遺傳標(biāo)記在植物遺傳育種中的應(yīng)用遺傳標(biāo)記（geneticmarker）:指可追蹤染色體、染色體某一片段、某個(gè)基因座在家系中傳遞的任何一種遺傳特性。它具有兩個(gè)基本特征，即可遺傳性和可識(shí)別性；因此生物的任何有差異表型的基因突變型均可作為遺傳標(biāo)記。遺傳標(biāo)記的類型1.形態(tài)學(xué)標(biāo)記（morphologicalmarker）2.細(xì)胞學(xué)標(biāo)記(cytologicalmarker)3.生化標(biāo)記(biochemicalmarker)4.分子標(biāo)記(molecularmarker)：DNA標(biāo)記。即植物的外部形態(tài)特征。主要包括肉眼可見(jiàn)的外部特征，如：矮稈、紫鞘、卷葉等；也包括色素、生理特性、生殖特性、抗病蟲性等有關(guān)的一些特性。

優(yōu)點(diǎn)：形態(tài)標(biāo)記簡(jiǎn)單直觀、經(jīng)濟(jì)方便。

缺點(diǎn):(1)數(shù)量在多數(shù)植物中是很有限的。(2)

表現(xiàn)易受環(huán)境影響。(3)有一些標(biāo)記與不良性狀連鎖。(4)形態(tài)標(biāo)記的獲得需要通過(guò)誘變、分離純合的過(guò)程，周期較長(zhǎng)。形態(tài)標(biāo)記在作物遺傳育種中的作用是有限的。一、形態(tài)標(biāo)記（亞洲棉×陸地棉）雜種F1與其親本的形態(tài)特征比較

器

官A2G1A2A2G1G1(AD)1(無(wú))(AD)1×(A2G1)遺傳表現(xiàn)主莖粗

細(xì)較粗細(xì)較粗粗較粗近似[AD]1,A2茸

毛少而短多而長(zhǎng)多而長(zhǎng)少而長(zhǎng)多而長(zhǎng)偏向G1腺

體(個(gè)／cm2)272.590.0110.0066.4A2,G1葉片形

狀5裂卵圓3-5裂5裂卵圓裂葉[AD]1,A2,G1大

小較大小較大大較大近似[AD]1,A2色

澤深綠灰綠灰綠綠灰綠偏向G1茸

毛少而短多而長(zhǎng)多而長(zhǎng)少而短較多而長(zhǎng)偏向G1葉

柄長(zhǎng)短較短長(zhǎng)長(zhǎng)近似[AD]1,A2托

葉披針型劍狀披針型披針型披針型近似[AD]1,A2腺

體(個(gè)／cm2)44.7205.064.00131.0G1苞葉形

狀心臟型劍狀披針型寬心臟型心臟型近似[AD]1,A2大

小大小較大大較大近似[AD]1,A2苞外蜜腺無(wú)有有或無(wú)有有近似[AD]1,G1圍鈴狀態(tài)緊抱張開張開緊抱張開偏向G1腺

體(個(gè)／cm2)75.3182.095.3053.4A2,G1萼片大

小小較大較大大較大近似[AD]1,G1色

澤淺綠淺綠紅色黃綠綠超親上緣形狀微波狀線狀齒長(zhǎng)寬齒長(zhǎng)寬有齒寬齒長(zhǎng)[AD]1,G1互補(bǔ)腺

體(個(gè)／cm2)261.7157.5181.80128.0A2，G1花花冠顏色黃色,基部有紅斑淺粉紅,基部有紅斑粉紅色,基部有紅斑乳白色,基部無(wú)紅斑深粉紅色,基部有紅斑超親型大

小較大小小較大大超親型花藥顏色黃色白色黃色乳白色黃色偏向A2花

藥

數(shù)較多少較少多較少偏向G1二、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記即植物細(xì)胞染色體的變異。1.染色體數(shù)目（單體、缺體、三體、四體）

2.染色體結(jié)構(gòu)（缺失、重復(fù)、倒位、易位）

核型、帶型（1）核型和核型分析

核型體細(xì)胞染色體在光學(xué)顯微鏡下所有可以測(cè)定的表型特征的總稱。

主要包括染色體的數(shù)目與形態(tài)結(jié)構(gòu)特征兩大方面的內(nèi)容。染色體的數(shù)目包括染色體的基數(shù)、多倍體、非整倍體、超數(shù)染色體(B染色體,是存在于許多有機(jī)體中的額外染色體及染色體斷片)。染色體的形態(tài)主要包括染色體的絕對(duì)大小和相對(duì)大小、著絲點(diǎn)和次縊痕以及隨體的數(shù)目和位置等特征。

核型分析：核型分析就是指對(duì)核型的各種特征進(jìn)行定量和定性的表述。核型分析是分析染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)變異的基本手段之一。它在雜種細(xì)胞的染色體研究和基因定位，單個(gè)染色體的識(shí)別等方面具有重要意義。蠶豆的核型分析2n=12，染色體長(zhǎng)度：大小臂比：大小

核型分析內(nèi)容:

1.染色體的數(shù)目

2.染色體的形態(tài)核型分析的應(yīng)用:1.

