年產(chǎn)8噸脂肪酸提取純化生產(chǎn)工藝的設(shè)計(jì)1.概述1?1脂肪酶的來源脂肪酶廣泛的存在于動植物和微生物中。植物中含脂肪酶較多的是油料作物的種子，如蓖麻籽、油菜籽，當(dāng)油料種子發(fā)芽時，脂肪酶能與其他的酶協(xié)同發(fā)揮作用催化分解油脂類物質(zhì)生成糖類，提供種子生根發(fā)芽所必需的養(yǎng)料和能量；動物體內(nèi)含脂肪酶較多的是高等動物的胰臟和脂肪組織，在腸液中含有少量的脂肪酶，用于補(bǔ)充胰脂肪酶對脂肪消化的不足，在肉食動物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。在動物體內(nèi)，各類脂肪酶控制著消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代謝等過程；細(xì)菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更為豐富（Pandey等）。由于微生物種類多、繁殖快、易發(fā)生遺傳變異，具有比動植物更廣的作用pH、作用溫度范圍以及底物專一性，且微生物來源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，適合于工業(yè)化大生產(chǎn)和獲得高純度樣品，因此微生物脂肪酶是工業(yè)用脂肪酶的重要來源，并且在理論研究方面也具有重要的意義。1.2脂肪酸的性質(zhì)脂肪酶，又稱甘油三酷水解酶，是一類特殊的酯鍵水解酶，它廣泛地存在于動物組織、植物種子和微生物體中。脂肪酶能催化天然底物油脂（甘油三酯）水解，產(chǎn)生脂肪酸和甘油，在水解過程中會產(chǎn)生中間產(chǎn)物甘油單酯和甘油二酯。脂肪酶可以催化酯類化合物的分解、合成和酯的交換，它具有化學(xué)選擇性和高度的立體異構(gòu)專一性，且反應(yīng)不需要輔酶，反應(yīng)條件溫和，副產(chǎn)物少。脂肪酶的另一顯著特點(diǎn)是：它只能在異相系統(tǒng)（即油一水界面）或有機(jī)相中作用，這不僅發(fā)展了“界面酶學(xué)”，也促進(jìn)了“非水酶學(xué)”的研究和深入。脂肪酶屬于絲氨酸水解酶，且它含有相同的結(jié)構(gòu)序列，G-XI—S-X2—G（G為甘氨酸，S為絲氨酸，X偽組氨酸，X2為天冬氨酸），它的三維結(jié)構(gòu)對酶的催化作用影響很大。微生物脂肪酶的溫度適應(yīng)范圍很廣，一般在30-90C之間，有的低溫脂肪酶在20C下仍能保持較高的活性，嗜熱脂肪酶則能適應(yīng)50C以上的高溫。脂肪酶適應(yīng)的pH值范圍變化也很大，在pH4.0-11.0之間，表現(xiàn)出不同的穩(wěn)定性。脂肪酶是重要的工業(yè)酶制劑品種之一，可以催化解脂、酯交換、酯合成等反應(yīng)，廣泛應(yīng)用于油脂加工、食品、醫(yī)藥、日化等工業(yè)。不同來源的脂肪酶具有不同的催化特點(diǎn)和催化活力。其中用于有機(jī)相合成的具有轉(zhuǎn)酯化或酯化功能的脂肪酶的規(guī)?；a(chǎn)對于酶催化合成精細(xì)化學(xué)品和手性化合物有重要意義。1.3脂肪酶國內(nèi)外生產(chǎn)情況與發(fā)展前景由于微生物脂肪酶具有不同的催化功能，除有無水解脂肪酷鍵位置專一性夕卜，還有作用溫度的高溫、中溫和低溫，作用PH勺堿性、中性和酸性，從而構(gòu)成極為廣闊的應(yīng)用空間。以微生物為來源生產(chǎn)脂肪酶較動植物更具有巨大的潛力和優(yōu)勢。目前，國內(nèi)外微生物脂肪酶的研究、生產(chǎn)和應(yīng)用都取得很大的進(jìn)展。