實(shí)驗(yàn)二十、食品中黃曲霉毒素B1的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)依據(jù):GB/T5009.22-2003食品中黃曲霉毒素B1的測(cè)定

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求：1、學(xué)習(xí)酶聯(lián)免疫(ELISA)方法測(cè)定糧食及食品中黃曲霉毒素B1的實(shí)驗(yàn)原理，掌握實(shí)驗(yàn)的操作要點(diǎn)及測(cè)定方法2、了解酶聯(lián)免疫(ELISA)的工作原理，正確熟練使用酶標(biāo)儀。二、實(shí)驗(yàn)原理：本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，樣品中的黃曲霉毒素B1經(jīng)提取、脫脂、濃縮后與定量特異性抗體反應(yīng)，多余的游離抗體則與酶標(biāo)板內(nèi)的包被抗原結(jié)合，加入酶標(biāo)記物和底物后顯色，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較測(cè)定含量。三、儀器與試劑（一）試劑盒組成1、AFB1抗原包被16孔×6條形帶框酶標(biāo)板；2、抗體；3、酶標(biāo)二抗；4、空白對(duì)照液；5、底物（1mg×4）；6、底物液A；7、底物液B；8、終止液；9、PBS一T洗液；10、一次性手套。（二）儀器1、酶標(biāo)儀；2、離心機(jī)。2.玉米（脂肪含量3.0～5.0％）：樣品粉碎后過(guò)20目篩，稱取20.0g，加入250mL具塞錐形瓶中。準(zhǔn)確加入50.0mL甲醇一水（80+20）溶液和15.0mL石油醚，蓋塞后滴水封嚴(yán)，150rpm振蕩30min。用快速定性濾紙過(guò)濾于125mL分液漏斗中,待分層后，放出下層甲醇水溶液于50mL燒杯內(nèi)，從中取10.0mL（相當(dāng)于4.0g樣品）于75mL蒸發(fā)皿中,以下按上述“65℃水浴通風(fēng)揮干”起，依法操作。3．花生（脂肪含量15.0－45.0％）：樣品去殼去皮粉碎后稱取20.0g，加入250mL具塞三角瓶中，準(zhǔn)確加人100.0mL甲醇水(55＋45）溶液和30mL石油醚,蓋塞后滴水封嚴(yán)，150rpm振蕩30min，靜置15min后用快速定性濾紙過(guò)濾于125mL分液漏斗中，待分層后，放出下層甲醇水溶液于100mL燒杯內(nèi)，從中取20.0mL（相當(dāng)于4.0g樣品）置于另一125mL分液漏斗中，加入20.0mL三氯甲烷，振搖2min，靜置分層（如有乳化現(xiàn)象可滴加甲醇促使分層）．放出三氯甲烷于75mL蒸發(fā)皿中，再加5.0mL三氯甲烷于分液漏斗中重復(fù)振搖提取后，放出三氯甲烷層一并于蒸發(fā)皿中，以下按上述“65℃水浴通風(fēng)揮干”起，依法操作。4．植物油：用小燒杯稱取4.0g樣品，用20.0mL石油醚，將樣品移于125mL分液漏斗中，用20.0mL甲醇水(55＋45）溶液分次洗燒杯，溶液一并移人分液漏斗中。（精煉油4.0g樣為4.575mL，可直接用移液器加入分液漏斗再加溶劑后振搖）振搖2min，靜置分層后，放出下層甲醇水溶液于750mL蒸發(fā)皿中。再用5.0mL甲醇水溶液重復(fù)振搖提取一次，提取液一并加入蒸發(fā)皿中，以下按自“65℃水浴通風(fēng)揮干”起，依法操作。5．其它食品：可按照G85009有關(guān)章節(jié)提供的方法操作，最終提取物（相當(dāng)于4.0g樣品）應(yīng)收集于2.0m1甲醇一PBS(20＋80)中。（二）樣品測(cè)定1、將下列試劑稀釋后備用PBS一T洗液：390mL蒸榴水稀釋（1:40）；底物液A:9mI蒸溜水稀釋（1:9）；抗體:7.0mL洗液稀釋（1:140）；酶標(biāo)二抗:10mL洗液稀釋（1:200）；陰性對(duì)照液:200μl抗體十200μl空白對(duì)照液在玻璃試管內(nèi)混合振蕩后靜置。2、抗體抗原反應(yīng)將抗體與等量樣品提取液（溶液為甲醇一PBS）在玻璃試管內(nèi)混合振蕩后室溫靜置15分鐘。啟封酶標(biāo)板，用洗液2×3分鐘洗板后在吸水紙上拍干，分別在適當(dāng)孔位加入此抗體抗原反應(yīng)液及空白對(duì)照液（3孔）和陰性對(duì)照液（3孔）,130μl／孔,37℃濕盒中孵育（或加蓋以保持相對(duì)濕度），2小時(shí)后，倒掉反應(yīng)液并拍干,用洗液3×3分鐘洗板，拍干。3、酶標(biāo)記反應(yīng)加入酶標(biāo)二抗，100μl／孔，37℃盒中孵育1小時(shí)后，用洗液5×3分鐘洗板，拍干。4、顯色反應(yīng)lmg底物十2.5m1底物液A＋42μl底物液B，待底物充分溶解后加入酶標(biāo)板，100μl／孔，37℃15分鐘后加終止液40μl／孔。5、測(cè)定酶標(biāo)儀490nm測(cè)定各孔0.D值。六、使用進(jìn)口試劑盒檢測(cè)的主要實(shí)驗(yàn)步驟

1、樣品提取：取5.0g樣品與錐形瓶中，加入70％甲醇25ml，振搖3min，過(guò)濾于分液漏斗中，靜置分層，放出下層的甲醇水提取液，即為樣品提取液。（亦可根據(jù)樣品中黃曲霉毒素含量進(jìn)行適當(dāng)稀釋為待測(cè)樣液）2、免疫反應(yīng)：紅色微孔中加入藍(lán)色試劑100μl，分別加入標(biāo)準(zhǔn)品和樣品各100μl，三次混勻，移100μl到白色抗體孔，搖勻，室溫反應(yīng)10min，棄去液體，用去離子水洗5次，用吸水紙扣干。3、顯色反應(yīng)：加入綠色試劑100μl，搖勻，室溫反應(yīng)10min，加入紅色試劑100μl，終止反應(yīng)。4、結(jié)果檢