基因芯片技術(shù)及臨床應(yīng)用府偉靈西南醫(yī)院檢驗科基因芯片技術(shù)及臨床應(yīng)用府偉靈一.概述隨著人類基因組測序計劃的逐步實施以及分子生物學相關(guān)學科的迅猛發(fā)展，越來越多的動植物、微生物基因組序列得到測定。在GenBank數(shù)據(jù)庫中已含有300萬個序列，總數(shù)超過22億個堿基對，其中包括19種不同生物體的完整序列、近9000個已知功能或已推測功能的人類基因序列。基因序列數(shù)據(jù)庫正在以前所未有的速度迅速增長。2一.概述隨著人類基因組測序計劃的逐步實施以及分子生物學相關(guān)學然而如何充分利用新序列信息資源，怎樣去研究如此眾多基因的生物信息及其在生命過程中所擔負的功能，成為生命科學工作者的共同課題。3然而如何充分利用新序列信息資源，怎樣去研究如此眾多基因的生物已建立的諸如Northern印跡、RNA酶保護實驗、S1核酸酶分析、噬斑雜交以及狹線印跡等方法不能提供足夠通量來有效地利用新的基因組學的資源。為此，必須發(fā)展高通量或平行監(jiān)測基因表達的新方法?；蛐酒夹g(shù)正是在這樣的背景下應(yīng)運而生。4已建立的諸如Northern印跡、RNA酶保護實驗、S1核酸早在80年代初期，有人就曾設(shè)想利用計算機半導體技術(shù)生產(chǎn)基因芯片以對人類基因大量的遺傳信息進行分析和檢查。5早在80年代初期，有人就曾設(shè)想利用計算機半導體技術(shù)生產(chǎn)基因芯但直到1994年P(guān)ease等人創(chuàng)造的光導原位合成高密、微化的寡核苷酸陣列(ODTA)的制作技術(shù)問世之后，才使該設(shè)想逐步成為現(xiàn)實。因此可以說光導ODTA化學合成法，為基因芯片技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。6但直到1994年P(guān)ease等人創(chuàng)造的光導原位合成高密、微化現(xiàn)在全世界已有十多家公司從事基因芯片研究和開發(fā)工作，而且已有較為成型的產(chǎn)品和設(shè)備問世。這些公司主要以美國的Affymetrix公司為代表。圖片來自益來基因網(wǎng):/美國“Fortune”雜志在1997年3月對基因芯片技術(shù)未來產(chǎn)業(yè)化的前景進行了重點介紹。7現(xiàn)在全世界已有十多家公司從事基因芯片研究和開發(fā)工作，而且已有二.基因芯片的定義又稱DNA芯片，是指將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，有規(guī)律地排列固定于支持物上，然后與待測的標記樣品的基因按堿基配對原理進行雜交，再通過激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進行掃描，并配以計算機系統(tǒng)對每一探針上的熒光信號作出比較和檢測，從而迅速得出所要的信息。8二.基因芯片的定義又稱DNA芯片，是指將許多特定的寡核苷酸片三.基因芯片相關(guān)技術(shù)及其進展基因芯片制備技術(shù)靶基因的制備雜交和檢測基因芯片設(shè)計雜交圖像分析……PCR擴增靶基因標記原位合成合成點樣芯片雜交雜交檢測數(shù)據(jù)分析實際應(yīng)用提出問題芯片設(shè)計芯片制作試樣處理表達差異分析多態(tài)性分析再測序生物信息學數(shù)學優(yōu)化數(shù)據(jù)庫標準化9三.基因芯片相關(guān)技術(shù)及其進展基因芯片制備技術(shù)基因芯片設(shè)計PC10101.基因芯片的主要類型基因芯片視分類方法不同可分為不同類型探針陣列形式原位合成合成點樣光引導聚合法噴墨打印合成法（壓電打印法）片基或支持物無機芯片有機合成物芯片111.基因芯片的主要類型基因芯片視分類方法不同可分為不同類型探基因芯片的主要類型及其簡要特點12基因芯片的主要類型及其簡要特點122.基因芯片的制備基因芯片的實質(zhì)是高度集成的寡核苷酸陣列制造基因芯片首先要解決的技術(shù)問題就是如何在芯片片基上定位合成高密度的核酸探針132.基因芯片的制備基因芯片的實質(zhì)是高度集成的寡核苷酸陣列13原位合成直接在芯片上用四種核苷酸合成所需的探針合成點樣將已經(jīng)合成好的探針定位在芯片上基因芯片制備的兩種基本方法14原位合成基因芯片制備的兩種基本方法14原位光刻合成由美國Affymetrix公司開發(fā)AffymetrixWebsite:/PicturefromUKBF:http://www.ukbf.fu-berlin.de/15原位光刻合成由美國Affymetrix公司開發(fā)Affymet把玻璃基片上的活性羥基修飾上光保護基團，此光保護基團可被一定波長的光激活并脫保護。根據(jù)所要制作的陣列的需要設(shè)計光刻掩膜。將掩膜（M1）覆蓋在修飾過的基片上，用光照射使曝光區(qū)域的基片表面脫除保護基團而形成活性羥基（1-2）。步驟16把玻璃基片上的活性羥基修飾上光保護基團，此光保護基團可被一定引入5`端被X基團保護、3`端被活化的單核苷酸dNTP，使dNTP的3`端與基片上的活性羥基縮合，洗去未有效結(jié)合的dNTP（3）。更換掩膜M2，重復1-2，直到所需要的探針陣列合成完畢（4-6）。17引入5`端被X基團保護、3`端被活化的單核苷酸dNTP，使d使用多種掩蓋物能以更少的合成步驟生產(chǎn)出高密度的陣列，在合成循環(huán)中探針數(shù)目呈指數(shù)增長。某一含ｎ個核苷酸的寡聚核苷酸，通過4×n個化學步驟能合成出4n個可能結(jié)構(gòu)。例如：一個完整的十核苷酸通過32個化學步驟，8個小時可能合成65,536（即216）個探針。PictureFromBROWNLAB/pbrown/18使用多種掩蓋物能以更少的合成步驟生產(chǎn)出高密度的陣列，在合成循原位噴印合成芯片原位噴印合成原理與噴墨打印類似，不過芯片噴印頭和墨盒有多個，墨盒中裝的是四種堿基等液體而不是碳粉。采用的化學原理與傳統(tǒng)的DNA固相合成一致，因此不需要特殊制備的化學試劑。PicturefromBioDot:19原位噴印合成芯片原位噴印合成原理與噴墨打印類似，不過芯片噴印分子印章多次壓印合成法根據(jù)所需微陣列，設(shè)計有凹凸的微印章，然后根據(jù)預先設(shè)計在制備的各級印章上涂上對應(yīng)的單核苷酸。按照設(shè)計的順序?qū)⒉煌奈⒂≌轮饌€依次壓印在同一基片上，得到256×256陣列的高密度基因芯片。

圖片來自益來基因網(wǎng):/20分子印章多次壓印合成法根據(jù)所需微陣列，設(shè)計有凹凸的微印章，然256*256分子印章陣列顯微圖

（0.18%)高密度芯片DNA陣列顯微圖（0.16%）高密度芯片DNA陣列熒光雜交圖（0.09%）

圖片來自益來基因網(wǎng):/分子印章多次壓印合成法點樣機21256*256分子印章陣列顯微圖

（0.18%)高密度芯片采用了平面微細加工技術(shù)，可實現(xiàn)大批量生產(chǎn)。通過提高集成度，降低單個芯片的成本可組裝大量的（104--106種）生物分子探針，獲取信息量大，效率高，特別適合于基因信息的采集。結(jié)合微機械技術(shù)（MEMS），可把生物樣品的預處理，基因物質(zhì)的提取，擴增，以及雜交后的信息檢測相集成，制備成微物芯片。優(yōu)勢與特點22采用了平面微細加工技術(shù)，可實現(xiàn)大批量生產(chǎn)。通過提高集成度，降高密度——分辨率高準確性——合成產(chǎn)率高一致性——工藝最優(yōu)化批量化——平面印刷法23高密度——分辨率高23合成點樣合成點樣技術(shù)在基因芯片尚處于實驗研究階段時是唯一的芯片制造手段，曾一度被原位合成技術(shù)的光芒所掩蓋。隨著原位合成技術(shù)缺點的暴露和自動化技術(shù)的進步，合成點樣技術(shù)又重現(xiàn)生機。24合成點樣合成點樣技術(shù)在基因芯片尚處于實驗研究階段時是唯一的芯是將合成好的探針、cDNA或基因組DNA通過特定的高速點樣機器人直接點在芯片上。目前，除Affymetrix等研究和生產(chǎn)基因芯片的少數(shù)大公司使用原位合成外，其他中小型公司和實驗室研究中仍然普遍采用合成點樣法。

