。這一核心可以與Sm蛋白結(jié)合。而Sm又可以被自身免疫抗血清的anti-Sm結(jié)合。被排除的U6則與Sm-Like蛋白結(jié)合。

6、U1snRNP起動剪切：1）U1snRNA的5’端有一段伸出的單鏈區(qū)，其可以與內(nèi)含子配對。配對區(qū)一旦突變，那么

U1snRNA就不能再與內(nèi)含子結(jié)合。2）Ecomplex包括與5’剪切位點結(jié)合的U1snRNP。U2AF蛋白與嘧啶富集區(qū)相結(jié)合。SR蛋白將U1snRNP以及U2AF結(jié)合起來。3）初始復(fù)合體（Ecomplex）的形成：1、U1snRNP以及ASF/SF2結(jié)合在5’剪切位點。2、U2AF蛋白結(jié)合在嘧啶富集區(qū)以及3’剪切位點處。3、SF1/BBP將U1snRNP和U2AF連接在一起。

7、E復(fù)合體可以分為內(nèi)含子決定型以及外顯子決定型：1）E復(fù)合體的形成有兩種形式：①內(nèi)含子決定型：即直接形成E復(fù)合體。U1snRNP與剪切位點結(jié)合，之后與上面初始復(fù)合體的形成一致。最后，U2snRNP與branchsite結(jié)合，形成A復(fù)合體。②外顯子決定型：內(nèi)含子較長或者剪切位點較弱時，3’剪切復(fù)合體跨越外顯子，與下游的外顯子5’剪切位點的U1snRNP結(jié)合。主要通過SR蛋白將U2AF與下游的U1snRNP結(jié)合起來。2）剪切增強子：位于3’剪切位點的下游，SR蛋白與剪切增強子序列相結(jié)合。

8、5種snRNPs組成剪切復(fù)合體（spliceosome）：1）完整的復(fù)合體形成及剪切全過程：①②為形成E復(fù)合體以及A復(fù)合體，過程前面已經(jīng)論及所以這邊就不再扯了。③形成A復(fù)合體之后，U5，U4/U6snRNP三聚體與A復(fù)合體結(jié)合形成B1復(fù)合體，此時的復(fù)合體中已經(jīng)包含所有的剪切成分，因此可以稱作剪切復(fù)合體（spliceosome）。④U1釋放，B1復(fù)合體轉(zhuǎn)變?yōu)锽2復(fù)合體，U5snRNP從5’剪切位點移動到內(nèi)含子序列附近。U6snRNP則與5’剪切位點結(jié)合。⑤U4釋放，這會觸發(fā)U6/U2pair轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，5’切割，套索結(jié)構(gòu)形成。U5與3’剪切位點的外顯子結(jié)合。⑥U2/U5/U6與套索結(jié)構(gòu)結(jié)合，3’位點切割，外顯子重連接。⑦被剪切的RNA釋放，套索結(jié)構(gòu)降解。2）U4與U6snRNA有一段互補序列。其相互結(jié)合時，U4會抑制U6的活性，一旦U4釋放，那么U6就會與U2配對，并且形成自身的U6發(fā)卡結(jié)構(gòu)。U2

與branchsite配對。這樣就會形成GroupⅡ類的自我剪切催化中心，催化3’剪切。3）蛋白與RNA的相互作用：PRP蛋白中PRP16為水解ATP的RNA解旋酶，能夠與剪切復(fù)合體短暫結(jié)合并參與第二次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。PRP22參與成熟的mRNA

從剪切體中的釋放。

9、有些生物使用其他的splicingapparatus：GU-AGrule占到大約98%，而AU-AC占0.1%。

10、剪切后緊