蛋白重組技術(shù)在制備視黃醇結(jié)合蛋白質(zhì)控品和候選參考物質(zhì)中的方法研究視黃醇結(jié)合蛋白（retinol-bindingprotein，RPB）屬于脂質(zhì)運載蛋白家族，由肝臟合成，廣泛分布于血液、腦脊液、尿液和其他體液中［1］。絕大多數(shù)血清中的RBP4以與甲狀腺運載蛋白結(jié)合的形式存在，僅10%RBP4以游離形式存在，游離的RBP4能經(jīng)腎小球完全濾過并能被腎小管重吸收［2］。測定視黃醇結(jié)合蛋白能早期發(fā)現(xiàn)腎小管的功能損害，并能靈敏反映腎近曲小管的損害程度，還可以作為肝功能早期損害和監(jiān)護治療的指標［3,

4,

5］。RBP4還與許多疾病和代謝綜合征相關(guān)，包括2型糖尿病胰島素抵抗、心血管疾病、肥胖和黃斑變性等［6,

7,

8,

9］。由此可知準確測定RBP4具有重要的臨床意義。使用參考物質(zhì)（廣義上的參考物質(zhì)指經(jīng)過制備的物質(zhì)，包括質(zhì)控物、質(zhì)評物、校準物、有證標準物質(zhì)等）（ISO17511∶2020）是實現(xiàn)臨床檢測準確性和可比性的重要途徑，但高濃度RBP4參考物質(zhì)不易獲得，需要收集高濃度患者標本或者購買價格較高的RBP4純度物質(zhì)，給臨床RBP4質(zhì)量控制帶來了很大的困難。近年來基因工程蛋白重組技術(shù)迅猛發(fā)展，標簽融合被廣泛應用于純化目標蛋白，融合蛋白被標簽特異性的親和樹脂所捕獲，再從親和樹脂洗脫而達到分離純化目的［10,

11,

12,

13］。鑒于此，本研究嘗試研發(fā)基于基因工程蛋白重組技術(shù)，不受取材限制、可高濃度量產(chǎn)的標準物質(zhì)和質(zhì)控品研發(fā)技術(shù)，滿足日益增長的臨床檢驗實際需求。材料與方法一、材料1.材料來源：大腸埃希菌（E.coli）BL21表達感受肽和E.coli

DH5α克隆感受肽、DNALadder均購買自北京擎科生物科技有限公司；質(zhì)粒pET-28a（+）由清華大學結(jié)構(gòu)生物學高精尖創(chuàng)新中心惠贈。限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ、NheⅠ、MluⅠ、HindⅢ以及T4DNA連接酶購自美國NEB公司。質(zhì)粒提取試劑盒及DNA凝膠回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基、卡那霉素、異丙基硫代半乳糖苷（isopropylβ-d-thiogalactoside，IPTG）、咪唑等均購自美國Sigma公司。RBP4檢測試劑盒購自柏榮診斷（上海）有限公司。蛋白標準帶購自美國Thermo公司（貨號26616）。2.儀器設(shè)備：37℃全溫振蕩器購自金壇成輝儀器廠；DNA電泳儀購自北京市六一儀器廠；蛋白電泳儀購自美國伯樂公司；PCR儀購自美國ABI公司；Ni-NTA鎳離子親和樹脂購自美國Qiagen；鎳離子親和層析柱購自上海生工生物工程股份有限公司；超聲細胞破碎儀購自上海力辰邦西儀器科技有限公司，日立7180檢測儀購自日本日立公司。二、方法1.hRBP4基因合成：從美國國立生物技術(shù)信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformation，NCBI）數(shù)據(jù)庫檢索獲得人RBP4編碼序列，依據(jù)大腸埃希菌密碼子偏好進行優(yōu)化，優(yōu)化后序列委托擎科公司基因合成。2.原核表達載體構(gòu)建：基因合成時于N端增加NheI酶切位點，C端增加EcoRI酶切位點。將雙酶切片段插入pET-28a（+）載體，T4DNA連接酶連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli

DH5α感受肽，利用卡那霉素抗性篩選，通過菌落聚合酶鏈反應（polymerasechainreaction，PCR）及酶切對陽性克隆進行鑒定，初步鑒定成功的菌液提取得到6×His-RBP4-pET質(zhì)粒，進一步測序鑒定。3.重組hRBP4表達：將構(gòu)建好的6×His-RBP4-pET轉(zhuǎn)化E.coli

