引物設(shè)計(jì)部分使用說(shuō)明初學(xué)者超級(jí)推薦引物設(shè)計(jì)部分使用說(shuō)明初學(xué)者超級(jí)推薦1主要內(nèi)容背景PCR引物設(shè)計(jì)原則常用PCR引物設(shè)計(jì)軟件PrimerPremier5.0介紹Oligo6.22介紹在線Primer3介紹主要內(nèi)容背景PCR聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaction,PCR)是80年代中期發(fā)展起來(lái)的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)；能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬(wàn)乃至百萬(wàn)倍,使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA供分析研究和檢測(cè)鑒定。PCR聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaPCR引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)是PCR技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán)。使用不合適的PCR引物容易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗：表現(xiàn)為擴(kuò)增出目的帶之外的多條帶（如形成引物二聚體帶），不出帶或出帶很弱，等等?，F(xiàn)在PCR引物設(shè)計(jì)大都通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行?？梢灾苯犹峤荒０逍蛄械教囟ňW(wǎng)頁(yè)，得到設(shè)計(jì)好的引物，也可以在本地計(jì)算機(jī)上運(yùn)行引物設(shè)計(jì)專業(yè)軟件。PCR引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)是PCR技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán)。使用不引物設(shè)計(jì)的原則引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA聚合反應(yīng)(即錯(cuò)配)。引物設(shè)計(jì)的原則引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)如引物長(zhǎng)度（primerlength），產(chǎn)物長(zhǎng)度（productlength），序列Tm值(meltingtemperature)，引物與模板形成雙鏈的內(nèi)部穩(wěn)定性(internalstability,用?G值反映)，形成引物二聚體(primerdimer)及發(fā)夾結(jié)構(gòu)（duplexformationandhairpin）的能值，在錯(cuò)配位點(diǎn)（falseprimingsite）的引發(fā)效率，引物及產(chǎn)物的GC含量（composition），等等。必要時(shí)還需對(duì)引物進(jìn)行修飾，如增加限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，引進(jìn)突變等。具體因素如引物長(zhǎng)度（primerlength），產(chǎn)物長(zhǎng)度（prod一般原則引物的長(zhǎng)度一般為15-30bp，常用的是18-24bp，但不應(yīng)大于38。引物過(guò)短又同時(shí)會(huì)引起錯(cuò)配現(xiàn)象，一般來(lái)說(shuō)引物長(zhǎng)度大于16bp是必要的（不容易引起錯(cuò)配）。例如：一個(gè)長(zhǎng)度為12bp的引物在人類基因組上存在200個(gè)潛在的退火位點(diǎn)(3x109/412=200).而一個(gè)長(zhǎng)度為20bp的引物在人基因組上存在的退火位點(diǎn)只有1/400個(gè).較長(zhǎng)的引物（28-35bp)一般是用來(lái)區(qū)分同源性較高的模板序列或者使用于產(chǎn)生一些突變位點(diǎn)一般原則引物的長(zhǎng)度一般為15-30bp，常用的是18-24Tm值的計(jì)算一般的公式Tm=4(G+C)+2(A+T)

對(duì)于長(zhǎng)一些的引物可用更為準(zhǔn)確的nearest-neighbor（Frieretal.(1986)）Tm值的計(jì)算一般原則2.引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)配。引物3’端出現(xiàn)3個(gè)以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC，也會(huì)使錯(cuò)誤引發(fā)機(jī)率增加。

一般原則2.引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3’一般原則3，引物3’端的末位堿基對(duì)Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯(cuò)配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率，末位堿基為A的錯(cuò)配效率明顯高于其他3個(gè)堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3’端使用堿基A。另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。5’端序列對(duì)PCR影響不太大，因此常用來(lái)引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物。一般原則3，引物3’端的末位堿基對(duì)Taq酶的DNA合成效一般原則4.引物序列的GC含量一般為40-60%，過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。不同的算法推薦45-55%或50-60%一般原則4.引物序列的GC含量一般為40-60%，過(guò)高或一般原則5.?G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用3’端?G值較低（絕對(duì)值不超過(guò)9），而5’端和中間?G值相對(duì)較高的引物。引物的3’端的?G值過(guò)高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。（能值越高越容易結(jié)合）一般原則5.?G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值一般原則6.對(duì)引物的修飾一般是在5’端增加酶切位點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)下一步實(shí)驗(yàn)中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。

一般原則6.對(duì)引物的修飾一般是在5’端增加酶切位點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)一般原則7.引物二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)PCR反應(yīng)的影響。盡可能少的引物二聚體。