微型機械點樣法化學噴射法＋25是將合成好的探針、cDNA或基因組DNA通過特定的高速點樣機微型機械點樣法該技術(shù)由Shalon和Brown于1995年發(fā)展起來的另一類具有生命力的基因芯片制備技術(shù)。美國Synteni公司最終發(fā)展出商品儀器，完成其商品化。26微型機械點樣法該技術(shù)由Shalon和Brown于1995年發(fā)通過毛細作用使用點樣針將生化物質(zhì)轉(zhuǎn)移到固體基底表面（點樣針與基底表面接觸）。第一輪結(jié)束后，清洗點樣針進行下一輪操作。機器人控制系統(tǒng)可使其實現(xiàn)自動化生產(chǎn)。方法與步驟27通過毛細作用使用點樣針將生化物質(zhì)轉(zhuǎn)移到固體基底表面（點樣針與化學噴射法此種方法先進之處在于采用了壓電和其他推動方式從微型噴嘴向固體表面轉(zhuǎn)移生化成分。該技術(shù)正由IncytePharmaceuticals(PaloAlto,CA,USA)和Protogene(PaloAlto,CA,USA)等幾處中心進行發(fā)展。28化學噴射法此種方法先進之處在于采用了壓電和其他推動方式從微型用與壓電接口（方型）相連的微型噴嘴將生化物質(zhì)噴向基底，通過電流控制使樣品體積得到精確控制。第一輪結(jié)束后，清洗噴嘴進行下一步。方法與步驟29用與壓電接口（方型）相連的微型噴嘴將生化物質(zhì)噴向基底，通過電芯片制作工藝的進展1980年Bains等將預先合成的短DNA片段固定在固相支持物上進行的雜交測序?qū)嶒炇腔蛐酒淖钤寄Ｐ?，所以合成點樣是基因芯片制作的最原始的方法由Affymetrix公司發(fā)展起來的光導ODTA合成照相平板印刷術(shù)將基因芯片引入了工業(yè)化生產(chǎn)的階段。30芯片制作工藝的進展1980年Bains等將預先合成的短DNA將樣品處理、芯片雜交和信號檢測集于一體的所謂“縮微實驗室”逐漸成為基因芯片發(fā)展的新趨勢。在這方面主要有以下技術(shù)較為成功：電子芯片三維芯片流過式芯片石英諧振芯片31將樣品處理、芯片雜交和信號檢測集于一體的所謂“縮微實驗室”逐電子芯片片基為帶有正電荷的硅片，硅片經(jīng)熱氧化，制成1mm2的陣列，每個陣列含多個微電極，在每個電極上通過氮化硅沉積和蝕刻制備出樣品池。將鏈連有親和素的瓊脂糖覆蓋在電極上，在電場作用下預先合成的生物素標記的探針即可結(jié)合在特定電極上。AVIfromNanogen:/32電子芯片片基為帶有正電荷的硅片，硅片經(jīng)熱氧化，制成1mm2的PicturefromNanognewebsite:/最早由美國Nanogen公司開發(fā)，目前國內(nèi)清華大學和復旦大學也在開發(fā)這一技術(shù)。最大特點：雜交速度快，可大大縮短分析時間。最大不足：芯片制備復雜、成本較高。33PicturefromNanognewebsite:三維芯片片基上為大量的微小聚乙烯酰胺凝膠條，每個凝膠條可用DNA分析。先把已知化合物加在凝膠條上，用3cm長的微型玻璃毛細管將待測樣品加到凝膠條上。34三維芯片片基上為大量的微小聚乙烯酰胺凝膠條，每個凝膠條可用D凝膠條的三維化能加進更多的已知物質(zhì)，增加了敏感性?？梢栽谛酒贤瑫r進行擴增與檢測。是該技術(shù)不僅可以用于基因芯片，也可以制作蛋白芯片。美國的Packard、摩托羅拉、Argonne國家實驗室三家機構(gòu)與俄羅斯Engelhardt分子生物學研究所合作開發(fā)。應(yīng)用優(yōu)勢35凝膠條的三維化能加進更多的已知物質(zhì)，增加了敏感性。美國的Pa流過式芯片在芯片片基上制成格柵狀微通道，將預先設(shè)計及合成的特定寡核苷酸探針結(jié)合于芯片上微通道內(nèi)的特定區(qū)域。PicutrefromUKMSTSSuimmitConference:http://www.cmf.rl.ac.uk/presentations/36流過式芯片在芯片片基上制成格柵狀微通道，將預先設(shè)計及合成的特從待測樣品中分離DNA或RNA并對其進行熒光標記。將標記的靶核酸樣品流過芯片，固定在芯片上微通道內(nèi)的寡核苷酸探針捕獲與之相互補的靶核酸。PicutrefromUKMSTSSuimmitConference:http://www.cmf.rl.ac.uk/presentations/37從待測樣品中分離DNA或RNA并對其進行熒光標記。Picut特點敏感性高，由于寡核苷酸吸咐表面的增大，流過式芯片可監(jiān)測稀有基因表達的變化。速度快，微通道加速了雜交反應(yīng)，減少了每次檢測所需時間。價格降低，由于采用了特殊的共價化學技術(shù)將寡核苷酸吸咐于微通道內(nèi)，使每一種流過式芯片可反復使用多次，從而使其成本降低。GeneLogic正在開發(fā)38特點GeneLogic正在開發(fā)http://www.g3.靶基因樣品的制備靶基因的制備需要運用常規(guī)手段從細胞和組織中提取模板分子，進行模板的擴增和標記。靶基因樣品的制備方法將根據(jù)基因芯片的類型和所研究的對象（如mRNA、DNA等）而決定。393.靶基因樣品的制備靶基因的制備需要運用常規(guī)手段從細胞和組織3.1靶基因的制備核酸樣品制備是基因芯片分析的必須步驟，傳統(tǒng)的化學提取法比較費時，不能滿足基因芯片對快速高效的要求。因而，人們發(fā)明了與芯片相結(jié)合的核酸提取方法。芯片微過濾法生物電子芯片法403.1靶基因的制備核酸樣品制備是基因芯片分析的必須步驟，傳賓夕法尼亞大學的研究小組針對人白細胞的分離設(shè)計的一種核酸樣品制備方法。微過濾芯片是通過在硅片上刻出幾個微米大小的各種形狀的過濾微通道，再在硅芯片上加上一塊玻璃蓋片而成。發(fā)展經(jīng)歷了豎式Z型結(jié)構(gòu)、豎式條狀梳式結(jié)構(gòu)到最終的橫壩式結(jié)構(gòu)。芯片微過濾法41賓夕法尼亞大學的研究小組針對人白細胞的分離設(shè)計的一種核酸樣品為了把不同的癌細胞、細菌或病毒從血清、水樣或其他液體樣品中分離而設(shè)計的用作介電電泳的細胞分離方法。通過在硅芯片上制作一系列各種排列的金屬電極和在這些電極上施加高頻電場，使不同的細胞內(nèi)感應(yīng)出偶電極。偶電極的出現(xiàn)反過來使細胞承受正介電力或負介電力，從而使細胞從各種液體樣品中分離出來。生物電子芯片法PicturefromNanogenwebsite:42為了把不同的癌細胞、細菌或病毒從血清、水樣或其他液體樣品中分美國的Nanogen公司通過在微過濾芯片的電極上施加一系列高壓脈沖對電極上分離得到的大腸桿菌細胞進行進行電子胞解，獲得了大腸桿菌細胞內(nèi)的各種RNA和DNA。PicturefromNanogenwebsite:43美國的Nanogen公司通過在微過濾芯片的電極上施加一系列高3.2靶基因的擴增與標記主要采用熒光分子標記：常規(guī)標記——在擴增過程中加入含有熒光標記的dNTP（至少一種為熒光標記）。末端標記——直接在引物上標記熒光。443.2靶基因的擴增與標記主要采用熒光分子標記：444.靶基因的雜交及其信號檢測熒光顯影法質(zhì)譜法化學發(fā)光法光導纖維法壓電石英諧振法……ScanningmRNALabelingHybridizationCellAVIfromNanogen:/454.靶基因的雜交及其信號檢測熒光顯影法ScanningmRN4.1熒光顯影法用熒光素標記擴增后的待測核酸樣品，將熒光素標記的待測核酸樣品與芯片進行雜交，再洗去未雜交的標記樣品，然后用熒光顯微鏡或熒光掃描儀對芯片進行掃描以采集每點的熒光強度并用電腦進行分析比較。464.1熒光顯影法用熒光素標記擴增后的待測核酸樣品，將熒光素激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)目前應(yīng)用最廣泛的熒光檢測系統(tǒng)。芯片倒扣在盛有待檢核酸的儲液器上，芯片的探針與液面相接觸并進行雜交反應(yīng)，能與靶核酸互補的探針對標記有熒光素的待檢核酸起捕獲作用。當激光從芯片的背面聚焦于芯片與靶DNA的接觸面時，與待檢核酸雜交了的位點就被激發(fā)熒光，熒光信號經(jīng)棱鏡后聚焦于空間共聚焦小孔，并通過小孔而被檢測器捕獲。47激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)目前應(yīng)用最廣泛的熒光檢測系統(tǒng)。芯片倒扣雖然激光同時也會激發(fā)儲液器里未與芯片雜交的標記靶核酸，但由于它們不在共聚焦小孔的焦平面，故這種熒光被小孔阻擋而不能到達檢測器。應(yīng)用激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)在數(shù)分鐘內(nèi)即可得到一個二維的雜交模式，通過改變溫度還可以得到雜交的熱動力學信息。48雖然激光同時也會激發(fā)儲液器里未與芯片雜交的標記靶核酸，但由于熱力學穩(wěn)定性完全正常的Watson-Crick配對雙鏈>錯配堿基的雙鏈熒光強度完全正常的Watson-Crick配對雙鏈>錯配堿基的雙鏈（5-35%）49熱力學穩(wěn)定性49熒光掃描儀簡介電荷偶合裝置CCD（charge-coupleddevices）光電倍增管PMT（photomultipliertube）50熒光掃描儀簡介電荷偶合裝置50圖片來自益來基因網(wǎng):/CCD成像技術(shù)：主要用于中、高密度基因芯片的檢測51圖片來自益來基因網(wǎng):http://www.el-gene.商業(yè)化掃描儀公司GenomicSolutions公司Packard公司GSI公司BeecherInstruments公司MolecularDynamicsGeneticMicrosystems公司AxonInstruments公司……52商業(yè)化掃描儀公司GenomicSolutions公司524.2化學發(fā)光法化學發(fā)光與熒光法的基本原理類似，但標記物不是熒光素而是魯米諾之類具有化學發(fā)光特性的物質(zhì)?；瘜W發(fā)光比熒光法的靈敏度更高。

