實驗六酶的基本性質(zhì)實驗——底物專一性、激活劑和抑制劑、最適溫度丁鳴一、目的要求1.了解酶的專一性。2.掌握驗證酶的專一性的基本原理及方法。3.學會排除干擾因素，設計酶學實驗。二、基本原理

酶是一種具有催化功能的蛋白質(zhì)。酶蛋白結構決定了酶的功能——酶的高效性，酶催化的反應（酶促反應）要比相應的沒有催化劑的反應快103～1017倍。

酶催化作用的一個重要特點是具有高度的底物專一性，即一種酶只能對某一種底物或一類底物起催化作用，對其他底物無催化反應。根據(jù)各種酶對底物的選擇程度不同，它們的專一性可以分為下列幾種：Ⅰ.酶的基本性質(zhì)——底物專一性1.相對專一性一種酶能夠催化一類具有相同化學鍵或基團的物質(zhì)進行某種類型的反應。2.絕對專一性：有些酶對底物的要求非常嚴格只作用于一種底物，而不作用于任何其他物質(zhì)。如脲酶只能催化尿素進行水解而生成二氧化碳和氨。如麥芽糖酶只作用于麥芽糖而不作用其它雙糖，淀粉酶只作用于淀粉，而不作用于纖維素。3.立體異構專一性有些酶只有作用于底物的立體異構物中的一種，而對另一種則全無作用。如酵母中的糖酶類只作用于D-型糖而不能作用于L-型的糖。

本實驗以唾液淀粉酶、蔗糖酶對淀粉、蔗糖水解反應的催化作用來觀察酶的專一性。采用Benedict試劑檢測反應產(chǎn)物。

Benedict試劑是堿性硫酸銅溶液，具有一定的氧化能力，能與還原性糖的半縮醛羥基發(fā)生氧化還原反應，生成磚紅色氧化亞銅沉淀。

Na2CO3+2H2O2NaOH+H2CO3CuSO4+2NaOHCu(OH)2+Na2SO4

還原糖(—CHOor—C=O)+2Cu(OH)2

Cu2O+2H2O+糖的氧化產(chǎn)物

（磚紅色或黃色）

在分子結構上，淀粉幾乎沒有，而蔗糖全無半縮醛基，它們均無還原性，因此它們與Benedict試劑無呈色反應。淀粉被淀粉酶水解，產(chǎn)物為葡萄糖；蔗糖被蔗糖酶水解，其產(chǎn)物為果糖和葡萄糖，它們都為具有自由半縮醛羥基的還原糖，與Benedict試劑共熱，即產(chǎn)生紅棕色Cu2O沉淀。本實驗以此顏色反應觀察淀粉酶、蔗糖酶對淀粉和蔗糖的水解作用。（醛基）（酮基）三、實驗材料與試劑1、實驗材料⑴蔗糖酶液(樣品Ⅳ）;⑵新鮮唾液（含唾液淀粉酶）；2、實驗試劑⑴蔗糖酶液蔗糖酶液(樣品Ⅳ），使用濃度可參考“實驗四蔗糖酶的酶活力測定”實驗的情況來選擇酶的稀釋倍數(shù)（加蒸餾水稀釋），備用；⑵唾液淀粉酶液（學生自制）取0.5mL唾液至50ml量筒中，用蒸餾水（稀釋）到50ml，用棉花過濾備用。唾液稀倍數(shù)因人而異，可稀釋50～400倍，甚至更高；⑶5%蔗糖（A.R.）溶液；⑷0.5%淀粉溶液（含0.3%NaCl）；⑸Benedict試劑；五、實驗操作方法和步驟㈠檢查試劑

取3支試管，按下表操作：試管編號試劑處理1230.5%淀粉（0.3%NaCl）溶液(ml)3

5%蔗糖溶液(ml)

3

蒸餾水(ml)

3Benedict試劑(ml)222搖勻，置沸水浴煮沸2～3min記錄觀察結果注：①檢查目的：試劑是否有干擾因素存在。②也可對蔗糖酶液、唾液淀粉酶液進行檢查是否也有干擾因素存在，請自己設計。123檢查試劑試管編號：㈡淀粉酶的專一性