一般原則7.引物二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)PCR反應(yīng)的影響。常用的引物設(shè)計(jì)軟件Oligo6（引物評(píng)價(jià)）*PrimerPremier（自動(dòng)搜索）*VectorNTISuitDnasisOmigaDnastarPrimer3（在線服務(wù)）*常用的引物設(shè)計(jì)軟件Oligo6（引物評(píng)價(jià)）*PrimerPremier5.0的使用技巧簡(jiǎn)介主要功能:1、即引物設(shè)計(jì)2、限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)分析3、DNA基元(motif)查找4、同源性分析PrimerPremier5.0的使用技巧簡(jiǎn)介主要功能簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)根據(jù)氨基酸序列來(lái)設(shè)計(jì)引物DNA引物PremierPrimer5提供了8種生物遺傳密碼使用的偏好選擇1、纖毛蟲大核（CiliateMacronuclear）2、無(wú)脊椎動(dòng)物線粒體（InvertebrateMitochondrion）3、支原體（Mycoplasma）4、植物線粒體（PlantMitochondrion）5、原生動(dòng)物線粒體（ProtozoanMitochondrion）6、一般標(biāo)準(zhǔn)（Standard）7、脊椎動(dòng)物線粒體（VertebrateMitochondrion）8、酵母線粒體（YeastMitochondrion）簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)根據(jù)氨基酸序列來(lái)設(shè)計(jì)引物DNA引物使用介紹(1)PreimerPremier啟動(dòng)界面Loadsequence使用介紹(1)PreimerPremier啟動(dòng)界面Loa基本信息SequencenameOriginalsequenceUsethesetwobuttontotranslatetheDNAseqtoaproteinseqoraproteinseqtoaDANseq8種密碼子偏好Chooseafunction基本信息SequencenameOriginalsequ引物設(shè)計(jì)界面FirstyoucandesigntheprimermanuallySensestrandoranti-sensestrandUsefulinformationoftheprimer引物設(shè)計(jì)界面Firstyoucandesignthe引物搜索選項(xiàng)設(shè)定引物類型搜索模式5’引物位置范圍3’引物位置范圍產(chǎn)物大小范圍引物長(zhǎng)度引物搜索選項(xiàng)設(shè)定引物類型搜索模式5’引物位置范圍3’引物位置搜索結(jié)果28對(duì)引物引物分值100分為滿分每對(duì)引物的信息雙擊選中一對(duì)引物搜索結(jié)果28對(duì)引物引物分值每對(duì)引物的信息雙擊選中一對(duì)引物引物信息回到主窗口引物及產(chǎn)物信息是否出現(xiàn)hairpin,dimer,falseprimingandcrossdimer引物信息回到主窗口引物及產(chǎn)物信息是否出現(xiàn)hairpin,di一對(duì)理想的引物應(yīng)當(dāng)不存在任何一種上述結(jié)構(gòu)，因此最好的情況是最下面的分析欄沒有But…一對(duì)理想的引物應(yīng)當(dāng)不存在任何一種上述結(jié)構(gòu)，因此最好的情況是最引物編輯引物編輯引物編輯EditprimerhereAnalysistheeditresultAccepttheeditresultReturntothemainwindow引物編輯EditprimerhereAnalysistSomeotherusefulfunctionofPP5SomeotherusefulfunctionofEnzymeEnzymeMeltingtemperaturegraphPer25-merMeltingtemperaturegraphPer2GC%graphPer25-merGC%graphPer25-merStabilityPer5-merStabilityPer5-merOligo6.44使用說(shuō)明主要功能：專門的引物設(shè)計(jì)軟件Oligo6.44使用說(shuō)明主要功能：專門的引物設(shè)計(jì)軟件Oligo6.44啟動(dòng)界面OpensequencefileOligo6.44啟動(dòng)界面Opensequencef3個(gè)彈出窗口Meltingtemperature3個(gè)彈出窗口Meltingtemperature?GInternalStability?GInternalStabilityFrq為鄰近6至7個(gè)堿基組成的亞單位在一個(gè)指定數(shù)據(jù)庫(kù)文件中的出現(xiàn)頻率。該頻率高則可增加錯(cuò)誤引發(fā)的可能性。Frq為鄰近6至7個(gè)堿基組成的亞單位在一個(gè)指定數(shù)據(jù)庫(kù)文件中用Oligo設(shè)計(jì)引物時(shí)的3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)Tm值曲線以選取5’到3’的下降形狀有利于引物引發(fā)聚合反應(yīng)。Frq曲線宜選用3’端Frq值相對(duì)較低的片段。ΔG值在5’端和中間值比較高，而在3’端相對(duì)低用Oligo設(shè)計(jì)引物時(shí)的3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)Tm值曲線以選取5’到3引物設(shè)計(jì)部分使用說(shuō)明初學(xué)者超級(jí)推薦課件選中引物上游引物下游引物只是示意圖選中引物上游引物下游引物只是示意圖引物分析首先檢查引物二聚體尤其是3’端二聚體形成的可能性。