534.2化學發(fā)光法化學發(fā)光與熒光法的基本原理類似，但標記物不4.3光導纖維法將合成的氰脲酰氯活化的寡核苷酸探針固定在直徑200μm的光纖末端，然后固定有不同探針的光纖按特定位置組合成束，形成一個微陣列的傳感裝置即光纖DNA生物傳感器微陣列。其探針末端可以伸入樣品溶液中，雜交的熒光信號由光纖另一端偶聯(lián)的CCD相機接受。整個分析操作可在5分鐘內(nèi)完成。

544.3光導纖維法將合成的氰脲酰氯活化的寡核苷酸探針固定在直4.4光導纖維法光纖DNA生物傳感器微陣列的探針敏感膜可以再生使用，因而成本得以降低。這種將傳感器與微陣列結(jié)合起來的方法特別適用于操作雜交分析不方便的環(huán)境和不具備激光共聚焦顯微鏡這種昂貴設(shè)備的實驗室（如臨床檢測實驗室），對推廣基因芯片的應(yīng)用有重要意義。

554.4光導纖維法光纖DNA生物傳感器微陣列的探針敏感膜可以4.5壓電石英諧振法傳感裝置采用壓電石英諧振晶體目前正在開發(fā)之中564.5壓電石英諧振法傳感裝置采用壓電石英諧振晶體564.6壓電石英諧振法石英諧振DNA生物傳感器微陣列比光纖DNA生物傳感器微陣列更具優(yōu)越性石英諧振傳感器具有微天平之稱，敏感性很高（理論上可達到fg級水平），有望省略雜交前的擴增步驟。石英諧振傳感器的響應(yīng)機制是“壓電效應(yīng)”，即對質(zhì)量敏感，所以無須對探針或靶核酸進行標記。

574.6壓電石英諧振法石英諧振DNA生物傳感器微陣列比光纖D四.基因芯片的臨床應(yīng)用1998年底美國科學促進會將基因芯片列為1998年度自然科學領(lǐng)域十大進展之一

58四.基因芯片的臨床應(yīng)用1998年底美國科學促進會將基因芯片列1.核酸序列分析雜交測序技術(shù)（SBH）鄰堆雜交技術(shù)（CSH）毛細管電泳芯片測序技術(shù)591.核酸序列分析雜交測序技術(shù)（SBH）591.1雜交測序技術(shù)基因芯片發(fā)展和應(yīng)用的基礎(chǔ)。任何線性DNA或RNA單鏈均可分解為一系列堿基數(shù)固定、錯落重疊的寡核苷酸片段（ODT），或稱為亞序列（subsequence）CAGCTCCATAT①CAGCTCCA②AGCTCCAT③GCTCCATA④CTCCATAT601.1雜交測序技術(shù)基因芯片發(fā)展和應(yīng)用的基礎(chǔ)。CAGCTCC將所有n體亞序列探針都固定在一個固相支持物上，n體亞序列探針的序列與其在固相支持物上的位點一一對應(yīng)形成探針陣列。被標記的靶序列與芯片進行雜交后，芯片上所有雜交信號的位點組成一個“雜交模式”，該“雜交模式”實際上反應(yīng)的是靶序列的所有n體亞序列信息，計算機通過對該“雜交模式”的分析就可以確定靶核酸的序列。

方法與步驟61將所有n體亞序列探針都固定在一個固相支持物上，n體亞序列探針采用SBH技術(shù)，用含65,536個8聚寡核苷酸的微陣列，可測定200bp長DNA序列，采用67,108,864個13聚寡核苷酸探針的微陣列，可對數(shù)千個堿基長的DNA測序。

62采用SBH技術(shù)，用含65,536個8聚寡核苷酸的微陣列，可測1.2鄰堆雜交技術(shù)SBH技術(shù)的效率隨著微陣列中寡核苷酸數(shù)量與長度的增加而提高，但微陣列中寡核苷酸數(shù)量與長度的增加則提高了微陣列的復雜性，降低了雜交準確性。

CSH技術(shù)彌補了SBH技術(shù)存在的弊端，CSH技術(shù)的應(yīng)用增加了微陣列中寡核苷酸的有效長度，加強了序列準確性，可進行較長的DNA測序。

631.2鄰堆雜交技術(shù)SBH技術(shù)的效率隨著微陣列中寡核苷酸數(shù)量CSH雜交測序原理示意圖（點擊此處觀看Flash動畫）64CSH雜交測序原理示意圖（點擊此處觀看Flash動畫）641.3毛細管電泳芯片測序技術(shù)Mathies等成功地應(yīng)用通過光刻加工出的毛細管長3.5厘米、橫切面50微米×8微米的毛細管電泳測序芯片在10分鐘內(nèi)完成了含433堿基對的DNA序列測定。美國的CuraGen公司和普林斯頓大學也正在從事這類芯片的研究開發(fā)工作。

651.3毛細管電泳芯片測序技術(shù)Mathies等成功地應(yīng)用通過2.基因表達分析隨著人類基因組計劃的順利進行，基因組研究的重心轉(zhuǎn)了功能基因組學，研究基因的功能，特別是研究疾病相關(guān)基因已成了生物科技界的熱點?；虮磉_芯片為此提供了最好的技術(shù)平臺。662.基因表達分析隨著人類基因組計劃的順利進行，基因組研究的對大多數(shù)基因而言，mRNA表達水平與其蛋白質(zhì)的水平相對應(yīng)。PicturefromIIR:http://www.inet.uni2.dk/~iirrh/IIRhome.htm67對大多數(shù)基因而言，mRNA表達水平與其蛋白質(zhì)的水平相對應(yīng)。P一般以O(shè)ligo-dT作引物進行RT-PCR制備靶基因，對細胞內(nèi)大量基因的mRNA表達差異進行檢測，從而了解細胞的性質(zhì)與狀態(tài)?；蛐酒夹g(shù)可清楚地直接快速地檢測出以1:300,000水平出現(xiàn)的mRNA，且易于同時監(jiān)測成千上萬的基因。68一般以O(shè)ligo-dT作引物進行RT-PCR制備靶基因，對細RRRRGG:

A>B:

A=B:

