第十二章色譜分離色譜分離又稱層析分離1）利用各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差別2）使各組分不同程度的分布于流動(dòng)和固定的兩相中3）造成各組分的移動(dòng)速度產(chǎn)生差別使各組分相互分離。第十二章色譜分離色譜分離又稱層析分離1特點(diǎn)：（1）純化倍數(shù)高（2）操作規(guī)模小，放大困難（3）

終產(chǎn)品純化（4）適用于價(jià)格昂貴的產(chǎn)品特點(diǎn)：2

色譜分離包括一個(gè)流動(dòng)相（氣相或液相）和一個(gè)固定相，分離的基礎(chǔ)是組分的差速遷移。在色譜柱中流動(dòng)相沿固定相流動(dòng)，混合物中各組分在此固定相與流動(dòng)相間的分配不同，在固定相中相對(duì)量多的組分，與固定相在一起的時(shí)間分率大，隨流動(dòng)相一起流動(dòng)的速度就慢。這樣，由于混合物中各組分被固定相滯留的程度不同，它們隨流動(dòng)相移動(dòng)的速度就不同（稱為差速遷移），隨流動(dòng)相移動(dòng)快的組分先離開色譜柱，隨流動(dòng)相移動(dòng)慢的組分后離開色譜柱，因而可使混合物的各組分互相分離。第一節(jié)色譜分離的分類一、根據(jù)分離機(jī)理分類色譜分離包括一個(gè)流動(dòng)相（氣相或液相）和31、根據(jù)分離機(jī)理分類吸附色譜依靠對(duì)固體的吸附作用。分配色譜依靠溶質(zhì)在液液兩相的溶解分配離子交換色譜依靠離子交換作用位阻排斥色譜依靠多孔固體或凝膠的排斥效應(yīng)親和色譜依靠生物分子的專一性結(jié)合

生化工程下游技術(shù)課件第十二章色譜分離4StationaryphaseMobilephaseOnePlateofSeparationLLLADSORPTIONPARTITIONLiquid-SolidLiquid-LiquidABC（㏕﹚■

色層分析法的基本原理：非極性極性非極性極性兩相系統(tǒng)樣品分子依據(jù)分子極性選擇性進(jìn)入流動(dòng)相或固定相樣品樣品樣品StationaryphaseMobilephaseOne5凝膠過濾法：樣本固定相流動(dòng)相小分子被延滯大分子流出較快小分子大分子Stokesradius分子大小、形狀凝膠過濾法：樣本固流小分子大分子小分子大分子Stokesr6■凝膠過濾法的洗脫圖譜：目標(biāo)酶（E）最好不要落在主要蛋白質(zhì)峰（Y）的范圍內(nèi)V0之前不應(yīng)有物質(zhì)洗脫出來Vt之后不應(yīng)有物質(zhì)洗脫出來■凝膠過濾法的洗脫圖譜：目標(biāo)酶（E）最好不要落在V0之前不應(yīng)7載體++++++++++++++++樣品分子流動(dòng)相固定相陽離子基團(tuán)Counterion陰離子+

■離子交換法

AnionExchange載體++++++++++++++++樣品分子流動(dòng)相固定相陽8■選擇離子交換介質(zhì)■選擇離子交換介質(zhì)9■親和層析法四項(xiàng)要素耦合反應(yīng)雜質(zhì)洗脫■親和層析法四項(xiàng)要素耦合反應(yīng)雜質(zhì)洗脫10■親和層析法的作用機(jī)理：親和基團(tuán)配體固相載體■親和層析法的作用機(jī)理：親和基團(tuán)固相載體11Ni固相載體MetalChelateAffinityChromatographyHisHisHisProtein■

金屬螯合層析法：Ni固相載體MetalChelateAffinity122、按固定相形狀不同分類柱色譜分離體系采用圓柱管空柱色譜色譜柱是空心——無阻礙的中心通道形色譜紙上色譜固定相是濾紙或?qū)⒐潭ㄏ噍d于紙上

薄層色譜固定相是一層吸附劑物料，平鋪于惰性平板上2、按固定相形狀不同分類13

3、按流動(dòng)相和固定相分類氣相色譜流動(dòng)相是氣體液相色譜流動(dòng)相是液體超臨界色譜流動(dòng)相是超臨界流體4、按色譜操作分類迎頭或前沿色譜以階梯進(jìn)料的形式操作沖洗色譜連續(xù)加入沖洗劑，脈沖進(jìn)料3、按流動(dòng)相和固定相分類14