植物的分類研究2.

探討物種的起源3.

外源染色體的檢測(cè)與驗(yàn)證雜種的真實(shí)性（2）帶型

特殊的染料、染色方法，使同一染色體的不同區(qū)段呈現(xiàn)不同的染色效果－帶型，各種分帶技術(shù)C、G、Q、R、N的出現(xiàn)，為染色體的精確鑒別提供了一條嶄新的途徑。人類染色體核型分析（Q帶）女男與形態(tài)標(biāo)記相比，細(xì)胞學(xué)標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)是能進(jìn)行一些重要基因的染色體或染色體區(qū)域定位。但細(xì)胞學(xué)標(biāo)記材料需要花費(fèi)較大的人力和較長(zhǎng)時(shí)間來(lái)培育，難度很大；同時(shí)某些物種對(duì)染色體變異反應(yīng)敏感；還有些變異難以用細(xì)胞學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)。因此到目前為止，真正應(yīng)用于作物遺傳育種研究中的細(xì)胞學(xué)標(biāo)記還很少。

利用電泳技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)、酶等生物大分子進(jìn)行鑒定。主要包括同工酶和等位酶標(biāo)記。同工酶：具有功能相同而結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)不同的一類酶。等位酶：同一基因座上的不同等位基因編碼的同工酶。種子貯藏蛋白的電泳分析已廣泛用于作物品種鑒別和種子純度鑒定。三、生化標(biāo)記

生化標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)：1.表現(xiàn)近中性，對(duì)植物經(jīng)濟(jì)性狀一般沒(méi)有大的不良影響。2.直接反映了基因產(chǎn)物差異，受環(huán)境影響較小。但目前可使用的生化標(biāo)記數(shù)量還相當(dāng)有限，且有些酶的染色方法和電泳技術(shù)有一定難度，因此其實(shí)際應(yīng)用受到一定限制。生化標(biāo)記的應(yīng)用1.生化標(biāo)記在品種純度和真實(shí)性鑒定上的應(yīng)用2.生化標(biāo)記在品種的親緣關(guān)系和分類研究上的應(yīng)用3.生化標(biāo)記在雜種優(yōu)勢(shì)的預(yù)測(cè)上的應(yīng)用4.生化標(biāo)記在抗性鑒定上的應(yīng)用5.生化標(biāo)記在品種鑒定上的應(yīng)用四、分子標(biāo)記以DNA多態(tài)性為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記。分子標(biāo)記的特點(diǎn)

1.直接以DNA的形式表現(xiàn)，表現(xiàn)穩(wěn)定。

2.數(shù)量多。

3.多態(tài)性高。

4.表現(xiàn)為中性，不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)。

5.許多標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性的特點(diǎn)，能區(qū)別純合體和雜合體。

6.成本不太高。分子標(biāo)記的類型及原理1.以分子雜交為基礎(chǔ)的DNA標(biāo)記技術(shù)。限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Restrictionfragmentlengthpolymorphisms，RFLP），可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列（Variablenumberoftandemrepeats，VNTR），原位雜交（insituhybridization，ISH）2.以PCR為核心的分子標(biāo)記技術(shù)。RAPD、SSR、STS。3.新型的分子標(biāo)記。SNP、Indel等。原位雜交PCRMelting94oCMelting94oCAnnealingPrimers50oCExtension72oCTemperature100050Time30x5’3’3’5’3’5’5’5’3’5’3’5’5’5’5’5’3’3’5’3’5’5’3’5’3’5’PCRMelting94oCTemperature100050Time5’3’3’5’PCRMelting94oCTemperature100050Time3’5’5’3’HeatPCRMelting94oCAnnealingPrimers50oCExtension72oCTemperature100050Time3’5’5’3’5’5’Melting94oCPCRMelting94oCMelting94oCAnnealingPrimers50oCExtension72oCTemperature100050Time30x3’5’5’3’HeatHeat5’5’5’PCRMelting94oCMelting94oCAnnealingPrimers50oCExtension72oCTemperature100050Time30x3’5’5’3’5’5’5’5’5’5’PCRMelting94oCMelting94oCAnnealingPrimers50oCExtension72oCTemperature100050Time30x3’5’5’3’5’5’5’5’5’5’HeatHeatPCRMelting94oCMelting94oCAnnealingPrimers50oCExtension72oCTemperature100050Time30x3’5’5’3’5’5’5’5’5’5’5’5’5’5’PCRMelting94oCMelting94oCAnnealingPrimers50oCExtension72oCTemperature100050Time30x3’5’5’3’5’5’Fragmentsofdefinedlength5’5’5’5’5’5’5’5’DNABetweenThePrimersDoublesWithEachThermalCycle0CyclesNumber1382412416532664