A<BSample

ASample

Bpreparation

of

mRNAlabeled

cDNAmixinghybridizationpreparation

of

mRNAlabeled

cDNA基因表達分析示意圖69RRRRGG:A>B:A=B:A<BSampleAS由于生物芯片技術(shù)可直接測到mRNA的種類及豐度，所以它是研究基因表達的有力工具?；蛐酒N包含了幾萬種人工合成的寡核苷酸探針或cDNA，可檢測轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物從幾個數(shù)量級到每個細胞的幾個拷貝，均能被定量研究，被檢測目的基因可多達10,000個。70由于生物芯片技術(shù)可直接測到mRNA的種類及豐度，所以它是研究系統(tǒng)微型化，樣品需量極小同時研究上萬個基因的表達變化，研究效率明顯提高能更多地揭示基因之間表達變化的相互關(guān)系，從而研究基因與基因之間內(nèi)在的作用關(guān)系檢測基因表達變化的靈敏度高，可檢測豐度相差幾個數(shù)量級的表達情況節(jié)約費用和時間表達譜基因芯片研究基因表達與傳統(tǒng)的NorthernBlot相比有許多重要的優(yōu)點71系統(tǒng)微型化，樣品需量極小表達譜基因芯片研究基因表達與傳統(tǒng)的3.尋找新基因定量檢測大量基因表達水平在闡述基因功能、探索疾病原因及機理、發(fā)現(xiàn)可能的診斷及治療等方面是很有價值的?；蛐酒夹g(shù)在發(fā)現(xiàn)新基因及分析各個基因在不同時空表達方面時一項十分有用的技術(shù)，它具有樣品用量極少，自動化程度高等優(yōu)點，便于大量篩選新基因。723.尋找新基因定量檢測大量基因表達水平在闡述基因功能、探索疾目前，大量人類ESTs給cDNA微陣列提供了豐富的資源，數(shù)據(jù)庫中400,000個ESTs代表了所有人類基因，成千上萬的ESTs微陣列將為人類基因表達研究提供強有力的分析工具。這將大大地加速人類基因組的功能分析。73目前，大量人類ESTs給cDNA微陣列提供了豐富的資源，數(shù)據(jù)4.突變體和多態(tài)性檢測腫瘤和遺傳性疾病發(fā)生的根本原因是由于遺傳物質(zhì)發(fā)生了改變。檢測基因突變對于闡明腫瘤與遺傳病的分子機制、疾病的早期診斷具有重要意義。744.突變體和多態(tài)性檢測腫瘤和遺傳性疾病發(fā)生的根本原因是由于遺以往研究突變和多態(tài)時多采用PCR-SS-CP、手工或自動測序、異源雙鏈分析、蛋白截短檢測等方法，所有這些都需經(jīng)過電泳環(huán)節(jié)，不能滿足大規(guī)模、低消耗和自動化的要求。應(yīng)用基因芯片方法檢測時可克服上述不足，且與DNA聚合酶或連接酶結(jié)合檢測時可獲得更高的分辨率75以往研究突變和多態(tài)時多采用PCR-SS-CP、手工或自動測序Hacia等用含有96,000個寡核苷酸探針的基因芯片來檢測遺傳性乳腺癌基因BRCA1第11外顯子3.45kb長度內(nèi)的所有可能的雜合性突變，包括堿基替換及小的插入、缺失等，并借此確定發(fā)病風險?；蛐酒部捎糜诜伟?、卵巢癌、前列腺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤的研究中，為腫瘤基因組解剖計劃（CGAP）的完成提供重要的技術(shù)支持。76Hacia等用含有96,000個寡核苷酸探針的基因芯片來檢測Lipshutz等證明基因芯片可用來篩查HIV病毒的蛋白酶基因和反轉(zhuǎn)錄酶基因的突變。這些突變能引起對抗生素，如AZT等的抗性。Affymetrix公司已制造出商用HIV芯片，包括1,040個蛋白酶和反轉(zhuǎn)錄酶基因，用來研究病毒抗性發(fā)展過程中的堿基突變。77Lipshutz等證明基因芯片可用來篩查HIV病毒的蛋白酶基Chee等制造了含有135,000個25-mer探針的基因芯片來探測16.6kb的人線粒體基因組。共分析了10個樣本，檢出505個多態(tài)。每個樣本可在12min內(nèi)閱讀完畢，正確率達99%。據(jù)估測，每一工作日可閱讀40個線粒體基因組，大大高于現(xiàn)在凝膠測序儀可達到的每日2個基因組水平。基因芯片除可用于研究mtDNA基因突變以及民族內(nèi)和民族間mtDNA的多態(tài)性外，還可用來揭示mtDNA基因的表達與神經(jīng)性疾病和長壽等關(guān)系。78Chee等制造了含有135,000個25-mer探針的基因芯SBH技術(shù)可大規(guī)模地檢測和分析DNA的變異及多態(tài)性。PicturefromNCBIwebsite.突變79SBH技術(shù)可大規(guī)模地檢測和分析DNA的變異及多態(tài)性。Pict基因芯片技術(shù)是一項高效、準確的DNA序列分析技術(shù)，將基因芯片技術(shù)用于檢測分子突變，不僅可準確地確定突變位置和類型，更可同時檢測多個基因，及至整個基因組的突變，其快速高效是其它方法無法比擬的。80基因芯片技術(shù)是一項高效、準確的DNA序列分析技術(shù)，將基因芯片基因芯片技術(shù)用于基因組研究可創(chuàng)造第三代遺傳圖，即將遺傳病表型于DNA上特定的基因序列聯(lián)系起來。以單核苷酸多態(tài)性（SNPs)為標記可幫助區(qū)分兩個個體遺傳物質(zhì)的差異，若能將所有SNPs全部信息裝入生物芯片則可檢測到與之相關(guān)的基因間差異。多態(tài)性分析81基因芯片技術(shù)用于基因組研究可創(chuàng)造第三代遺傳圖，即將遺傳病表型5.后基因組研究基因組測序完成后，未知基因的功能研究是一個十分誘人的后基因組研究課題。