BL21感受肽，挑取單菌落接種至5mlLB培養(yǎng)基37℃搖床培養(yǎng)過夜。以1：500體積比將菌液接種至250mlLB培養(yǎng)基，在37℃，200rpm培養(yǎng)至OD600為0.3~0.5，向培養(yǎng)基中加入終濃度為0.2mmol/L的IPTG，37℃，160rpm誘導6h。所有誘導后的菌液5500×g離心5min收集菌體，菌體重懸于20ml蛋白裂解液（50mmol/LNa3PO4，pH8.0，150mmol/LNaCl）中，冰浴條件下使用超聲細胞破碎儀超聲15min（超聲2s，間隔3s）破碎裂解菌體，裂解產(chǎn)物5500×g，4℃離心15min，分離上清液與沉淀。4.重組hRBP4表達條件優(yōu)化：經(jīng)LB培養(yǎng)基培養(yǎng)及IPTG誘導表達后（先選取了常用溫度16℃，37℃和常用IPTG濃度0.5mmol/L，將菌體超聲破碎后離心取上清，再將沉淀溶于高鹽裂解液離心后取上清。上清及沉淀與鎳柱Ni-NTA親和層析，20mmol/L咪唑清洗非特異性結(jié)合，250mmol/L咪唑洗脫的蛋白液經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳。在0.5mmol/LIPTG，180rpm前提下，16、20、30、37℃條件下誘導6h；確定最佳誘導溫度后，在0.1、0.2、0.4和0.5mmol/L的IPTG，37℃，160rpm的條件下誘導6h，以獲得重組hRBP4誘導表達最優(yōu)的溫度（16℃）與IPTG濃度（0.2mmol/L）。5.重組hRBP4純化：考慮對蛋白影響最小，本研究使用His標簽親和純化，將裂解上清與2mlNi-NTA親和樹脂在4℃充分混勻2h，使連接有His標簽的重組蛋白結(jié)合于Ni離子螯合的樹脂，用20mmol/L5倍于凝膠體積的咪唑溶液清洗非特異性結(jié)合，最后用4ml250mmol/L咪唑溶液洗脫重組人6×His-RBP4蛋白。6.重組hRBP4檢測：將從250ml菌液中純化的4mlhRBP4蛋白樣品原液，使用ddH2O稀釋不同濃度，使用常規(guī)免疫比濁法在日立7180全自動生化分析儀上搭配柏榮診斷（上海）有限公司的RBP4檢測試劑盒測，分別測定不同稀釋濃度下的數(shù)值。以稀釋倍數(shù)為橫坐標，測定濃度值為縱坐標繪制標準曲線，并添加回歸方程計算R2值。7.統(tǒng)計學分析：利用線性回歸分析，確定變量稀釋倍數(shù)與檢測值之間相互依賴的定量關(guān)系，使用最小二乘法擬合趨勢線，得到線性回歸方程及回歸系數(shù)R。結(jié)果一、構(gòu)建hRBP4原核表達載體hRBP4基因插入NheⅠ和EcoRⅠ兩酶切位點之間，并在N端融合了6×His標簽用于hRBP4蛋白的親和純化。經(jīng)硫酸卡那霉素篩選的單克隆菌落，經(jīng)搖菌后提純質(zhì)粒使用EcoRⅠ和MluⅠ酶切后得到1300bp左右的片段（圖1），證實插入成功。將質(zhì)粒送測序鑒定以證實基因序列是否正確，經(jīng)DNAMAN軟件對比編碼hRBP4蛋白的堿基序列完全正確，表明6×His-RBP4-pET原核表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。圖1

構(gòu)建和驗證視黃醇結(jié)合蛋白的原核表達質(zhì)粒二、6×His-RBP4-pET28a（+）表達親和純化產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，結(jié)果中清晰可見相對分子質(zhì)量26000電泳條帶（圖2），大小與預期的6×His-RBP4-pET相符，但蛋白表達主要為不溶蛋白，大部分存在于沉淀中，表明重組hRBP4蛋白誘導表達主要以包涵體的形式存在。比較16℃和37℃時hRBP4的表達情況可知，16℃時表達量更大，可見降低溫度并沒有減少包涵體的形成，同時可以看到不論上清還是沉淀中蛋白純度很高。通過變性純化得到hRBP4蛋白純品后進行檢測，不論血清hRBP4還是尿液hRBP4檢測試劑盒均能夠正常檢出。圖2