取三支試管，按下表操作：試管編號試劑處理1230.5%淀粉（0.3%NaCl）溶液(ml)35%蔗糖溶液(ml)3蒸餾水(ml)3唾液淀粉酶液(ml)111搖勻，置37℃水浴保溫10minBenedict試劑(ml)222搖勻，置沸水浴煮2～3min記錄觀察結果注：可增加一組唾液淀粉酶液經(jīng)100℃加熱3min處理后的樣品對照組。123123淀粉酶的專一性試管編號：注：

可增加一組蔗糖酶液(樣品Ⅳ）經(jīng)100℃加熱3min處理后的樣品對照組。㈢蔗糖酶的專一性取三支試管，按下表操作：試管編號試劑處理1230.5%淀粉（0.3%NaCl）溶液(ml)35%蔗糖溶液(ml)3蒸餾水(ml)3蔗糖酶液(樣品Ⅳ）(ml)111搖勻，置37℃水浴保溫10minBenedict試劑(ml)222搖勻，置沸水浴煮2～3min記錄觀察結果123123蔗糖酶的專一性試管編號：六、結果分析討論七、思考題1．觀察酶專一性實驗為什么要設計這3組實驗？每組各有何意義？蒸餾水有何用？2．將酶液煮沸10min后，重做二、三的操作，觀察有何結果？3．在此實驗中，為什么要用0.5%淀粉(0.3%NaCl)溶液？0.3%NaCl的作用是什么？八、注意事項1.試管要干凈，所有試劑加量準確，加好試劑后要搖勻。2.使用試劑時不要人為造成試劑間的互相污染；試劑用好瓶蓋要立即蓋好，防止試劑間的互相污染。以免實驗結果的錯誤。Ⅱ.影響酶活性的因素——激活劑和抑制劑一、實驗目的和要求1.了解激活劑和抑制劑對酶促反應速度的影響。2.學習檢定激活劑和抑制劑影響酶促反應速度的原理和方法。二、實驗基本原理在酶促反應過程中，酶的活性常受某些物質(zhì)的影響，有些物質(zhì)能使酶的活性增加，稱為激活劑；某些物質(zhì)它們并不引起酶蛋白變性，但能使酶分子上的某些必需基團（主要是指酶活性中心上的一些基團）發(fā)生變化，因而引起酶活力下降，甚至喪失，致使酶反應速度降低，稱為酶的抑制劑。

酶的激活劑種類：1、一些簡單的無機離子，如Mg2+、Cl-等；2、一些中等大小的有機分子，如抗壞血酸等也是激活劑，它們對某些含巰基的酶具有激活作用；3、有些酶的催化作用易受某些抑制劑的影響，因而能除去抑制劑的物質(zhì)也可稱為激活劑，如EDTA能除去重金屬，因而能解除重金屬對酶的抑制作用。4、具有蛋白質(zhì)性質(zhì)的大分子物質(zhì)，這些激活劑是指可對某些無活性的酶原起作用的酶。

酶的抑制劑有許多種：如重金屬離子（Ag+、Hg2+、Pb2＋、Cu2＋等）、CO、氯化物、H2S、砷化物、氟化物、生物堿、有機磷農(nóng)藥等都是抑制劑。少量的激活劑或抑制劑就能影響酶的活性，而且常具有特異性。值得注意的是激活劑和抑制劑不是絕對的，各種激活劑對酶的作用是不同的。

本實驗利用淀粉被水解的不同階段產(chǎn)物與碘有不同顏色反應，定性觀察唾液淀粉酶在酶促反應中激活或抑制現(xiàn)象。淀粉經(jīng)酶促水解為葡萄糖的不同階段的產(chǎn)物與碘作用的顏色反應如下：淀粉