斯坦福大學的Davis研究小組的研究提示DNA芯片技術(shù)將來可能應(yīng)用于人類基因組測序完成后未明開放讀碼框架ORF生物學功能的研究，可能會對深刻認識生命現(xiàn)象及藥物設(shè)計帶來重大影響。825.后基因組研究基因組測序完成后，未知基因的功能研究是一個十Davis研究小組利用DNA芯片技術(shù)對酵母缺失突變株進行定量分析以確定酵母全序列測定完成后新發(fā)現(xiàn)的ORF的生物學功能。他們應(yīng)用基因打靶技術(shù)產(chǎn)生多個ORF缺失的酵母突變株，并在缺失ORF旁引入20個核苷酸的標志序列作為缺失ORF的身份標志，謂之"分子條形碼"（molecularbarcodes），分子條形碼可與基因芯片上的探針進行雜交以便于篩選。這樣，ORF的功能測試可通過一次雜交及用同一生長選擇條件完成，大大提高了效率和準確性。83Davis研究小組利用DNA芯片技術(shù)對酵母缺失突變株進行定量7.疾病診斷遺傳病相關(guān)基因的定位腫瘤疾病的診斷感染性疾病的診斷847.疾病診斷遺傳病相關(guān)基因的定位847.1遺傳病相關(guān)基因的定位隨著HGP的發(fā)展，各種方法相繼創(chuàng)立，并應(yīng)用到基因定位中。基因芯片技術(shù)已成為一種基因定位的高效工具。配合使用多重PCR/基因芯片，可一次篩查多種遺傳病，既經(jīng)濟又敏感可靠。857.1遺傳病相關(guān)基因的定位隨著HGP的發(fā)展，各種方法相繼創(chuàng)7.2感染性疾病的診斷HIV-1基因組中的rt與pro在疾病過程中易發(fā)生多種變異，從而導致對多種藥物的抗藥性，因此，檢測和分析其變異性與多態(tài)性具有重要臨床意義。……可以預測，在不久的將來，人們可望在一張基因芯片上檢測幾乎所有的病原微生物基因。867.2感染性疾病的診斷HIV-1基因組中的rt與pro在疾8.基因文庫圖譜繪制通過確定重復基因的程度，基因芯片已用來對基因組文庫進行圖譜繪制。基因方庫中的每個克隆的所有化學反應(yīng)均一個反應(yīng)管，可以快速平行地對多克隆進行圖譜繪制。每人每天可對幾百個克隆進行基因圖譜繪制。878.基因文庫圖譜繪制通過確定重復基因的程度，基因芯片已用來對9.其它應(yīng)用藥物篩選藥物作用機制研究毒理學研究基因掃描環(huán)境化學毒物的篩選耐藥菌株和藥敏檢測889.其它應(yīng)用藥物篩選環(huán)境化學毒物的篩選88五.基因芯片相關(guān)生物信息學問題基因芯片上核酸探針的選擇和序列設(shè)計，以及基因芯片雜交后信息的分析、處理和建庫。兩個方面的內(nèi)容：89五.基因芯片相關(guān)生物信息學問題基因芯片上核酸探針的選擇和序列基因芯片所獲大量的基因及其基因相互作用信息，為生物信息學研究和生物數(shù)據(jù)庫的挖掘提供了高效、快速和方便的實驗工具，拓寬了生物信息學的研究內(nèi)容。90基因芯片所獲大量的基因及其基因相互作用信息，為生物信息學研究芯片設(shè)計的主要內(nèi)容及相關(guān)生物信息學問題根據(jù)基因芯片的分析目標，從相關(guān)基因數(shù)據(jù)庫中選取特異性基因序列，使之能夠通過與靶基因雜交而給出明確、可靠、易于分析的分子及其相互作用信息。91芯片設(shè)計的主要內(nèi)容及相關(guān)生物信息學問題根據(jù)基因芯片的分析目標根據(jù)所選用的核酸序列進行探針序列及其布局設(shè)計，使所設(shè)計的探針組合對靶基因的雜交特異性強，探針之間關(guān)聯(lián)性好。92根據(jù)所選用的核酸序列進行探針序列及其布局設(shè)計，使所設(shè)計的探針探針及其空間布局的優(yōu)化：包括探針制備工藝的優(yōu)化和探針雜交的優(yōu)化等諸多方面。93探針及其空間布局的優(yōu)化：包括探針制備工藝的優(yōu)化和探針雜交的優(yōu)六.基因芯片的建庫與數(shù)據(jù)分析高密度芯片獲的分子信息，已很難運用傳統(tǒng)的論文形式來發(fā)表。目前，一些研究者通過把基因芯片的表達譜公布在自己實驗室網(wǎng)站上，供其他研究者的訪問與交流。94六.基因芯片的建庫與數(shù)據(jù)分析高密度芯片獲的分子信息，已很難運由于網(wǎng)站分散以及各實驗室所用芯片缺乏標準，使不同實驗室之間的數(shù)據(jù)交流和分析存在一定困難。基因芯片數(shù)據(jù)標準化問題已引起人們越來越多的重視，人們正考慮建立相應(yīng)的芯片數(shù)據(jù)庫。95由于網(wǎng)站分散以及各實驗室所用芯片缺乏標準，使不同實驗室之間的一些公司與研究機構(gòu)正在發(fā)展與基因芯片的相關(guān)軟件，用于構(gòu)建和管理基因表達信息的數(shù)據(jù)庫及數(shù)據(jù)比較工具。96一些公司與研究機構(gòu)正在發(fā)展與基因芯片的相關(guān)軟件，用于構(gòu)建和管五.總結(jié)摘要基因芯片技術(shù)作為基因分析的有力武器，不僅被學術(shù)界看重，而且得到很多大公司和多國政府部門的高度重視并投以巨資進行研究開發(fā)。基因芯片技術(shù)在誕生的十幾年內(nèi)就得到巨大的進步，目前已很難從技術(shù)的角度給基因芯片下一個準確的定義。97五.總結(jié)摘要基因芯片技術(shù)作為基因分析的有力武器，不僅被學術(shù)界在芯片技術(shù)中，雖然鄰堆雜交技術(shù)彌補了SBH隨探針延長而特異性降低的不足，但芯片的分子生物學基礎(chǔ)已不再是雜交分析一家的天下，基于毛細管電泳分析的基因芯片已經(jīng)誕生。98在芯片技術(shù)中，雖然鄰堆雜交技術(shù)彌補了SBH隨探針延長而特異性光導ODTA合成平板印刷術(shù)雖然第一次將基因芯片從實驗室?guī)У搅松唐坊臅r代，但特殊的設(shè)備和昂貴的成本以及合成效率的不盡人意使它不能阻止噴印法和它競爭，而且，曾被它取代的合成點樣法也由于自動化技術(shù)的進步而獲得了新生，并在下一代芯片技術(shù)中扮演重要角色。99光導ODTA合成平板印刷術(shù)雖然第一次將基因芯片從實驗室?guī)У搅藗鹘y(tǒng)的核酸樣品制備、DNA片段的化學反應(yīng)制備和芯片雜交分析三步曲更是顯得煩瑣，因而“縮微實驗室”又應(yīng)運而生?；蛐酒哂械母咝Ш怂岱治瞿芰κ顾蛔u為遺傳信息分析方法革命性的里程碑。100傳統(tǒng)的核酸樣品制備、DNA片段的化學反應(yīng)制備和芯片雜交分析三除了核酸測序外，在基因診斷、尋找新基因、研究基因表達、突變檢測、基因多態(tài)性分析、基因指紋分析和后基因組研究等方面得到廣泛應(yīng)用。但是基因芯片也不是十全十美，在靈敏度、特異性、成本等方面都有待改進。101除了核酸測序外，在基因診斷、尋找新基因、研究基因表達、突變檢基因芯片技術(shù)及臨床應(yīng)用府偉靈西南醫(yī)院檢驗科基因芯片技術(shù)及臨床應(yīng)用府偉靈一.概述隨著人類基因組測序計劃的逐步實施以及分子生物學相關(guān)學科的迅猛發(fā)展，越來越多的動植物、微生物基因組序列得到測定。在GenBank數(shù)據(jù)庫中已含有300萬個序列，總數(shù)超過22億個堿基對，其中包括19種不同生物體的完整序列、近9000個已知功能或已推測功能的人類基因序列?；蛐蛄袛?shù)據(jù)庫正在以前所未有的速度迅速增長。103一.概述隨著人類基因組測序計劃的逐步實施以及分子生物學相關(guān)學然而如何充分利用新序列信息資源，怎樣去研究如此眾多基因的生物信息及其在生命過程中所擔負的功能，成為生命科學工作者的共同課題。104然而如何充分利用新序列信息資源，怎樣去研究如此眾多基因的生物已建立的諸如Northern印跡、RNA酶保護實驗、S1核酸酶分析、噬斑雜交以及狹線印跡等方法不能提供足夠通量來有效地利用新的基因組學的資源。為此，必須發(fā)展高通量或平行監(jiān)測基因表達的新方法。基因芯片技術(shù)正是在這樣的背景下應(yīng)運而生。105已建立的諸如Northern印跡、RNA酶保護實驗、S1核酸早在80年代初期，有人就曾設(shè)想利用計算機半導體技術(shù)生產(chǎn)基因芯片以對人類基因大量的遺傳信息進行分析和檢查。106早在80年代初期，有人就曾設(shè)想利用計算機半導體技術(shù)生產(chǎn)基因芯但直到1994年P(guān)ease等人創(chuàng)造的光導原位合成高密、微化的寡核苷酸陣列(ODTA)的制作技術(shù)問世之后，才使該設(shè)想逐步成為現(xiàn)實。因此可以說光導ODTA化學合成法，為基因芯片技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。107但直到1994年P(guān)ease等人創(chuàng)造的光導原位合成高密、微化現(xiàn)在全世界已有十多家公司從事基因芯片研究和開發(fā)工作，而且已有較為成型的產(chǎn)品和設(shè)備問世。這些公司主要以美國的Affymetrix公司為代表。圖片來自益來基因網(wǎng):/美國“Fortune”雜志在1997年3月對基因芯片技術(shù)未來產(chǎn)業(yè)化的前景進行了重點介紹。108現(xiàn)在全世界已有十多家公司從事基因芯片研究和開發(fā)工作，而且已有二.基因芯片的定義又稱DNA芯片，是指將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，有規(guī)律地排列固定于支持物上，然后與待測的標記樣品的基因按堿基配對原理進行雜交，再通過激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進行掃描，并配以計算機系統(tǒng)對每一探針上的熒光信號作出比較和檢測，從而迅速得出所要的信息。109二.基因芯片的定義又稱DNA芯片，是指將許多特定的寡核苷酸片三.基因芯片相關(guān)技術(shù)及其進展基因芯片制備技術(shù)靶基因的制備雜交和檢測基因芯片設(shè)計雜交圖像分析……PCR擴增靶基因標記原位合成合成點樣芯片雜交雜交檢測數(shù)據(jù)分析實際應(yīng)用提出問題芯片設(shè)計芯片制作試樣處理表達差異分析多態(tài)性分析再測序生物信息學數(shù)學優(yōu)化數(shù)據(jù)庫標準化110三.基因芯片相關(guān)技術(shù)及其進展基因芯片制備技術(shù)基因芯片設(shè)計PC111101.基因芯片的主要類型基因芯片視分類方法不同可分為不同類型探針陣列形式原位合成合成點樣光引導聚合法噴墨打印合成法（壓電打印法）片基或支持物無機芯片有機合成物芯片1121.基因芯片的主要類型基因芯片視分類方法不同可分為不同類型探基因芯片的主要類型及其簡要特點113基因芯片的主要類型及其簡要特點122.基因芯片的制備基因芯片的實質(zhì)是高度集成的寡核苷酸陣列制造基因芯片首先要解決的技術(shù)問題就是如何在芯片片基上定位合成高密度的核酸探針1142.基因芯片的制備基因芯片的實質(zhì)是高度集成的寡核苷酸陣列13原位合成直接在芯片上用四種核苷酸合成所需的探針合成點樣將已經(jīng)合成好的探針定位在芯片上基因芯片制備的兩種基本方法115原位合成基因芯片制備的兩種基本方法14原位光刻合成由美國Affymetrix公司開發(fā)AffymetrixWebsite:/PicturefromUKBF:http://www.ukbf.fu-berlin.de/116原位光刻合成由美國Affymetrix公司開發(fā)Affymet把玻璃基片上的活性羥基修飾上光保護基團，此光保護基團可被一定波長的光激活并脫保護。根據(jù)所要制作的陣列的需要設(shè)計光刻掩膜。將掩膜（M1）覆蓋在修飾過的基片上，用光照射使曝光區(qū)域的基片表面脫除保護基團而形成活性羥基（1-2）。步驟117把玻璃基片上的活性羥基修飾上光保護基團，此光保護基團可被一定引入5`端被X基團保護、3`端被活化的單核苷酸dNTP，使dNTP的3`端與基片上的活性羥基縮合，洗去未有效結(jié)合的dNTP（3）。更換掩膜M2，重復1-2，直到所需要的探針陣列合成完畢（4-6）。118引入5`端被X基團保護、3`端被活化的單核苷酸dNTP，使d使用多種掩蓋物能以更少的合成步驟生產(chǎn)出高密度的陣列，在合成循環(huán)中探針數(shù)目呈指數(shù)增長。某一含ｎ個核苷酸的寡聚核苷酸，通過4×n個化學步驟能合成出4n個可能結(jié)構(gòu)。例如：一個完整的十核苷酸通過32個化學步驟，8個小時可能合成65,536（即216）個探針。PictureFromBROWNLAB/pbrown/119使用多種掩蓋物能以更少的合成步驟生產(chǎn)出高密度的陣列，在合成循原位噴印合成芯片原位噴印合成原理與噴墨打印類似，不過芯片噴印頭和墨盒有多個，墨盒中裝的是四種堿基等液體而不是碳粉。采用的化學原理與傳統(tǒng)的DNA固相合成一致，因此不需要特殊制備的化學試劑。PicturefromBioDot:120原位噴印合成芯片原位噴印合成原理與噴墨打印類似，不過芯片噴印分子印章多次壓印合成法根據(jù)所需微陣列，設(shè)計有凹凸的微印章，然后根據(jù)預先設(shè)計在制備的各級印章上涂上對應(yīng)的單核苷酸。按照設(shè)計的順序?qū)⒉煌奈⒂≌轮饌€依次壓印在同一基片上，得到256×256陣列的高密度基因芯片。