國外，微生物脂肪酶的生產(chǎn)主要集中在丹麥、日本和美國等國家，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，有66個屬的微生物可產(chǎn)脂肪酶，其中：細(xì)菌有29個屬;放線菌有4個屬：酵母屬有10個屬，真菌有23個屬。由于發(fā)酵酶活測定方法的不可比性，無法正確顯示目前國外脂肪酶的發(fā)酵酶活，但產(chǎn)品酶活用統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的測定方法，可得到顯示的酶活單位，以我國綠微康酶活測定的方法，我們比較了幾個國家生產(chǎn)企業(yè)的脂肪酶產(chǎn)品，產(chǎn)品酶活差別很大，從幾萬P/g到幾十萬P/g都有。據(jù)了解，國外幾家脂肪酶生產(chǎn)企業(yè)其發(fā)酵酶活都沒有新的突破，但酶的下游工程的技術(shù)和裝備突破很大，尤其酶的定向進(jìn)化技術(shù)的應(yīng)用，使酶的特性和酶活單位有了很大的改進(jìn)和提高，產(chǎn)品都可顯示出高酶活單位。我國微生物脂肪酶的生產(chǎn)，就目前而言，堿性脂肪酶僅綠微康獨(dú)家生產(chǎn)，假絲酵母產(chǎn)中性脂肪酶也僅1、2家，綠微康堿性脂肪酶罐上發(fā)酵單位可穩(wěn)定在6000P/ml左右，產(chǎn)品酶活可由幾千P/g到幾萬P/g，甚至更高。我國微生物脂肪酶己實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，雖然目前生產(chǎn)量還低，但己在諸多產(chǎn)業(yè)中逐步推廣使用。由于價低質(zhì)優(yōu)，在國際市場中極具競爭力，綠微康已首次實(shí)現(xiàn)我國堿性脂肪酶的出口，而且份額正在逐步擴(kuò)大之中。因此，微生物脂肪酶具有廣闊的應(yīng)用空間，尤其國產(chǎn)微生物脂肪酶具有優(yōu)良的酶學(xué)特性，可適應(yīng)不同應(yīng)用領(lǐng)域的需求，微生物脂肪酶國產(chǎn)化己為期不遠(yuǎn)了。1.4脂肪酶的用途1、在洗滌工業(yè)中的應(yīng)用：與堿性蛋白酶配伍成的復(fù)合酶，添加于洗衣粉中，可明顯提高洗衣粉的去污力。2、在面粉工業(yè)中的應(yīng)用：與真菌a一淀粉酶等配伍成的復(fù)合酶，作為面粉改良劑，應(yīng)用于饅頭粉和面包粉中，具有增筋和增白雙重作用，可以少用甚至不用化學(xué)乳化劑和化學(xué)增筋增白劑。3、在皮革工業(yè)中的應(yīng)用：在毛皮、皮毛脫脂中作為一種高效、無污染的生物脫脂劑，其脫脂效果優(yōu)于堿法脫脂和化學(xué)法脫脂，明顯提高皮革的等級率。4、在食品工業(yè)的應(yīng)用：利用酶作用后釋放出的鏈較短的脂肪酸，增加和改進(jìn)食品的風(fēng)味和香味；利用脂肪酶催化的醇解和酯化反應(yīng)來生產(chǎn)各種香精酯，作調(diào)料劑；用有1,3-專一性的微生物脂肪酶提高食用油營養(yǎng)價值和增加食用油的花色品種，制備代可可酯等高檔油脂；另外，脂肪酶還可以用于酒類的去濁除渣、改善面包質(zhì)量，改善蛋白的發(fā)泡等等方面。5、在脂肪酸工業(yè)中的應(yīng)用：可實(shí)現(xiàn)脂肪酸工業(yè)酶法生產(chǎn)新工藝，具有作用溫和，低溫，低壓，設(shè)備簡單，提取收率周，對環(huán)境污染少等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)。6在造紙工業(yè)中的應(yīng)用：可實(shí)現(xiàn)木漿中松脂去除有機(jī)械法轉(zhuǎn)向酶法，徹底解決機(jī)械法去除松脂不徹底的難題，明顯提高紙張的等級率：可作為油墨紙漿中去墨的生物脫脂劑，具有明顯的去墨效果。