按學號入座123456789101112131415161718192021222324252627282930細胞工程實驗齊鳳慧E-mail：

qifenghui2001@辦公室：生命科學院231電話介博士，副教授，細胞與分子生物學實驗室主任。主要從事細胞工程、基因工程及分子生物學實習的教學與相關的研究工作。學科：森林生物工程科研：茶條槭細胞次生代謝的研究。（1）內生真菌分離及沒食子酸含量檢測（2）茶條槭細胞次生代謝機理的研究（3）茶條槭細胞凋亡的研究（4）茶條槭細胞轉錄組分析及關鍵酶基因表達時序圖譜構建水曲柳生殖生物學研究（100多萬）。（1）探討植物生殖系統(tǒng)中結構與功能的關系（2）研究植物生殖發(fā)育過程中的基因表達（指標2-3篇SCI）（3）進行植物性細胞的操作模塊序號實驗項目學時實驗具體要求與目標模塊一、細胞工程的基礎技術1細胞培養(yǎng)用品的清洗、消毒與滅菌課外掌握細胞培養(yǎng)中所使用器械的清洗與消毒的方法。2細胞無菌操作技術課外掌握無菌操作的技術。模塊二、植物組織培養(yǎng)及快速繁殖技術3植物培養(yǎng)基母液的配制與保存課外學習和掌握培養(yǎng)基母液的配置方法。使學生了解培養(yǎng)基母液的配制的注意事項。4培養(yǎng)基的配制與滅菌2通過對基礎培養(yǎng)基的配制，掌握配制培養(yǎng)基的原理、步驟及設計方法和注意事項。5植物外植體消毒、接種及愈傷組織誘導2通過親自操作掌握外植體接種的無菌操作技術。領會無菌培養(yǎng)對實驗材料消毒、接種的要求，學習觀察記載的方法。6植物器官分化與植株再生課外了解器官分化和植株再生的過程，掌握器官培養(yǎng)、分化的原理與技術以及離體培養(yǎng)中的轉接技術。7植物無菌苗的生根培養(yǎng)課外熟練掌握繼代無菌苗生根培養(yǎng)技術。8植物組培苗的移栽與馴化課外熟練掌握組培苗移栽馴化技術。模塊三、植物細胞懸浮培養(yǎng)技術9植物細胞懸浮培養(yǎng)與生長量的測定2了解細胞懸浮系建立的全過程，掌握細胞懸浮培養(yǎng)技術及生長量的測定方法。10植物單細胞的分離與培養(yǎng)課外掌握單細胞分離的原理與方法。11植物單細胞的培養(yǎng)課外掌握單細胞培養(yǎng)方法及原理。12植物懸浮培養(yǎng)細胞計數(shù)和的活力測定課外掌握細胞數(shù)量統(tǒng)計方法及細胞活力的檢測方法。13植物細胞的超低溫保存課外掌握超低溫保存的原理與技術，掌握離體細胞的保存優(yōu)點和方法。模塊四、植物體細胞胚胎發(fā)生14植物的體細胞胚發(fā)生2掌握植物體胚發(fā)生的原理與方法。15植物體細胞胚植株再生1掌握體細胞胚植株再生的原理與方法。模塊五、植物原生質體的分離與融合16植物原生質體分離與純化2學習植物原生質體的分離和純化技術；掌握植物細胞酶解去壁方法及原生質體活力鑒定的方法；觀察原生質體的形態(tài)；了解原生質體在細胞工程中的應用。17植物原生質體培養(yǎng)課外學習植物原生質體的分離和純化技術；掌握植物細胞酶解去壁方法及原生質體活力鑒定的方法；觀察原生質體的形態(tài)；了解原生質體在細胞工程中的應用。18植物原生質體融合2學習細胞融合技術，了解聚乙二醇（PEG）誘導體外細胞融合的基本原理，逐步掌握細胞融合的基本方法，并觀察融合細胞現(xiàn)象。模塊六、植物細胞生物反應器與細胞次生代謝19植物體細胞胚生物反應器大規(guī)模培養(yǎng)2學習和掌握利用生物反應器進行細胞擴大繁育的方法20HPLC法檢測植物細胞次生代謝產(chǎn)物含量2了解次生代謝產(chǎn)物分析方法，掌握高效液相色譜的使用原理與技術。要求：每人要有一本指導書：《細胞工程模塊實驗教程》，科學出版社課前預習5個人一組，選出一人做組長每個組要對自己組的實驗用品提前準備對自己組的實驗內容進行設計實驗結束要將自己組的物品清理干凈，放好，下次再用。每個組對自己組的實驗結果要認真統(tǒng)計分析，除了每個人交的實驗報告外，要共同撰寫一份研究報告，制作一份幻燈片并匯報。（研究報告打印一份上交，幻燈片交一份電子版）。找錯誤：是書必有錯，在指導書中找到一處錯誤加0.1分。實驗一培養(yǎng)基的配制與滅菌實驗目的：（1）通過對基礎培養(yǎng)基的配制，掌握配制培養(yǎng)基的原理、步驟及設計方法和注意事項。（2）學習高壓蒸汽滅菌的操作方法；掌握滅菌的注意事項。培養(yǎng)基組成和作用：培養(yǎng)基（medium）是植物組織培養(yǎng)的重要材料，是外植體生長的營養(yǎng)物質，只有配制出適宜的培養(yǎng)基，才能使組織培養(yǎng)獲得成功。通常植物組織培養(yǎng)所用培養(yǎng)基包括以下六大類成分，即礦質營養(yǎng)、有機成分、植物生長調節(jié)劑、碳源、瓊脂以及其他附加物等。培養(yǎng)基的主要指標是營養(yǎng)成分及植物生長調節(jié)物質的濃度。根據(jù)植物對元素的吸收量，可以把植物必需元素分為大量元素和微量元素。國際植物生理學會建議將植物所需濃度大于0.5mmol/l的的元素稱為大量元素。低于0.5mmol/l的元素稱為微量元素。根據(jù)此規(guī)則大量元素種類包括C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S。其中C、H、O為氣體元素，其余六種為礦質元素，分別占植物干重的百分數(shù)為18％、10％、70％、0.3%、0.07％、0.3%、0.3％、0.07%、0.05％。微量元素包括Fe、B、Mn、Zn、Mo、Cu、Co、Cl等。2、微量元素：植物組織的對其需要量極少，過多會產(chǎn)生毒害，如造成蛋白質變性、酶系失活。代謝障礙等。各種微量元素均具有特定的生理功能，如硼與蛋白質的合成及糖類的運輸有關；銅能促進離體根的形成；錳參與植物的光合作用和呼吸作用；鉬為氮素代謝的重要元素。微量元素硫酸鋅（ZnSO4.7H2O）287.548.6鉬酸鈉（Na2MoO4.2H2O）241.950.25硫酸銅（CuSO4.5H2O）249.680.025氯化鈷（CoCl2.6H2O）237.930.025碘化鉀（KI）166.010.83硼酸（H3BO3