引物分析首先檢查引物二聚體尤其是3’端二聚體形成的可能性。引物分析二項(xiàng)檢查是發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hairpin）；與二聚體相同，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值越低越好。引物分析二項(xiàng)檢查是發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hairpin）；與二聚體相同，引物分析第三項(xiàng)檢查為GC含量，以45-55％為宜。第四Falsepriming檢查引物分析第三項(xiàng)檢查為GC含量，以45-55％為宜。引物分析KeyinformationofprimerHairpinDimerandcrossDimerGC%TotalPCRinformation引物分析KeyinformationofprimerHFinalPCRinformationFinalPCRinformationSearchprimerSearchprimerOnlineprimer3serviceOnlineprimer3service謝謝觀賞！2020/11/547謝謝觀賞！2020/11/547引物設(shè)計(jì)部分使用說(shuō)明初學(xué)者超級(jí)推薦引物設(shè)計(jì)部分使用說(shuō)明初學(xué)者超級(jí)推薦48主要內(nèi)容背景PCR引物設(shè)計(jì)原則常用PCR引物設(shè)計(jì)軟件PrimerPremier5.0介紹Oligo6.22介紹在線Primer3介紹主要內(nèi)容背景PCR聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaction,PCR)是80年代中期發(fā)展起來(lái)的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)；能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬(wàn)乃至百萬(wàn)倍,使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA供分析研究和檢測(cè)鑒定。PCR聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaPCR引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)是PCR技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán)。使用不合適的PCR引物容易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗：表現(xiàn)為擴(kuò)增出目的帶之外的多條帶（如形成引物二聚體帶），不出帶或出帶很弱，等等。現(xiàn)在PCR引物設(shè)計(jì)大都通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行。可以直接提交模板序列到特定網(wǎng)頁(yè)，得到設(shè)計(jì)好的引物，也可以在本地計(jì)算機(jī)上運(yùn)行引物設(shè)計(jì)專業(yè)軟件。PCR引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)是PCR技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán)。使用不引物設(shè)計(jì)的原則引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA聚合反應(yīng)(即錯(cuò)配)。引物設(shè)計(jì)的原則引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)如引物長(zhǎng)度（primerlength），產(chǎn)物長(zhǎng)度（productlength），序列Tm值(meltingtemperature)，引物與模板形成雙鏈的內(nèi)部穩(wěn)定性(internalstability,用?G值反映)，形成引物二聚體(primerdimer)及發(fā)夾結(jié)構(gòu)（duplexformationandhairpin）的能值，在錯(cuò)配位點(diǎn)（falseprimingsite）的引發(fā)效率，引物及產(chǎn)物的GC含量（composition），等等。必要時(shí)還需對(duì)引物進(jìn)行修飾，如增加限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，引進(jìn)突變等。具體因素如引物長(zhǎng)度（primerlength），產(chǎn)物長(zhǎng)度（prod一般原則引物的長(zhǎng)度一般為15-30bp，常用的是18-24bp，但不應(yīng)大于38。引物過(guò)短又同時(shí)會(huì)引起錯(cuò)配現(xiàn)象，一般來(lái)說(shuō)引物長(zhǎng)度大于16bp是必要的（不容易引起錯(cuò)配）。例如：一個(gè)長(zhǎng)度為12bp的引物在人類基因組上存在200個(gè)潛在的退火位點(diǎn)(3x109/412=200).而一個(gè)長(zhǎng)度為20bp的引物在人基因組上存在的退火位點(diǎn)只有1/400個(gè).較長(zhǎng)的引物（28-35bp)一般是用來(lái)區(qū)分同源性較高的模板序列或者使用于產(chǎn)生一些突變位點(diǎn)一般原則引物的長(zhǎng)度一般為15-30bp，常用的是18-24Tm值的計(jì)算一般的公式Tm=4(G+C)+2(A+T)