7、在機(jī)械加工中的應(yīng)用：可作為一種優(yōu)良的生物脫脂劑，而應(yīng)用于汽車、輪船及相關(guān)機(jī)械工業(yè)中得清洗劑，效果優(yōu)于化學(xué)脫脂劑。8、在飼料工業(yè)中的應(yīng)用：與a-淀粉酶、纖維素酶、果膠酶等配伍成復(fù)合酶，作為飼料添加劑，可明顯提高飼料利用率，料肉比和料蛋比，降低飼料成本。也可單獨(dú)使用，可減少仔豬的腹瀉率。9、在醫(yī)藥、精細(xì)化工等工業(yè)中的應(yīng)用：在醫(yī)藥、農(nóng)藥、精細(xì)化工工業(yè)中的手性化合物的生物拆分，微生物脂肪酶是實(shí)現(xiàn)酶法拆分的最主要酶鐘，是制備手性化合物的首選方法。10、在釀酒工業(yè)中的應(yīng)用：可提高白酒中酯類香味物質(zhì)含量，加快白酒中各種酸、醇、酯的反應(yīng)平衡，縮短貯存老熟時間，調(diào)節(jié)白酒中各種香味物質(zhì)的含量和比例，使酒質(zhì)窖香濃郁、綿甜爽冽，香味協(xié)調(diào)飽滿、余味悠長；優(yōu)質(zhì)酒品率可以提升30%以上。11、在醬類釀造工業(yè)中的應(yīng)用：可達(dá)到增香的目的。12、脂肪酶在外消旋混合物光學(xué)拆分中的應(yīng)用酶催化反應(yīng)的高效性、高立體選擇性及溫和反應(yīng)條件使得酶催化拆分法可用于某些用一般法難以拆分的手性化合物。脂肪酶是水解酶，對廣泛的底物能催化不對稱水解或不對稱酯化。脂肪酶對手性化合物，如醇、羧酸、酯、酰胺和胺等均有較好的立體選擇性。因此脂肪酶被廣泛地用來拆分外消旋醇和羧酸。拆分的主要途徑為立體選擇性水解、酯化或轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。用乙烯基酯為活性酯，在無水二氯甲烷中用假單胞菌脂肪酶催化氰醇的化學(xué)拆分，得S型醇，經(jīng)化學(xué)轉(zhuǎn)化合成B-腎上腺素抑制劑。此外，脂肪酶還用于酯環(huán)仲醇的拆分，擬除蟲菊酯中間體的拆分，除草劑對甲氧基苯甲酸基奈普生、布羅芬的拆分等。1.5設(shè)計(jì)范圍設(shè)計(jì)規(guī)模為年產(chǎn)8噸的脂肪酶的提取純化生產(chǎn)工藝。利用假絲酵母培養(yǎng)基培養(yǎng)經(jīng)提取純化得到脂肪酶工藝計(jì)算主要設(shè)備的計(jì)算和選型繪制帶控制點(diǎn)的工藝流程圖原材料及產(chǎn)品的主要技術(shù)規(guī)格2.1培養(yǎng)基配方5%黃豆粉，3%米糠，0.2%的硫酸銨，0.5%豆油，0.1%磷酸二氫鉀，0.05%硫酸鎂。22試劑與儀器221主要儀器蛋白質(zhì)分子篩層析系統(tǒng)（電腦，電腦采集器WD-1A核酸蛋白檢測儀WHD-3BHL-3恒流泵，BSZ-100A自動部分收集器），電泳儀-ECP300C及其他電泳裝置，離心機(jī)，玻璃板，恒溫水浴鍋（DK-98-1），透析袋，比色皿。2.2.2主要試劑硫酸銨，聚乙二醇20000,葡聚糖凝膠G-75,磷酸氫二鉀，磷酸二氫鉀，Tris堿，鹽酸，甘氨酸，SDS甘油，B一巰基乙醇，溴酚藍(lán)，正丁醇，考馬斯亮G-250,乙醇，磷酸。2.3產(chǎn)品的主要技術(shù)規(guī)格生產(chǎn)規(guī)模：8噸/年生產(chǎn)方法：利用假絲酵母培養(yǎng)基培養(yǎng)經(jīng)提取純化得到脂肪酶生產(chǎn)天數(shù)：300天/年純化周期：30h生產(chǎn)流程和測量方法3.1生產(chǎn)流程3.1.1離心提取粗酶液取細(xì)菌發(fā)酵液于4C,8000rpm離心5min,去掉菌體，收集上清液，于4C冰箱放置備用3.1.2鹽析法初提脂肪酶量取一定量經(jīng)過離心提取的粗酶液，用飽和硫酸銨溶液緩慢加入，邊加入邊攪拌，于4°C下冰箱放置6h，4°C,lOOOOrpm,離心5min后，收集沉淀。