圖片來自益來基因網(wǎng):/121分子印章多次壓印合成法根據(jù)所需微陣列，設(shè)計有凹凸的微印章，然256*256分子印章陣列顯微圖

（0.18%)高密度芯片DNA陣列顯微圖（0.16%）高密度芯片DNA陣列熒光雜交圖（0.09%）

圖片來自益來基因網(wǎng):/分子印章多次壓印合成法點樣機122256*256分子印章陣列顯微圖

（0.18%)高密度芯片采用了平面微細加工技術(shù)，可實現(xiàn)大批量生產(chǎn)。通過提高集成度，降低單個芯片的成本可組裝大量的（104--106種）生物分子探針，獲取信息量大，效率高，特別適合于基因信息的采集。結(jié)合微機械技術(shù)（MEMS），可把生物樣品的預處理，基因物質(zhì)的提取，擴增，以及雜交后的信息檢測相集成，制備成微物芯片。優(yōu)勢與特點123采用了平面微細加工技術(shù)，可實現(xiàn)大批量生產(chǎn)。通過提高集成度，降高密度——分辨率高準確性——合成產(chǎn)率高一致性——工藝最優(yōu)化批量化——平面印刷法124高密度——分辨率高23合成點樣合成點樣技術(shù)在基因芯片尚處于實驗研究階段時是唯一的芯片制造手段，曾一度被原位合成技術(shù)的光芒所掩蓋。隨著原位合成技術(shù)缺點的暴露和自動化技術(shù)的進步，合成點樣技術(shù)又重現(xiàn)生機。125合成點樣合成點樣技術(shù)在基因芯片尚處于實驗研究階段時是唯一的芯是將合成好的探針、cDNA或基因組DNA通過特定的高速點樣機器人直接點在芯片上。目前，除Affymetrix等研究和生產(chǎn)基因芯片的少數(shù)大公司使用原位合成外，其他中小型公司和實驗室研究中仍然普遍采用合成點樣法。