不同條件下上清和沉淀中人視黃醇結(jié)合蛋白4的純化產(chǎn)物三、重組hRBP4誘導表達條件優(yōu)化為提高表達效率、增加產(chǎn)量、提高蛋白純度，本研究成功誘導hRBP4表達后又對其誘導表達條件進一步優(yōu)化。最佳誘導溫度和IPTG濃度結(jié)果見圖3。如圖3A所示，在16、20、30和37℃條件下180rpm誘導6h，RBP4濃度在到16℃時到達最高，故最佳誘導溫度取16℃。圖3B所示，在0.1、0.2、0.4和0.5mmol/L的IPTG，37℃160rpm的條件下誘導6h，IPTG濃度為0.1mmol/L時，RBP4表達量較多，在0.2mmol/L達到最高，而在0.2~0.5mmol/LIPTG誘導時hRBP4的濃度隨著IPTG濃度的升高而降低，故而選取0.2mmol/L為IPTG誘導的最優(yōu)濃度。圖3

不同誘導條件下裂解產(chǎn)物上清純化后聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果四、重組hRBP4稀釋后呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系將hRBP4重組蛋白分別稀釋40、80、120、160、200倍，測得濃度分別為106.11、48.76、32.52、22.60、17.19mg/L。經(jīng)回歸分析可知hRBP4純品蛋白稀釋倍數(shù)與測點值之間線性關(guān)系良好。這提示純化蛋白不僅能夠被臨床檢測，且符合線性關(guān)系（圖4）。圖4

視黃醇結(jié)合蛋白稀釋倍數(shù)與測定值之間線性關(guān)系圖討論研究發(fā)現(xiàn)血清或尿液RBP4水平與人體腎功能、肝功能、臨床營養(yǎng)狀況、流行性出血熱、腫瘤診斷等方面均密切相關(guān)。RBP4作為一項靈敏的檢測指標不僅應用于腎臟相關(guān)疾病的早期診斷，還在肝臟疾病、肥胖、冠心病、糖尿病、腫瘤等疾病診斷和預后中具有較高的臨床應用價值［6,

7，14］，臨床實驗室需提供準確可靠的檢測結(jié)果，因此研發(fā)和制備用于RBP4實驗室質(zhì)量控制的參考物質(zhì)（包括有證標準物質(zhì)和質(zhì)控品）具有重要意義。結(jié)合當前實驗結(jié)果分析可知，本研究體外純化的hRBP4蛋白，即便在稀釋200倍時濃度依舊高達17.19mg/L（圖4），結(jié)合臨床診斷標準可知，稀釋后的hRBP4依舊屬于臨床高濃度。從1L培養(yǎng)基中通?？傻玫?6ml高濃度純品hRBP4，以制備質(zhì)控品為例，16ml稀釋50~200倍后，以1ml為單位進行分裝，則可制作800~3200支濃度水平在20~100mg/L間的室間質(zhì)量評價質(zhì)控品（血清RBP4的正常濃度范圍在25~70mg/L，臨床常見檢測試劑盒線性范圍一般為10~100mg/L）。由此可見，借助基因工程技術(shù)確實可快速、高效、高濃度生產(chǎn)純品物質(zhì)，而這種高濃度、高純度的純品可為研制有證標準物質(zhì)和質(zhì)控品奠定基礎(chǔ)。臨床實驗室檢驗結(jié)果準確與否決定了疾病診療的可靠性和效率，而標準物質(zhì)和質(zhì)控品的規(guī)范化管理可提高臨床檢驗結(jié)果的準確性和實驗室間不同方法結(jié)果的可比性。近年來我國體外診斷試劑發(fā)展很快，但大多數(shù)項目缺乏標準化，表現(xiàn)在生產(chǎn)試劑、儀器的廠商較多，在我國國家藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站注冊的血清RBP4和尿液RBP4檢測試劑盒生產(chǎn)廠家已有上百家，但各試劑質(zhì)量參差不齊，試劑特異性、靈敏度等存在較大的差異，各系統(tǒng)檢測結(jié)果之間可比性較差。2021年國家衛(wèi)生健康委臨檢中心的室間質(zhì)量評價數(shù)據(jù)顯示，全國參加血清視黃醇結(jié)合蛋白的705家實驗室檢測結(jié)果的變異系數(shù)為12.6%~19.9%，253家尿液視黃醇結(jié)合蛋白檢測結(jié)果的變異系數(shù)為54.03%~94.2%，不同系統(tǒng)之間缺乏準確性和一致性。研制和應用參考物質(zhì)（包括質(zhì)控品和有證參考物質(zhì)）是實現(xiàn)不同實驗室檢測結(jié)果一致化或標準化的重要途徑，尤其是具有互通性的參考物質(zhì)。本項研究旨在通過蛋白重組技術(shù)研制RBP4重組蛋白，并探索其用于質(zhì)控品和參考物質(zhì)的可能性。研究分為兩個階段，階段一為研制hRBP4重組蛋白，階段二為重組蛋白參考物質(zhì)特性研究及應用。本研究主要介紹階段一的成果，