NCBI常用功能與引物設(shè)計(jì)2010級(jí)博士：謝鵬

導(dǎo)師：鄒曉庭為何要接觸NCBI？如何使用NCBI？如何設(shè)計(jì)引物？YoursitehereNCBI簡介NCBI：NationalCenterforBiotechnologyInformation美國國家信息技術(shù)中心（/）1992年10月，NCBI承擔(dān)起對(duì)GenBankDNA序列數(shù)據(jù)庫的責(zé)任。NCBI工作人員通過來自各個(gè)實(shí)驗(yàn)室遞交的序列和同國際核酸序列數(shù)據(jù)庫（EMBL和DDBJ）交換數(shù)據(jù)建立起數(shù)據(jù)庫.Genebank是遺傳序列數(shù)據(jù)庫，一個(gè)所有可以公開獲得的DNA序列的注釋過的收集。GenBank以指數(shù)形式增長，核酸堿基數(shù)目大概每14個(gè)月就翻一個(gè)倍。最近，GenBank擁有來自47,000個(gè)物種的30億個(gè)堿基。YoursitehereNCBI常用功能查找核酸/氨基酸序列序列相似性分析引物驗(yàn)證Yoursitehere一、查找核酸、氨基酸序列1.以雞FAT/CD36為例，search：2.調(diào)整右側(cè)檢索目錄，tree--list：Yoursitehere3.瀏覽信息，下載序列，并以Genebank、FASTA格式保存點(diǎn)擊Genebank:Yoursitehere氨基酸序列：Genebank核酸序列：……FASTA格式的核酸序列：……YoursitehereBlast簡介

BLAST：“局部相似性基本查詢工具”(BasicLocalAlignmentSearchTool)的縮寫，是由NCBI開發(fā)的一個(gè)基于序列相似性的數(shù)據(jù)庫搜索程序。程序名查詢序列數(shù)據(jù)庫搜索方法Blastn核酸核酸核酸序列搜索逐一核酸數(shù)據(jù)庫中的序列Blastp蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)序列搜索逐一蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的序列Blastx核酸蛋白質(zhì)核酸序列6框翻譯成蛋白質(zhì)序列后和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的序列逐一搜索。Tblastn蛋白質(zhì)核酸蛋白質(zhì)序列和核酸數(shù)據(jù)庫中的核酸序列6框翻譯后的蛋白質(zhì)序列逐一比對(duì)。TBlastx核酸核酸核酸序列6框翻譯成蛋白質(zhì)序列，再和核酸數(shù)據(jù)庫中的核酸序列6框翻譯成的蛋白質(zhì)序列逐一進(jìn)行比對(duì)。主要的Blast程序：Yoursitehere2.進(jìn)入NCBI3.點(diǎn)擊BasicBLAST中的nucleotideblast選項(xiàng)YoursitehereYoursitehere4.尋找相近物種，比較相似性Yoursitehere點(diǎn)擊score，獲得相似性比較具體信息NCBI官方說明：/BLAST/tutorial/Altschul-1.htmlYoursitehere引物設(shè)計(jì)與簡并PCRRT－PCR原理與技術(shù)簡介引物設(shè)計(jì)過程簡并PCR技術(shù)后續(xù)研究YoursitehereRT－PCR原理與技術(shù)簡介DNAmRNA蛋白質(zhì)酶活力WesternblotNorthernblot半定量RTPCR定量RTPCRYoursitehere常規(guī)引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)原則Primer5和Oligo6進(jìn)行引物分析Yoursitehere引物設(shè)計(jì)原則

引物的長度一般為15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因?yàn)檫^長會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，即Taq

酶的最適溫度。引物3’端的序列要比5’端重要。引物3’端的堿基一般不用A，因?yàn)锳在錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)的引發(fā)效率相對(duì)比較高。另外引物間3’端的互補(bǔ)、二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。5’端序列對(duì)PCR影響不大。引物的GC含量一般為40-60%，以45-55％為宜，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。PCR引物的GC/AT比率應(yīng)當(dāng)?shù)扔诨蚋哂谒糯蟮哪０宓腉C/AT比。ΔG值(自由能)反映引物與模板結(jié)合的強(qiáng)弱程度。一般情況下，引物的ΔG值最好呈正弦曲線形狀，即5’端和中間ΔG值較高，而3’端ΔG值相對(duì)較低，且不要超過9（ΔG值為負(fù)值，這里取絕對(duì)值）。

引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能量一般不要超過4.5，否則容易產(chǎn)生引物二聚體帶。

Yoursitehere2.點(diǎn)擊search進(jìn)行引物條件設(shè)置：3.Searchcriteria篩選Yoursitehere4.選擇最優(yōu)引物5.手動(dòng)修改，調(diào)整引物Yoursitehere以文獻(xiàn)報(bào)道雞的MUC2的引物為例：YoursitehereYoursitehereYoursitehere簡并引物設(shè)計(jì)過程傳統(tǒng)方法（適用于保守度高序列）應(yīng)用BLAST進(jìn)行同源序列搜索應(yīng)用DNAMAN選擇保守區(qū)域（氨基酸或核苷酸）簡并引物設(shè)計(jì)原則Primer5和Oligo6進(jìn)行引物分析CODEHOP法（適用于保守度低序列）Yoursitehere應(yīng)用BLAST進(jìn)行同源序列搜索剪切然后粘貼DNA或蛋白序列；使用FASTA格式的序列；FASTA格式的序列以一個(gè)單行的說明開始，說明行以其開始處的一個(gè)大于號(hào)（>）與序列數(shù)據(jù)區(qū)分開。說明行以下是序列數(shù)據(jù)。簡單使用訪問編號(hào)：RefSeq或Genebank序號(hào)。

http:///YoursitehereYoursitehereDNAMAN分析序列保守區(qū)對(duì)Gallus、Taeniopygia、Mus、Ruttus的I-FABP的CDS進(jìn)行分析得到保守區(qū)序列YoursitehereCODEHOP原理方法：http://bioinformatics.weizmann.ac.il/blocks/codehop.htmlYoursitehere簡并PCR技術(shù)RNAcDNAcDNA反轉(zhuǎn)錄合并產(chǎn)物分裝產(chǎn)物β-actin樣品PCRYoursitehere簡并PCR技術(shù)使用標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)體系并適當(dāng)增大引物濃度（1-3μM）退火溫度是最關(guān)鍵點(diǎn)：采用Touchdown方法優(yōu)化條件采用梯度PCR優(yōu)化條件使用熱啟動(dòng)PCR循環(huán)數(shù)增加至50cycles電泳檢測至關(guān)重要不用二次擴(kuò)