3?1?3透析脫鹽將經(jīng)過硫酸銨分級沉淀收集到的沉淀物用PH7.2的Tris-HCI緩沖液溶解。按照酶與緩沖液1:20的體積比于4C下透析脫鹽，中間更換緩沖液數(shù)次。3.1.4分子篩凝膠過濾層析法分離純化脂肪酶將經(jīng)過上述硫酸銨鹽析得到的樣品液用聚乙二醇20000濃縮，將濃縮液作為樣品上樣到SephadexG-75層析柱上，以pH7.2的0.05mol/L磷酸鉀緩沖液洗脫，控制流速，觀察并收集洗脫液。3.1.5脂肪酶SDS-PAG電泳，電泳實(shí)驗(yàn)采用垂直不連續(xù)電泳方式，首先選取15%的電泳分離膠，4%的電泳濃縮膠，灌膠后以水飽和正丁醇覆蓋膠面。其次，將SephadexG-75層析收集得到的樣品液與上樣緩沖液等體積混合后于沸水中保持2min，8000rpm,離心5min，取2.5P/L點(diǎn)入加樣孔；于80V電壓下電泳至示蹤染料溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后改用120V電壓電泳直到示蹤染料溴酚藍(lán)接近分離膠邊緣后停止電泳。3.2測量方法3.2.1脂肪酶活性的測定lml細(xì)菌發(fā)酵液于40C、pH7.5條件下水解脂肪，每分鐘產(chǎn)生lPmol的脂肪酸，即為一個脂肪酶活力單位，以U/ml表示。量取4%聚乙二醇（PVP）溶液150mL加50m瞰欖油（菜子油），用高速組織搗碎機(jī)攪動6min（分兩次攪拌，每次3min，中間休息5min），即成乳白色PVP--橄欖油乳化液。取兩個100m三角瓶，分別于空白瓶A（對照）和空白瓶B中，各加入底物溶液4m和0.025mol/L的磷酸緩沖液5ml，再于A瓶中加入95%的乙醇15ml,兩瓶同時放入40C士0.2C水浴中預(yù)熱10分鐘，在兩瓶中各加入酶液lmL,立即混勻并計(jì)時，在40C士O2C水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)15分鐘，在8瓶中立即加入95%乙醇15mL終止酶反應(yīng)：于對照和樣品溶液中各加入酚酞指示劑3滴，用0.05mol/L氫氧化鈉溶液滴定，直至微紅色并保持約30秒不褪色為其終點(diǎn)，記錄消耗0.05mol/L氫氧化鈉溶液的體積。按如下公式計(jì)算：X=（（B-A）*c*50*n）/（t*0.05）式中，x為樣品的酶活力，單位是U/mLB為滴定樣品時消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)堿液的體積，單位是mLA為滴定對照消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)堿液的體積，單位是ml；c為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，單位是mol/L;0.05為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度換算系數(shù)；50為0.05mol/L氫氧化鈉溶液lmL相當(dāng)于脂肪酸50Pmol;t為反應(yīng)時間，單位是分鐘；n為稀釋倍數(shù)。3.2.2考馬斯染料結(jié)合分析法測定總蛋白質(zhì)含量（Bradford）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取6支具塞試管，按表3.1加入試劑（O-100P/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白），混合均勻后，向各管中加入5mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，搖勻，并放置5min左右，用1cm光徑比色皿在595nm下比色測定吸光度。