置換色譜在前沿色譜的基礎(chǔ)上，用吸附能力最強(qiáng)的組分置換程序升溫色譜床層溫度升高，吸附等溫線的斜率減小，有規(guī)則的升高色譜柱的溫度，有利于吸附力強(qiáng)的組分脫附階梯淋洗色譜用不同離子強(qiáng)度(如pH值或鹽濃度等)的溶液有規(guī)律地沖洗床層，使性質(zhì)接近的離子或組分得以分離。5、根據(jù)操作壓力的不同分類低壓色譜<0.5MPa中壓色譜0.55MPa高壓色譜550MPa置換色譜在前沿色譜的基礎(chǔ)上，用吸附能力最強(qiáng)的組分置15第二節(jié)生物工業(yè)中的色譜分離

一、色譜分離的規(guī)模色譜分析：<10mg半制備（中等規(guī)模制備）：10-50mg制備（樣品制備）：0.1-1g工業(yè)生產(chǎn)：>20g/d第二節(jié)生物工業(yè)中的色譜分離16二、色譜分離方法的選擇選擇不同的色譜分離方法的依據(jù)：1）目的產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)、物理化學(xué)特性及分子量的大小。2）主要雜質(zhì)，特別是分子結(jié)構(gòu)、大小和理化特性與目的產(chǎn)物相接近的雜質(zhì)的成分與含量。3）目的產(chǎn)物在色譜分離過程中生理活性的穩(wěn)定性。二、色譜分離方法的選擇17三、分析色譜與制備色譜和工業(yè)色譜的比較

1）應(yīng)用色譜技術(shù)范圍的不同2）操作上的不同

3）色譜分離理論上的不同

理論塔板數(shù)的不同

2分配系數(shù)的不同

3樣品保留值與峰高的不同三、分析色譜與制備色譜和工業(yè)色譜的比較18

第四節(jié)色譜分離的基本原理在色譜操作中，加入洗脫劑而使各組分分層的操作稱為展開洗脫時(shí)從柱中流出的溶液稱為洗脫液展開后各組分的分布情況稱為色譜一、分配色譜

分配色譜是利用混合物中各組分在兩種互不相溶的溶劑中的分配系數(shù)不同而得以分離，其過程相當(dāng)于連續(xù)性的溶劑抽提。第四節(jié)色譜分離的基本原理一、分配色譜19(一)分配系數(shù)在一定條件下，一定量的溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中達(dá)到平衡時(shí)，溶質(zhì)在兩種中的濃度之比為一常數(shù)，此常數(shù)稱為分配系數(shù)。(二)阻滯因數(shù)溶質(zhì)在色譜柱(紙、板)中的移動(dòng)速率與流動(dòng)相移動(dòng)速率之比稱為阻滯因數(shù)，以Rf表示，因而也稱為Rf值。

Rf=1，溶質(zhì)不溶于固定相Rf=0，溶質(zhì)不溶于流動(dòng)相0<Rf<1，Rf越大，溶質(zhì)隨流動(dòng)相流動(dòng)的速度越快(三)塔板理論同化工原理中的蒸餾操作一樣，色譜柱的分離效率也可用塔板理論來描述。(一)分配系數(shù)20生化工程下游技術(shù)課件第十二章色譜分離21二、吸附色譜吸附現(xiàn)象是表面的一個(gè)重要性質(zhì)之一。固體表面的分子(離子或原子)和固體內(nèi)部分于所受的吸引力不相等。表面層所受的作用力小，因而溶質(zhì)分子在流動(dòng)過程中碰到固體表面時(shí)受到表面剩余力的影響，被吸附而停留下來。二、吸附色譜22

吸附色譜可分為無機(jī)基質(zhì)吸附色譜(多種作用力)、疏水作用吸附色譜(疏水作用)、共價(jià)作用吸附色譜(共價(jià)鍵)、金屬整合作用吸附色譜(整合作用)、聚既胺吸附色譜(氫鍵作用)等。此外，離子交換色譜和親和色譜也可歸類于吸附色譜，(一)等溫曲線吸附等溫曲線是指在一定溫度下溶質(zhì)分子在兩相界面上進(jìn)行的吸附過程達(dá)到平衡時(shí)它們?cè)趦上嘀袧舛戎g的關(guān)系曲線。(二)解離常數(shù)與分離因數(shù)在反應(yīng)工程中，人們習(xí)慣于應(yīng)用解離常數(shù)來討論分子間的相互作用。吸附色譜可分為無機(jī)基質(zhì)吸附色譜(多種作用力)、疏水作23三、凝膠色譜分離凝膠色譜分離具有許多特點(diǎn)：(1)凝膠為不帶電荷的惰性物質(zhì)，不與溶質(zhì)分子發(fā)生任何作用，因此分離條件溫和，蛋白質(zhì)收率高，重現(xiàn)性好；(2)、應(yīng)用范圍廣，分離分子量的覆蓋面大，可分離從幾百到數(shù)百萬分子量的分子；(3)設(shè)備簡(jiǎn)單，易于操作，周期短，層析劑不需再生即可反復(fù)使用，有的可連續(xù)使用幾百次至上千次。