）61.836.2硫酸錳（MnSO4.4H2O）223.0122.3（二）有機成分：主要包括各種維生素和氨基酸，如硫胺素（VB1）、煙酸（VB3）、吡哆醇（VB6）、泛酸鈣（VB5）、生物素、鈷胺素（VB12）、葉酸等以及甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰氨、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰氨、丙氨酸等。有時添加水解乳蛋白或水解酪蛋白，為牛乳經(jīng)酶法加工的水解產(chǎn)物，含有20種氨基酸的混合物，用量10－1000mg/L,通常用于原生質體等培養(yǎng)。此外肌醇是另外一種重要的有機成分，又叫環(huán)己六醇，在糖類的轉化中起重要作用，此外還參與磷脂代謝及維持離子平衡等生理作用。肌醇肌醇100甘氨酸甘氨酸2有機成分鹽酸硫胺素（VB1）0.1鹽酸吡哆醇（VB6）0.5煙酸（VB5或VPP）0.5（三）植物生長調節(jié)物質：植物激素是植物新稱代謝中產(chǎn)生的天然化合物，它能以極微小的用量直接影響植物細胞的分化、分裂以及發(fā)育，影響植物的形態(tài)建成、開花、結實、成熟、衰老脫落、休眠、萌發(fā)等生理活動。

在植物組織培養(yǎng)中，主要通過植物激素對離體的組織、器官的形態(tài)發(fā)生進行調控。包括誘導細胞分裂、愈傷組織的生長、根芽的分化以及體細胞胚胎發(fā)生等。

常用的植物激素及生長調節(jié)物涉及五大類植物激素：1、生長素類：IAA、IBA、NAA、2，4-D2、細胞分裂類：6-BA、KT（Kin）、ZT、2ip3、赤霉素類：GA3、GA4、GA74、脫落酸：ABA5、乙烯：ETH（四）碳源：碳源主要為細胞提供合成新化合物的骨架，為細胞的呼吸代謝提供底物與能源，此外還能維持一定的滲透壓。

常用的碳源主要是蔗糖，使用濃度在2－5％，此外果糖、葡萄糖、麥芽糖、山梨糖、甘露糖及可溶性淀粉等也常用于植物組織培養(yǎng)。糖濃度高低直接影響形態(tài)建成。培養(yǎng)基的配制1、母液的配制培養(yǎng)基母液根據(jù)試劑特性通常配成以下幾種母液，即大量元素母液（10或20倍）、微量元素母液（100或1000倍）、Fe鹽（100倍）、鈣鹽、維生素、肌醇。配置前先進行根據(jù)培養(yǎng)基組成和配制體積計算母液試劑用量，然后稱取藥品，大量元素可以用百分之一或千分之一天平，微量元素，鐵鹽和有機物用萬分之一天平稱量。激素母液的配制：根據(jù)各種激素的使用濃度配制適宜的母液，用萬分之一天平稱取激素，溶劑溶解后加水定容。生長素類、赤霉素類及脫落酸等用95％乙醇溶解；細胞分裂素類用1NHCl或1NNaOH溶解。通常激素母液濃度生長素類為0.1~0.5mg/ml,細胞分裂素母液濃度為0.2~1.0mg/ml.五、培養(yǎng)基的