紫色糊精

紅色糊精

無色糊精

麥芽糖

葡萄糖I2

顯藍色

顯紫色

顯紅色

不顯色

不顯色

不顯色（碘色）（碘色）（碘色）

仍為多糖（無還原性）（有還原性）

本實驗中，Cl-為唾液淀粉酶的激活劑；Cu2+為唾液淀粉酶的抑制劑。

利用淀粉被水解的不同階段產(chǎn)物與碘有不同的呈色反應，定性觀察唾液淀粉酶在酶促反應中激活和抑制現(xiàn)象。作用一定時間水解產(chǎn)物+碘

淀粉+碘藍色淀粉+淀粉酶

水解的程度是通過水解混合物遇碘溶液所呈現(xiàn)的顏色之變化來判斷的。顏色變化Cl-或Cu2+三、實驗材料與試劑1、實驗材料新鮮唾液2、實驗試劑⑴唾液淀粉酶（學生自制）取唾液1ml至50ml量筒中，用蒸餾水稀釋至50ml，用棉花過濾備用。唾液稀釋倍數(shù)因人而異，可稀釋50～400倍，甚至更高。⑵0.1%淀粉溶液⑶1.0%氯化鈉溶液⑷1.0%硫酸銅溶液⑸1.0%硫酸鈉溶液⑹碘化鉀-碘液四、實驗器材與儀器1.試管及試管架2.量筒3.漏斗4.脫脂棉花5.點滴板6.吸量管7.恒溫水?。?7℃）五、實驗操作方法和步驟取試管4支，按下表操作：試管編號試劑處理12340.1%淀粉溶液(ml)

3

3

3

31%硫酸銅溶液(ml)1

1%氯化鈉溶液(ml)1

1%硫酸鈉溶液(ml)

1蒸餾水(ml)1唾液淀粉酶(ml)1111混勻，37℃恒溫水浴，保溫10min碘化鉀-碘液（滴）1111記錄觀察結果注意：⑴找出準確的保溫時間，是本實驗是實驗能否成功的關鍵步驟之一，唾液淀粉酶液濃度可根據(jù)個人情況而定，通過37℃水浴溶保溫計時，反應時間最好在8～15min以內(nèi)，只有確定準確的保溫時間才能進行實驗。⑵加入酶液后，務必充分搖勻，保證酶與全部淀粉液接觸的反應才能得到理想的顏色梯度變化結果。⑶碘化鉀–碘液不要過早地加到點滴板上，以免碘液揮發(fā)，影響顯色效果。12341234六、結果分析討論七、思考題1.激活劑可分哪幾類？本實驗中NaCl、硫酸銅是屬于哪種類型？2.本實驗中，1，2，3，4管各有何用意？為什么要設計第3管和第4管？3.抑制劑與變性劑有何不同？試舉例說明。八、注意事項1.試管要干凈，所有試劑加量準確，加好試劑后要搖勻。2.使用試劑時不要人為造成試劑間的互相污染，以免實驗結果的錯誤。3.試劑用好瓶蓋要立即蓋好，防止試劑間的互相污染。4.兩種淀粉不要弄錯。5.激活劑抑制劑實驗中，注意運用點滴板（顯色板）來控制保溫時間；如1，2，3，4管顏色反應無明顯差別，可能是唾流淀粉酶活力太高或太低，若酶活性太高可將酶稀釋后重做；若酶活性太低，可延長保溫時間或增加酶的濃度。Ⅲ.影響酶活性的因素——溫度，最適溫度測定一、實驗目的和要求1.了解溫度對酶活力的影響；2.學習測定最適溫度的原理和方法；二、實驗基本原理酶的催化反應受溫度影響很大，每一種酶所催化的反應，在一定條件下，僅在某一溫度范圍內(nèi)表現(xiàn)出最大的活力，即反應速度最大時的溫度，這個溫度稱為該酶促反應的最適溫度，高于或低于最適溫度時，反應速度逐漸下降。因此，酶促反應與溫度的關系，用酶活力對溫度作圖，通常具有鐘罩形曲線特征。溫度與酶活力的關系測定是選擇一定的條件，把底物濃度、酶濃度、反應時間、pH等固定在最適狀態(tài)下，然后在一系列不同溫度條件下，進行反應初速度測定，以酶反應初速度對溫度作圖，可以得一個鐘罩形的曲線，即為溫度—酶活性曲線，在某溫度有一酶活力最大值，這個溫度即為最適溫度。