以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。序號123456標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)/ml00.200.400.600.801.00蒸餾水量/ml1.000.800.600.400.200蛋白質(zhì)含旦/Z量/□g020406080100蛋白質(zhì)'樣品的測定吸取樣品液I.OmL，放入具塞試管中（每個樣品重復(fù)2次），加入5mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，充分混合，放置反應(yīng)5min后，用1cm光徑比色皿在595nm下比色測定吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查詢計(jì)算出蛋白質(zhì)含量。相關(guān)溶液的配置4.1飽和硫酸銨溶液在800mLdH2沖加入1.21gTris堿，HCI調(diào)校正pH7.0,定容至1L,配制成0.01mol/LTrisC1溶液；然后，準(zhǔn)確稱量767g硫酸銨，通過攪拌和稍微加熱將其溶解于1L0.01mol/LTrisC仲，校正pH7.0,并于4C貯存?zhèn)溆谩mol/LTrisHCI緩沖溶液準(zhǔn)確稱取121gTris堿容解于800mldH2沖，用濃HC調(diào)節(jié)pH至7.2，補(bǔ)水定容至1L備用。使用時將其20倍稀釋得到0.05mol/L的TrisHCI使用緩沖溶液。GF蛋白質(zhì)分級分離緩沖液（0.05mol/LpH7.2磷酸鉀緩沖液）溶液A:27.2g磷酸二氫鉀(KH2P04)(O.2mol/L)溶液B:45.6g磷酸氫二鉀(K2HPO?3H20)(O.2mol/L)4.4考馬斯亮藍(lán)G-250溶液準(zhǔn)確稱取100m考馬斯亮藍(lán)G-250溶解于50mL9%乙醇中，加入100mL85%(W/V)的磷酸，再用dH20定容到IL,貯存于棕色瓶中備用4.5相關(guān)緩沖液的配置4X濃縮膠緩沖液(O.5mol/LTris-HCI,pH6.8)準(zhǔn)確稱取30.25gTris堿溶解于400mLdH2(中，6moI/LHCI調(diào)節(jié)pH至6.8,定容至1L，4C貯存?zhèn)溆谩?X分離膠緩沖液(1.5mol/LTris.HCl,pH8.8)準(zhǔn)確稱取90.75gTris堿溶解于400mLdH2(中，6mol/LHCl調(diào)節(jié)pH至8.8,定容至1L,4C貯存?zhèn)溆谩?0x電泳緩沖液準(zhǔn)確稱取30.0gTris堿、144.0g甘氨酸、10.0gSDS容解于1LdH20中，調(diào)節(jié)pH值8.3,室溫下保存，用前稀釋成1X電泳緩沖液。2xSDS上樣緩沖液準(zhǔn)確量取4X濃縮膠緩沖液2.0mL、甘油1.6mL、10%SDS3.2mLB-巰基乙醇O.8mL1.0%溴酚藍(lán)0.4mL充分混合后4C貯存?zhèn)溆谩?.6水飽和正丁醇準(zhǔn)確量取50m正丁醇與等體積dH20昆合振蕩搖勻，室溫下放置備用。5實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論5.1粗酶液的制備細(xì)菌發(fā)酵液經(jīng)離心收集上清液測定酶活得：其活力為14.8U/ml,蛋白質(zhì)濃度為0.57mg/ml,比活力為25.97U/g,于46冰箱放置備用。