微型機械點樣法化學噴射法＋126是將合成好的探針、cDNA或基因組DNA通過特定的高速點樣機微型機械點樣法該技術(shù)由Shalon和Brown于1995年發(fā)展起來的另一類具有生命力的基因芯片制備技術(shù)。美國Synteni公司最終發(fā)展出商品儀器，完成其商品化。127微型機械點樣法該技術(shù)由Shalon和Brown于1995年發(fā)通過毛細作用使用點樣針將生化物質(zhì)轉(zhuǎn)移到固體基底表面（點樣針與基底表面接觸）。第一輪結(jié)束后，清洗點樣針進行下一輪操作。機器人控制系統(tǒng)可使其實現(xiàn)自動化生產(chǎn)。方法與步驟128通過毛細作用使用點樣針將生化物質(zhì)轉(zhuǎn)移到固體基底表面（點樣針與化學噴射法此種方法先進之處在于采用了壓電和其他推動方式從微型噴嘴向固體表面轉(zhuǎn)移生化成分。該技術(shù)正由IncytePharmaceuticals(PaloAlto,CA,USA)和Protogene(PaloAlto,CA,USA)等幾處中心進行發(fā)展。129化學噴射法此種方法先進之處在于采用了壓電和其他推動方式從微型用與壓電接口（方型）相連的微型噴嘴將生化物質(zhì)噴向基底，通過電流控制使樣品體積得到精確控制。第一輪結(jié)束后，清洗噴嘴進行下一步。方法與步驟130用與壓電接口（方型）相連的微型噴嘴將生化物質(zhì)噴向基底，通過電芯片制作工藝的進展1980年Bains等將預先合成的短DNA片段固定在固相支持物上進行的雜交測序?qū)嶒炇腔蛐酒淖钤寄Ｐ?，所以合成點樣是基因芯片制作的最原始的方法由Affymetrix公司發(fā)展起來的光導ODTA合成照相平板印刷術(shù)將基因芯片引入了工業(yè)化生產(chǎn)的階段。131芯片制作工藝的進展1980年Bains等將預先合成的短DNA將樣品處理、芯片雜交和信號檢測集于一體的所謂“縮微實驗室”逐漸成為基因芯片發(fā)展的新趨勢。在這方面主要有以下技術(shù)較為成功：電子芯片三維芯片流過式芯片石英諧振芯片132將樣品處理、芯片雜交和信號檢測集于一體的所謂“縮微實驗室”逐電子芯片片基為帶有正電荷的硅片，硅片經(jīng)熱氧化，制成1mm2的陣列，每個陣列含多個微電極，在每個電極上通過氮化硅沉積和蝕刻制備出樣品池。將鏈連有親和素的瓊脂糖覆蓋在電極上，在電場作用下預先合成的生物素標記的探針即可結(jié)合在特定電極上。AVIfromNanogen:/133電子芯片片基為帶有正電荷的硅片，硅片經(jīng)熱氧化，制成1mm2的PicturefromNanognewebsite:/最早由美國Nanogen公司開發(fā)，目前國內(nèi)清華大學和復旦大學也在開發(fā)這一技術(shù)。最大特點：雜交速度快，可大大縮短分析時間。最大不足：芯片制備復雜、成本較高。134PicturefromNanognewebsite:三維芯片片基上為大量的微小聚乙烯酰胺凝膠條，每個凝膠條可用DNA分析。先把已知化合物加在凝膠條上，用3cm長的微型玻璃毛細管將待測樣品加到凝膠條上。135三維芯片片基上為大量的微小聚乙烯酰胺凝膠條，每個凝膠條可用D凝膠條的三維化能加進更多的已知物質(zhì)，增加了敏感性?？梢栽谛酒贤瑫r進行擴增與檢測。是該技術(shù)不僅可以用于基因芯片，也可以制作蛋白芯片。美國的Packard、摩托羅拉、Argonne國家實驗室三家機構(gòu)與俄羅斯Engelhardt分子生物學研究所合作開發(fā)。應(yīng)用優(yōu)勢136凝膠條的三維化能加進更多的已知物質(zhì)，增加了敏感性。美國的Pa流過式芯片在芯片片基上制成格柵狀微通道，將預先設(shè)計及合成的特定寡核苷酸探針結(jié)合于芯片上微通道內(nèi)的特定區(qū)域。PicutrefromUKMSTSSuimmitConference:http://www.cmf.rl.ac.uk/presentations/137流過式芯片在芯片片基上制成格柵狀微通道，將預先設(shè)計及合成的特從待測樣品中分離DNA或RNA并對其進行熒光標記。將標記的靶核酸樣品流過芯片，固定在芯片上微通道內(nèi)的寡核苷酸探針捕獲與之相互補的靶核酸。PicutrefromUKMSTSSuimmitConference:http://www.cmf.rl.ac.uk/presentations/138從待測樣品中分離DNA或RNA并對其進行熒光標記。Picut特點敏感性高，由于寡核苷酸吸咐表面的增大，流過式芯片可監(jiān)測稀有基因表達的變化。速度快，微通道加速了雜交反應(yīng)，減少了每次檢測所需時間。價格降低，由于采用了特殊的共價化學技術(shù)將寡核苷酸吸咐于微通道內(nèi)，使每一種流過式芯片可反復使用多次，從而使其成本降低。GeneLogic正在開發(fā)139特點GeneLogic正在開發(fā)http://www.g3.靶基因樣品的制備靶基因的制備需要運用常規(guī)手段從細胞和組織中提取模板分子，進行模板的擴增和標記。靶基因樣品的制備方法將根據(jù)基因芯片的類型和所研究的對象（如mRNA、DNA等）而決定。1403.靶基因樣品的制備靶基因的制備需要運用常規(guī)手段從細胞和組織3.1靶基因的制備核酸樣品制備是基因芯片分析的必須步驟，傳統(tǒng)的化學提取法比較費時，不能滿足基因芯片對快速高效的要求。因而，人們發(fā)明了與芯片相結(jié)合的核酸提取方法。芯片微過濾法生物電子芯片法1413.1靶基因的制備核酸樣品制備是基因芯片分析的必須步驟，傳賓夕法尼亞大學的研究小組針對人白細胞的分離設(shè)計的一種核酸樣品制備方法。微過濾芯片是通過在硅片上刻出幾個微米大小的各種形狀的過濾微通道，再在硅芯片上加上一塊玻璃蓋片而成。發(fā)展經(jīng)歷了豎式Z型結(jié)構(gòu)、豎式條狀梳式結(jié)構(gòu)到最終的橫壩式結(jié)構(gòu)。芯片微過濾法142賓夕法尼亞大學的研究小組針對人白細胞的分離設(shè)計的一種核酸樣品為了把不同的癌細胞、細菌或病毒從血清、水樣或其他液體樣品中分離而設(shè)計的用作介電電泳的細胞分離方法。通過在硅芯片上制作一系列各種排列的金屬電極和在這些電極上施加高頻電場，使不同的細胞內(nèi)感應(yīng)出偶電極。偶電極的出現(xiàn)反過來使細胞承受正介電力或負介電力，從而使細胞從各種液體樣品中分離出來。生物電子芯片法PicturefromNanogenwebsite:143為了把不同的癌細胞、細菌或病毒從血清、水樣或其他液體樣品中分美國的Nanogen公司通過在微過濾芯片的電極上施加一系列高壓脈沖對電極上分離得到的大腸桿菌細胞進行進行電子胞解，獲得了大腸桿菌細胞內(nèi)的各種RNA和DNA。PicturefromNanogenwebsite:144美國的Nanogen公司通過在微過濾芯片的電極上施加一系列高3.2靶基因的擴增與標記主要采用熒光分子標記：常規(guī)標記——在擴增過程中加入含有熒光標記的dNTP（至少一種為熒光標記）。末端標記——直接在引物上標記熒光。1453.2靶基因的擴增與標記主要采用熒光分子標記：444.靶基因的雜交及其信號檢測熒光顯影法質(zhì)譜法化學發(fā)光法光導纖維法壓電石英諧振法……ScanningmRNALabelingHybridizationCellAVIfromNanogen:/1464.靶基因的雜交及其信號檢測熒光顯影法ScanningmRN4.1熒光顯影法用熒光素標記擴增后的待測核酸樣品，將熒光素標記的待測核酸樣品與芯片進行雜交，再洗去未雜交的標記樣品，然后用熒光顯微鏡或熒光掃描儀對芯片進行掃描以采集每點的熒光強度并用電腦進行分析比較。1474.1熒光顯影法用熒光素標記擴增后的待測核酸樣品，將熒光素激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)目前應(yīng)用最廣泛的熒光檢測系統(tǒng)。芯片倒扣在盛有待檢核酸的儲液器上，芯片的探針與液面相接觸并進行雜交反應(yīng)，能與靶核酸互補的探針對標記有熒光素的待檢核酸起捕獲作用。當激光從芯片的背面聚焦于芯片與靶DNA的接觸面時，與待檢核酸雜交了的位點就被激發(fā)熒光，熒光信號經(jīng)棱鏡后聚焦于空間共聚焦小孔，并通過小孔而被檢測器捕獲。148激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)目前應(yīng)用最廣泛的熒光檢測系統(tǒng)。芯片倒扣雖然激光同時也會激發(fā)儲液器里未與芯片雜交的標記靶核酸，但由于它們不在共聚焦小孔的焦平面，故這種熒光被小孔阻擋而不能到達檢測器。應(yīng)用激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)在數(shù)分鐘內(nèi)即可得到一個二維的雜交模式，通過改變溫度還可以得到雜交的熱動力學信息。149雖然激光同時也會激發(fā)儲液器里未與芯片雜交的標記靶核酸，但由于熱力學穩(wěn)定性完全正常的Watson-Crick配對雙鏈>錯配堿基的雙鏈熒光強度完全正常的Watson-Crick配對雙鏈>錯配堿基的雙鏈（5-35%）150熱力學穩(wěn)定性49熒光掃描儀簡介電荷偶合裝置CCD（charge-coupleddevices）光電倍增管PMT（photomultipliertube）151熒光掃描儀簡介電荷偶合裝置50圖片來自益來基因網(wǎng):/CCD成像技術(shù)：主要用于中、高密度基因芯片的檢測152圖片來自益來基因網(wǎng):http://www.el-gene.商業(yè)化掃描儀公司GenomicSolutions公司Packard公司GSI公司BeecherInstruments公司MolecularDynamicsGeneticMicrosystems公司AxonInstruments公司……153商業(yè)化掃描儀公司GenomicSolutions公司524.2化學發(fā)光法化學發(fā)光與熒光法的基本原理類似，但標記物不是熒光素而是魯米諾之類具有化學發(fā)光特性的物質(zhì)?；瘜W發(fā)光比熒光法的靈敏度更高。

1544.2化學發(fā)光法化學發(fā)光與熒光法的基本原理類似，但標記物不4.3光導纖維法將合成的氰脲酰氯活化的寡核苷酸探針固定在直徑200μm的光纖末端，然后固定有不同探針的光纖按特定位置組合成束，形成一個微陣列的傳感裝置即光纖DNA生物傳感器微陣列。其探針末端可以伸入樣品溶液中，雜交的熒光信號由光纖另一端偶聯(lián)的CCD相機接受。整個分析操作可在5分鐘內(nèi)完成。

1554.3光導纖維法將合成的氰脲酰氯活化的寡核苷酸探針固定在直4.4光導纖維法光纖DNA生物傳感器微陣列的探針敏感膜可以再生使用，因而成本得以降低。這種將傳感器與微陣列結(jié)合起來的方法特別適用于操作雜交分析不方便的環(huán)境和不具備激光共聚焦顯微鏡這種昂貴設(shè)備的實驗室（如臨床檢測實驗室），對推廣基因芯片的應(yīng)用有重要意義。

1564.4光導纖維法光纖DNA生物傳感器微陣列的探針敏感膜可以4.5壓電石英諧振法傳感裝置采用壓電石英諧振晶體目前正在開發(fā)之中1574.5壓電石英諧振法傳感裝置采用壓電石英諧振晶體564.6壓電石英諧振法石英諧振DNA生物傳感器微陣列比光纖DNA生物傳感器微陣列更具優(yōu)越性石英諧振傳感器具有微天平之稱，敏感性很高（理論上可達到fg級水平），有望省略雜交前的擴增步驟。石英諧振傳感器的響應(yīng)機制是“壓電效應(yīng)”，即對質(zhì)量敏感，所以無須對探針或靶核酸進行標記。

1584.6壓電石英諧振法石英諧振DNA生物傳感器微陣列比光纖D四.基因芯片的臨床應(yīng)用1998年底美國科學促進會將基因芯片列為1998年度自然科學領(lǐng)域十大進展之一