實驗①利用唾液淀粉酶為試驗對象，在0℃～65℃之間選擇不同的溫度，進行酶活力測定。根據(jù)淀粉被唾液淀粉酶水解的程度的不同，遇碘呈現(xiàn)顏色的變化來判斷酶活力的大小及最適溫度。實驗②采用蔗糖酶為試驗對象，在室溫至75℃之間選擇不同溫度進行酶活力測定。蔗糖酶的活力常以其反應產(chǎn)物還原糖（葡萄糖）的生成量來表示。測定還原糖的方法很多，本實驗選擇3,5–二硝基水揚酸法測定還原糖量。在堿性條件下，3,5–二硝基水楊酸與還原糖溶液共熱后被還原成紅色氨基化合物，并在一定濃度范圍內(nèi)，還原糖的量與反應溶液所呈棕紅色物質(zhì)顏色的深淺程度成正比。因此，可以用分光光度法測定酶促反應后生成的還原糖量，從而測定蔗糖水解的速度和酶活力。三、實驗材料與試劑1、實驗材料⑴蔗糖酶液(樣品Ⅳ），使用濃度可參考“實驗四蔗糖酶的酶活力測定”實驗的情況來選擇酶的稀釋倍數(shù)（加蒸餾水稀釋），備用；⑵新鮮唾液。2、實驗試劑⑴0.2mol/L醋酸緩沖液（pH4.6）⑵5%蔗糖（A.R.）溶液（W/V）⑶3,5—二硝基水揚酸（簡稱DNS）試劑⑷0.5%淀粉溶液（含0.3%NaCl）⑸IK-I2溶液四、實驗器材與儀器1.試管及試管架，2．恒溫水浴(37℃、50℃、65℃、75℃、100℃），3．吸量管,4．滴管,5．點滴板，6．分光光度計，7．制冰機。五、實驗操作方法和步驟一、溫度對唾液淀粉酶活力的影響1．觀察溫度對酶活動的影響：取5支試管，按表4-1操作。2、繪制溫度-酶活力曲線圖，以反應溫度為橫坐標，反應液顏色的深淺程度（代表酶活力的大小）為縱坐標。繪制溫度——酶活力曲線（鐘罩形），確定唾液淀粉酶的最適溫度。管號試劑 123450.5%淀粉液（0.3%NaCl）(ml)22222溫度（℃）冰浴約0℃室溫375065各預溫5min唾液淀粉酶(作相應的預溫）（ml）11111

將試管內(nèi)溶液混勻后，置各相應溫度，保溫10minIK-I2液（滴）11111記錄顏色變化表4-1注意：⑴找出準確的保溫時間，是本實驗是實驗能否成功的關鍵步驟之一，唾液淀粉酶液濃度可根據(jù)個人情況而定，通過37℃水浴溶保溫計時，反應時間最好在8～15min以內(nèi)，只有確定準確的保溫時間才能進行實驗。（2）加入酶液后，務必充分搖勻，保證酶與全部淀粉液接觸的反應才能得到理想的顏色梯度變化結果。（3）碘化鉀–碘液不要過早地加到點滴板上，以免碘液揮發(fā)，影響顯色效果。⑷各管保溫時間要相同。二、溫度對蔗糖酶活力的影響1、蔗糖酶最適溫度的測定取試管7支進行編號，0號管為空白對照，以蒸餾水代替酶液，1—7號順序為測定管，向各管加入0.2mol/L醋酸緩沖液（pH4.6）1ml，

5%蔗糖溶液0.5ml，然后將各編號管依次放入相應溫度（見表4–2）的恒溫水浴或恒溫箱中，預熱3min，再逐管準確計時加入0.5ml經(jīng)適當稀釋的(已作相應的預溫）蔗糖酶溶液(樣品Ⅳ），迅速混勻；精確反應10min后，加入1ml3,5–二硝基水楊酸（DNS）試劑，立即混勻，放入100℃水浴中加熱5min。取出用流水冷卻至室溫后，向各管加入5ml蒸餾水，充分混勻。以0號管作空白對照A520值為零，在分光光度計上于520nm波長處測定各管的A520值，并作好記錄