5.2硫酸銨分級沉淀脂肪酶序號飽和硫酸銨(ml)細(xì)菌發(fā)酵液(ml)硫酸銨飽和液(w/v，%)酶活力(U/ml)酶活得率(%)比活力(U/mg)純化倍數(shù)152015.340.674.5225.870.992102025.572.0013.5149.631.913152032.874.0027.0388.693.424202038.357.3049.3277.422.985252042.613.6724.7927.411.066302046.022.6718.0417.580.68實(shí)驗(yàn)結(jié)果上表，鹽析處理脂肪酶樣品液的過程中，隨著鹽離子濃度的增加，脂肪酶活力呈現(xiàn)先增后降的趨勢，當(dāng)硫酸銨的飽和度達(dá)到38.35%時，脂肪酶的酶活力最高，其值為7.30U/mlMt時純化倍數(shù)為2.98,雖然比表中3.42值要小，但酶活力的總回收率為49.32%，遠(yuǎn)比27.03%高得多。因此鹽析沉淀分離脂肪酶的最佳硫酸銨濃度為38.35%(W/V)。SephadexG-75分子篩柱層析分離純化脂肪酶經(jīng)過硫酸銨鹽析、透析脫鹽濃縮處理后所得脂肪酶液(酶活力18.33U/ml),蛋白質(zhì)濃度1.96mg/ml),經(jīng)SephadexG-75分子篩凝膠層析；結(jié)果出現(xiàn)了兩個明顯的峰，用不同的試管收集洗脫峰1和峰2分別得到4.9ml和13.6ml洗脫液：峰1收集液的脂肪酶活力為l.67P/ml。蛋白質(zhì)濃度為0.05mg/ml。峰2收集液沒有脂肪酶活性；經(jīng)過凝膠層析純化，脂肪酶的回收率為22.32%，純化倍數(shù)為3.57倍。SDS檢測脂肪酶純度將上述經(jīng)過sephadexG-75柱層析后收集得到的脂肪酶溶液進(jìn)行SDS-AG電泳，結(jié)果表明，經(jīng)過分子篩凝膠過濾層析法分離純化處理后的脂肪酶樣品液經(jīng)SDS-AG電泳只有單一的電泳條帶，由此說明了所得樣品達(dá)到了純化效果。6?工藝計(jì)算因?yàn)楣ぷ魅諡?00天，純化周期為30h，所以可得共有240個周期，因此由年產(chǎn)8噸可得每個周期應(yīng)生產(chǎn)：8/240=33kg的脂肪酸，以下以一個周期計(jì)算為例。6.1物料衡算6.2能量衡算7?其他通過這次課程設(shè)計(jì)，我們初步了解了做設(shè)計(jì)的一般要求，格式，內(nèi)容和方法，為將來的小設(shè)計(jì)乃至畢業(yè)設(shè)計(jì)積累了寶貴的經(jīng)驗(yàn)。剛開始做課程設(shè)計(jì)時有點(diǎn)一頭霧水，因?yàn)楦郧暗幕ぴ碚n程設(shè)計(jì)不同，這次沒有老師教我們到底每一步該怎么做。而是在拿到任務(wù)后，我們必須自己整理思路，規(guī)劃設(shè)計(jì)。老師能告訴我們的只是一些規(guī)范的格式，必須的作圖技巧，以及為我們在設(shè)計(jì)中遇到的困惑答疑解難。這著實(shí)讓習(xí)慣了填鴨式教育的我們措手不及，一下子不知道該從何下手。所幸經(jīng)過幾天的適應(yīng)摸索，以及和同組同學(xué)的相互討論，我們漸漸理清思路，開始步入正確的軌道。設(shè)計(jì)的本質(zhì)就是要解決問題，一個任務(wù)布置下來，我們要做的就是調(diào)動一切現(xiàn)有條件，使用各種工具來針對性地解決這個問題。要成功完成設(shè)計(jì)，除了基本的專業(yè)知識外更要有較好的文獻(xiàn)研讀能力，如何消化他人的研究成果從海量數(shù)據(jù)中找到自己所需的內(nèi)容，并結(jié)合具體問題正確使用非常重要。剛開始看化工設(shè)計(jì)手冊那兩本大厚書時真是頭疼，滿滿都是字根本不知道我們想