通過(guò)PCR擴(kuò)增染色體組DNA所獲得的長(zhǎng)度不同的多態(tài)性DNA片段。隨機(jī)排列的寡聚脫氧核苷酸單鏈引物（10個(gè)核苷酸）。1.隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA

（RandomAmplificationPolymorphismDNA，RAPD）HistoryShortlyafterKaryMullisinventedthePolymeraseChainReaction(PCR)itwasrealizedthatshortprimerswouldbindtoseverallocationsinagenomeandthuscouldproducemultiplefragments。Williamsetal.(1990)developedRandomAmplifiedPolymorphicDNA(RAPD)atechniqueusingveryshort10baseprimerstogeneraterandomfragmentsfromtemplateDNAs。RAPDfragmentscanbeseparatedandusedasgeneticmarkersorakindofDNAfingerprint。TechniquesrelatedtoRAPDinclude:DNAAmplificationFingerprinting(DAF)-Caetano-Anolles

etal.(1991)usesveryshort(eightnucleotidelong)primers。ArbitraryPrimedPCR(AP-PCR)-WelshandMcClelland(1990)useslongerprimers,butlowersprimerannealingstringencytogetprimingatmanysites。ComponentsofaPCRandRAPDReactionsRAPDBuffer(containingMg++)-usuallyhighMg++concentrationsareusedloweringannealingstringencyTemplateDNA1shortprimer(10bases)notknowntoannealtoanyspecificpartofthetemplateDNAdNTPsTaqDNAPolymerase(oranotherthermallystableDNApolymerase)PCRBuffer(containingMg++)TemplateDNA2PrimersthatflankthefragmentofDNAtobeamplifieddNTPsTaqDNAPolymerase(oranotherthermallystableDNApolymerase)ModifyingThermalCyclingTwomodificationsmadetotypicalthermalcyclingwhenRAPDisbeingdone:Annealingtemperaturesaregenerallyverylow,around36oC-ThisallowsveryshortprimerstoannealtotemplateDNA。Morethermalcyclesareused,typically45-Thiscompensatesfortheinefficiencywhichresultsfromusingsuchshortprimers.RAPDTemplateDNAPrimerbindstomanylocationsonthetemplateDNAOnlywhenprimerbindingsitesarecloseandorientedinoppositedirectionsotheprimerspointtowardeachotherwillamplificationtakeplaceRAPDTemplateDNAPrimerspointawayfromeachother,soamplificationwon’thappenRAPDTemplateDNAPrimerspointinthesamedirection,soamplificationwon’thappenRAPDTemplateDNAPrimerstoofarapart,soamplificationwon’thappen>2,000basesTemplateDNAPrimersarejusttherightdistanceapart,sofragmentisamplified100-1,500basesRAPDMM23