對(duì)于長(zhǎng)一些的引物可用更為準(zhǔn)確的nearest-neighbor（Frieretal.(1986)）Tm值的計(jì)算一般原則2.引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)配。引物3’端出現(xiàn)3個(gè)以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC，也會(huì)使錯(cuò)誤引發(fā)機(jī)率增加。

一般原則2.引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3’一般原則3，引物3’端的末位堿基對(duì)Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯(cuò)配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率，末位堿基為A的錯(cuò)配效率明顯高于其他3個(gè)堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3’端使用堿基A。另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。5’端序列對(duì)PCR影響不太大，因此常用來(lái)引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物。一般原則3，引物3’端的末位堿基對(duì)Taq酶的DNA合成效一般原則4.引物序列的GC含量一般為40-60%，過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。不同的算法推薦45-55%或50-60%一般原則4.引物序列的GC含量一般為40-60%，過(guò)高或一般原則5.?G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用3’端?G值較低（絕對(duì)值不超過(guò)9），而5’端和中間?G值相對(duì)較高的引物。引物的3’端的?G值過(guò)高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。（能值越高越容易結(jié)合）一般原則5.?G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值一般原則6.對(duì)引物的修飾一般是在5’端增加酶切位點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)下一步實(shí)驗(yàn)中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。

一般原則6.對(duì)引物的修飾一般是在5’端增加酶切位點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)一般原則7.引物二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)PCR反應(yīng)的影響。盡可能少的引物二聚體。

一般原則7.引物二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)PCR反應(yīng)的影響。常用的引物設(shè)計(jì)軟件Oligo6（引物評(píng)價(jià)）*PrimerPremier（自動(dòng)搜索）*VectorNTISuitDnasisOmigaDnastarPrimer3（在線服務(wù)）*常用的引物設(shè)計(jì)軟件Oligo6（引物評(píng)價(jià)）*PrimerPremier5.0的使用技巧簡(jiǎn)介主要功能:1、即引物設(shè)計(jì)2、限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)分析3、DNA基元(motif)查找4、同源性分析PrimerPremier5.0的使用技巧簡(jiǎn)介主要功能簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)根據(jù)氨基酸序列來(lái)設(shè)計(jì)引物DNA引物PremierPrimer5提供了8種生物遺傳密碼使用的偏好選擇1、纖毛蟲大核（CiliateMacronuclear）2、無(wú)脊椎動(dòng)物線粒體（InvertebrateMitochondrion）3、支原體（Mycoplasma）4、植物線粒體（PlantMitochondrion）5、原生動(dòng)物線粒體（ProtozoanMitochondrion）6、一般標(biāo)準(zhǔn)（Standard）7、脊椎動(dòng)物線粒體（VertebrateMitochondrion）8、酵母線粒體（YeastMitochondrion）簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)根據(jù)氨基酸序列來(lái)設(shè)計(jì)引物DNA引物使用介紹(1)PreimerPremier啟動(dòng)界面Loadsequence使用介紹(1)PreimerPremier啟動(dòng)界面Loa基本信息SequencenameOriginalsequenceUsethesetwobuttontotranslatetheDNAseqtoaproteinseqoraproteinseqtoaDANseq8種密碼子偏好Chooseafunction基本信息SequencenameOriginalsequ引物設(shè)計(jì)界面FirstyoucandesigntheprimermanuallySensestrandoranti-sensestrandUsefulinformationoftheprimer引物設(shè)計(jì)界面Firstyoucandesignthe引物搜索選項(xiàng)設(shè)定引物類型搜索模式5’引物位置范圍3’引物位置范圍產(chǎn)物大小范圍引物長(zhǎng)度引物搜索選項(xiàng)設(shè)定引物類型搜索模式5’引物位置范圍3’引物位置搜索結(jié)果28對(duì)引物引物分值100分為滿分每對(duì)引物的信息雙擊選中一對(duì)引物搜索結(jié)果28對(duì)引物引物分值每對(duì)引物的信息雙擊選中一對(duì)引物引物信息回到主窗口引物及產(chǎn)物信息是否出現(xiàn)hairpin,dimer,falseprimingandcrossdimer引物信息回到主窗口引物及產(chǎn)物信息是否出現(xiàn)hairpin,di一對(duì)理想的引物應(yīng)當(dāng)不存在任何一種上述結(jié)構(gòu)，因此最好的情況是最下面的分析欄沒有But…一對(duì)理想的引物應(yīng)當(dāng)不存在任何一種上述結(jié)構(gòu)，因此最好的情況是最引物編輯引物編輯引物編輯EditprimerhereAnalysistheeditresultAccepttheeditresultReturntothemainwindow引物編輯EditprimerhereAnalysistSomeotherusefulfunctionofPP5SomeotherusefulfunctionofEnzymeEnzymeMeltingtemperaturegraphPer25-merMeltingtemperaturegraphPer2GC%graphPer25-merGC%graphPer25-merStabilityPer5-merStabilityPer5-merOligo6.44使用說(shuō)明主要功能：專門的引物設(shè)計(jì)軟件Oligo6.4