159四.基因芯片的臨床應(yīng)用1998年底美國科學促進會將基因芯片列1.核酸序列分析雜交測序技術(shù)（SBH）鄰堆雜交技術(shù)（CSH）毛細管電泳芯片測序技術(shù)1601.核酸序列分析雜交測序技術(shù)（SBH）591.1雜交測序技術(shù)基因芯片發(fā)展和應(yīng)用的基礎(chǔ)。任何線性DNA或RNA單鏈均可分解為一系列堿基數(shù)固定、錯落重疊的寡核苷酸片段（ODT），或稱為亞序列（subsequence）CAGCTCCATAT①CAGCTCCA②AGCTCCAT③GCTCCATA④CTCCATAT1611.1雜交測序技術(shù)基因芯片發(fā)展和應(yīng)用的基礎(chǔ)。CAGCTCC將所有n體亞序列探針都固定在一個固相支持物上，n體亞序列探針的序列與其在固相支持物上的位點一一對應(yīng)形成探針陣列。被標記的靶序列與芯片進行雜交后，芯片上所有雜交信號的位點組成一個“雜交模式”，該“雜交模式”實際上反應(yīng)的是靶序列的所有n體亞序列信息，計算機通過對該“雜交模式”的分析就可以確定靶核酸的序列。

方法與步驟162將所有n體亞序列探針都固定在一個固相支持物上，n體亞序列探針采用SBH技術(shù)，用含65,536個8聚寡核苷酸的微陣列，可測定200bp長DNA序列，采用67,108,864個13聚寡核苷酸探針的微陣列，可對數(shù)千個堿基長的DNA測序。

163采用SBH技術(shù)，用含65,536個8聚寡核苷酸的微陣列，可測1.2鄰堆雜交技術(shù)SBH技術(shù)的效率隨著微陣列中寡核苷酸數(shù)量與長度的增加而提高，但微陣列中寡核苷酸數(shù)量與長度的增加則提高了微陣列的復雜性，降低了雜交準確性。

CSH技術(shù)彌補了SBH技術(shù)存在的弊端，CSH技術(shù)的應(yīng)用增加了微陣列中寡核苷酸的有效長度，加強了序列準確性，可進行較長的DNA測序。

1641.2鄰堆雜交技術(shù)SBH技術(shù)的效率隨著微陣列中寡核苷酸數(shù)量CSH雜交測序原理示意圖（點擊此處觀看Flash動畫）165CSH雜交測序原理示意圖（點擊此處觀看Flash動畫）641.3毛細管電泳芯片測序技術(shù)Mathies等成功地應(yīng)用通過光刻加工出的毛細管長3.5厘米、橫切面50微米×8微米的毛細管電泳測序芯片在10分鐘內(nèi)完成了含433堿基對的DNA序列測定。美國的CuraGen公司和普林斯頓大學也正在從事這類芯片的研究開發(fā)工作。

1661.3毛細管電泳芯片測序技術(shù)Mathies等成功地應(yīng)用通過2.基因表達分析隨著人類基因組計劃的順利進行，基因組研究的重心轉(zhuǎn)了功能基因組學，研究基因的功能，特別是研究疾病相關(guān)基因已成了生物科技界的熱點?；虮磉_芯片為此提供了最好的技術(shù)平臺。1672.基因表達分析隨著人類基因組計劃的順利進行，基因組研究的對大多數(shù)基因而言，mRNA表達水平與其蛋白質(zhì)的水平相對應(yīng)。PicturefromIIR:http://www.inet.uni2.dk/~iirrh/IIRhome.htm168對大多數(shù)基因而言，mRNA表達水平與其蛋白質(zhì)的水平相對應(yīng)。P一般以O(shè)ligo-dT作引物進行RT-PCR制備靶基因，對細胞內(nèi)大量基因的mRNA表達差異進行檢測，從而了解細胞的性質(zhì)與狀態(tài)?；蛐酒夹g(shù)可清楚地直接快速地檢測出以1:300,000水平出現(xiàn)的mRNA，且易于同時監(jiān)測成千上萬的基因。169一般以O(shè)ligo-dT作引物進行RT-PCR制備靶基因，對細RRRRGG:

A>B:

A=B:

A<BSample

ASample

Bpreparation

of

mRNAlabeled

cDNAmixinghybridizationpreparation

of

mRNAlabeled

cDNA基因表達分析示意圖170RRRRGG:A>B:A=B:A<BSampleAS由于生物芯片技術(shù)可直接測到mRNA的種類及豐度，所以它是研究基因表達的有力工具?；蛐酒N包含了幾萬種人工合成的寡核苷酸探針或cDNA，可檢測轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物從幾個數(shù)量級到每個細胞的幾個拷貝，均能被定量研究，被檢測目的基因可多達10,000個。171由于生物芯片技術(shù)可直接測到mRNA的種類及豐度，所以它是研究系統(tǒng)微型化，樣品需量極小同時研究上萬個基因的表達變化，研究效率明顯提高能更多地揭示基因之間表達變化的相互關(guān)系，從而研究基因與基因之間內(nèi)在的作用關(guān)系檢測基因表達變化的靈敏度高，可檢測豐度相差幾個數(shù)量級的表達情況節(jié)約費用和時間表達譜基因芯片研究基因表達與傳統(tǒng)的NorthernBlot相比有許多重要的優(yōu)點172系統(tǒng)微型化，樣品需量極小表達譜基因芯片研究基因表達與傳統(tǒng)的3.尋找新基因定量檢測大量基因表達水平在闡述基因功能、探索疾病原因及機理、發(fā)現(xiàn)可能的診斷及治療等方面是很有價值的?；蛐酒夹g(shù)在發(fā)現(xiàn)新基因及分析各個基因在不同時空表達方面時一項十分有用的技術(shù)，它具有樣品用量極少，自動化程度高等優(yōu)點，便于大量篩選新基因。1733.尋找新基因定量檢測大量基因表達水平在闡述基因功能、探索疾目前，大量人類ESTs給cDNA微陣列提供了豐富的資源，數(shù)據(jù)庫中400,000個ESTs代表了所有人類基因，成千上萬的ESTs微陣列將為人類基因表達研究提供強有力的分析工具。這將大大地加速人類基因組的功能分析。174目前，大量人類ESTs給cDNA微陣列提供了豐富的資源，數(shù)據(jù)4.突變體和多態(tài)性檢測腫瘤和遺傳性疾病發(fā)生的根本原因是由于遺傳物質(zhì)發(fā)生了改變。檢測基因突變對于闡明腫瘤與遺傳病的分子機制、疾病的早期診斷具有重要意義。1754.突變體和多態(tài)性檢測腫瘤和遺傳性疾病發(fā)生的根本原因是由于遺以往研究突變和多態(tài)時多采用PCR-SS-CP、手工或自動測序、異源雙鏈分析、蛋白截短檢測等方法，所有這些都需經(jīng)過電泳環(huán)節(jié)，不能滿足大規(guī)模、低消耗和自動化的要求。應(yīng)用基因芯片方法檢測時可克服上述不足，且與DNA聚合酶或連接酶結(jié)合檢測時可獲得更高的分辨率176以往研究突變和多態(tài)時多采用PCR-SS-CP、手工或自動測序Hacia等用含有96,000個寡核苷酸探針的基因芯片來檢測遺傳性乳腺癌基因BRCA1第11外顯子3.45kb長度內(nèi)的所有可能的雜合性突變，包括堿基替換及小的插入、缺失等，并借此確定發(fā)病風險。基因芯片也可用于肺癌、卵巢癌、前列腺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤的研究中，為腫瘤基因組解剖計劃（CGAP）的完成提供重要的技術(shù)支持。177Hacia等用含有96,000個寡核苷酸探針的基因芯片來檢測Lipshutz等證明基因芯片可用來篩查HIV病毒的蛋白酶基因和反轉(zhuǎn)錄酶基因的突變。這些突變能引起對抗生素，如AZT等的抗性。Affymetrix公司已制造出商用HIV芯片，包括1,040個蛋白酶和反轉(zhuǎn)錄酶基因，用來研究病毒抗性發(fā)展過程中的堿基突變。178Lipshutz等證明基因芯片可用來篩查HIV病毒的蛋白酶基Chee等制造了含有135,000個25-mer探針的基因芯片來探測16.6kb的人線粒體基因組。共分析了10個樣本，檢出505個多態(tài)。每個樣本可在12min內(nèi)閱讀完畢，正確率達99%。據(jù)估測，每一工作日可閱讀40個線粒體基因組，大大高于現(xiàn)在凝膠測序儀可達到的每日2個基因組水平?；蛐酒捎糜谘芯縨tDNA基因突變以及民族內(nèi)和民族間mtDNA的多態(tài)性外，還可用來揭示mtDNA基因的表達與神經(jīng)性疾病和長壽等關(guān)系。179Chee等制造了含有135,000個25-mer探針的基因芯SBH技術(shù)可大規(guī)模地檢測和分析DNA的變異及多態(tài)性。PicturefromNCBIwebsite.突變180SBH技術(shù)可大規(guī)模地檢測和分析DNA的變異及多態(tài)性。Pict基因芯片技術(shù)是一項