4

5

6

7

8

910SeparatedRAPDFragments4mMMgCl21.2UTaq5pMOPA-164mMMgCl20.6UTaq10pMOPA-162mMMgCl21.2UTaq10pMOPA-16Normalconcentrationsareshowninyellowtext.M=AsizestandardLoweringMagnesiumionconcentrationresultsinlossofthelargestfragmentvisibleinlanes2-7RAPDreactionswereruningroupsof3usingthesametemplateandprimer,butvaryingMagnesium,polymeraseandprimerconcentrationsWhichvariablehasthegreatestimpactonfragmentpatterns?單個(gè)引物可產(chǎn)生幾個(gè)多態(tài)位點(diǎn)RAPD的優(yōu)點(diǎn)：1.無(wú)需雜交，設(shè)計(jì)引物也無(wú)須知道序列息。2.DNA需要量少，引物便宜，成本較低。3.技術(shù)簡(jiǎn)便，操作方便、快速，不涉及分子雜交和放射性自顯影等技術(shù)。4.不同物種間引物通用。缺點(diǎn)：1.大多顯性遺傳，不能鑒別雜合和純合子；2.實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較差，結(jié)果可靠性較低。2.簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SimpleSequenceRepeat，SSR；alsoknownasmicrosatellitesorsimplesequencelengthpolymorphisms，SSLP）一類由1—6個(gè)堿基組成的基序（motif）串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列，根據(jù)核心序列堿基數(shù)的不同,可分為單堿基、2堿基、3堿基、4堿基等多種重復(fù)型。真核生物基因組普遍存在，呈隨機(jī)分布,大約每隔10-50kb就存在一個(gè)SSR。如（CA）n、（AT）n、（CC）n、（GATA）n不同物種其重復(fù)序列及重復(fù)單位頻率不同。通過(guò)對(duì)54個(gè)植物種核DNA和28個(gè)植物種細(xì)胞器DNASSR(1-4bp)的搜索，發(fā)現(xiàn)：(AT)ｎ最豐富，然后依次是:(A)n、(T)n、(AG)n、(CT)n、(AAT)n、(ATT)n、(AAC)n、(GTT)n、(AGC)n、(GCT)n、(AAG)n、(CTT)n、(AATT)n、(TTAA)n、(AAAT)n、(ATTT)n及(AC)n、(GT)n。同一類內(nèi)堿基種類不同的SSR，豐度差別很大。DNA復(fù)制或修復(fù)過(guò)程中的分子滑動(dòng)（slippagereplication）或不等交換所致。微衛(wèi)星DNA兩端的序列是相對(duì)保守的單拷貝序列（1）SSR標(biāo)記的原理

根據(jù)微衛(wèi)星DNA兩端的單拷貝序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，利用PCR技術(shù)，擴(kuò)增每個(gè)位點(diǎn)的微衛(wèi)星DNA序列，通過(guò)電泳分析核心序列的長(zhǎng)度多態(tài)性。⑥凝膠電泳檢測(cè)建立SSR標(biāo)記的一般程序①建立基因組DNA的質(zhì)粒文庫(kù)②設(shè)計(jì)并合成探針，篩選重組克?、坳?yáng)性克隆DNA插入序列測(cè)序④根據(jù)SSR兩側(cè)序列設(shè)計(jì)并合成引物⑤PCR擴(kuò)增2）檢測(cè)一個(gè)單一的多等位基因位點(diǎn)（2）SSR標(biāo)記的特點(diǎn)1）數(shù)量幾乎無(wú)限，檢測(cè)出多態(tài)性的頻率極高3）多數(shù)為共顯性標(biāo)記4）重復(fù)性高，穩(wěn)定可靠5）需DNA樣品量少，對(duì)DNA質(zhì)量要求亦不苛刻不足：相對(duì)的物種專一性；由于開發(fā)時(shí)需針對(duì)每個(gè)座位的微衛(wèi)星序列，發(fā)現(xiàn)其兩端的單拷貝序列設(shè)計(jì)引物，需建立基因文庫(kù)、克隆識(shí)別與篩選、測(cè)序等過(guò)程，開發(fā)困難，費(fèi)用較高，耗時(shí)長(zhǎng)；實(shí)際分析時(shí)一般每次只分析單個(gè)位點(diǎn)；不同引物退火溫度不同，需要探索。*使用SSR技術(shù)的前提是需要知道重復(fù)序列兩翼的DNA序列。3.單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphisms

，SNP）等位基因遺傳密碼的單堿基差異?；蚪M中每隔1000個(gè)堿基就存在一單堿基差異。一般通過(guò)對(duì)PCR產(chǎn)物、基因組文庫(kù)、表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）文庫(kù)測(cè)序而獲得。特點(diǎn)：數(shù)量大AChromosomeMapofTomato分子標(biāo)記的應(yīng)用1.遺傳圖譜的構(gòu)建作圖群體的建立1.親本的選配（1）親本間的DNA多態(tài)性豐富；（2）親本純度高；（3）雜交后代可育；2.群體的大小構(gòu)建分子標(biāo)記骨架連鎖圖可用小群體150單株或家系。1903年，Sutton&Boveri分別提出遺傳因子位于染色體上（二）圖譜構(gòu)建的理論基礎(chǔ)1.染色體遺傳理論染色體理論的基本要點(diǎn)①體細(xì)胞的染色體成對(duì)存在②每條染色體能保持結(jié)構(gòu)恒定性和遺傳連續(xù)性；③減數(shù)分裂同源染色體相互配對(duì)，隨后發(fā)生分離。連鎖圖譜構(gòu)建的理論是染色體的交換和重組。AABB×abababABABabABba重組率可用來(lái)表示遺傳圖距，2.基因重組和連鎖理論重組型配子的最大比例為50%，變化0-50%。圖距單位用厘摩（centi-Mergan,cM）表示，1cM的大小大致符合1%的重組率。成恢448抗稻瘟病基因的連鎖遺傳分