這些優(yōu)點(diǎn)使凝膠色譜分離已成為一種通用的分離方法，在生物大分子物質(zhì)的制備與生產(chǎn)技術(shù)中被廣泛應(yīng)用。三、凝膠色譜分離這些優(yōu)點(diǎn)使凝膠色譜分離已成為24生化工程下游技術(shù)課件第十二章色譜分離25

第五節(jié)柱色譜分離法工業(yè)規(guī)模的色譜分離大多采用柱色譜分離法，而且吸附色譜、分配色譜、凝膠色譜、離子交換色譜和親和色譜等都可在柱中進(jìn)行，它們的實(shí)驗(yàn)裝置和操作方法也基本類似。一、層析劑用于色譜分離技術(shù)中的固定相或分離介質(zhì)，總稱為層析劑。它由基質(zhì)和表面活性官能團(tuán)(或活動(dòng)中心)組成。其中，層析劑的基質(zhì)材料應(yīng)為化學(xué)惰性物質(zhì)，與目的產(chǎn)物和雜質(zhì)都無結(jié)合作用；活性官能團(tuán)則根據(jù)所用色譜分離方法選用或者制取。第五節(jié)柱色譜分離法26生物產(chǎn)品所需固定相或?qū)游鰟?yīng)具有下列特性：(1)不溶于流動(dòng)相，且具有較好的化學(xué)穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度；能經(jīng)受使用、清洗和再生時(shí)的各種環(huán)境條件；對(duì)于生物活性物質(zhì)的分離，還必須能耐受生物降解作用。(2)具有較大的表面積和孔隙度，且粒度、孔徑分布均勻。(3)有較高的回收率和負(fù)載量，能達(dá)到所需的分離效率，且重現(xiàn)性好。(4)有些分離過程，層析劑使用前后需要高壓消毒，此時(shí)層析劑應(yīng)具有較好的熱穩(wěn)定性。(5)無毒性，分離過程不引起目的產(chǎn)物的變性或失活。(6)成本較低，價(jià)格合理。生物產(chǎn)品所需固定相或?qū)游鰟?yīng)具有下列特性：27

層析劑的分類方法很多：1）按化合物的種類可分成無機(jī)基質(zhì)層析劑和有機(jī)基質(zhì)層析劑兩大類；2）按色譜分離機(jī)理可分成吸附、分配、離子交換、凝膠和親和層析劑5類；3）按形狀可分成球形和無定形兩類；4）按硬度可分成硬質(zhì)層析劑、半硬質(zhì)凝膠層析劑及一些如瓊脂糖的生物軟膠；5）按結(jié)構(gòu)可分成表面多孔薄層層析劑和完全多孔層析劑層析劑的分類方法很多：28(一)無機(jī)基質(zhì)層析劑無機(jī)基質(zhì)層析劑常用的基本材料有硅膠、氧化鋁、活性炭、多孔玻璃、磷酸鈣等。將這些無機(jī)材料制成適宜應(yīng)用的球形或無定形顆粒，可直接用于吸附和正相分配色譜。其中有些無機(jī)材料經(jīng)化學(xué)修飾或涂層改性后，可制成不同分離機(jī)理的層析劑，以滿足不同的分離目的。(一)無機(jī)基質(zhì)層析劑29(二)有機(jī)基質(zhì)層析劑與無機(jī)基質(zhì)比較，有機(jī)基質(zhì)材料具有如下特征：(1)基質(zhì)微?？蓮V泛選擇單體和交聯(lián)劑聚合進(jìn)行化學(xué)改性處理，所合成的層析劑產(chǎn)品普遍具有良好的選擇性；(2)層析劑負(fù)載能力強(qiáng)，有較高的色譜容量；(3)具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性，可在廣泛的pH范圍內(nèi)使用；(4)不易產(chǎn)生不可逆的吸附作用，特別是對(duì)于生化物質(zhì)的分離能較好地保存其生物活性。

有機(jī)基質(zhì)的不足之處在于機(jī)械強(qiáng)度較低，孔結(jié)構(gòu)復(fù)雜，洗脫時(shí)體積會(huì)變化。(二)有機(jī)基質(zhì)層析劑有機(jī)基質(zhì)的不足之處在于機(jī)30■

膠體粒子的粗細(xì)影溶離液的流動(dòng)：■膠體粒子的粗細(xì)影溶離液的流動(dòng)：3130μm15μm5μmInfluenceofParticleSizeontheSeparationeffect30μm15μm5μmInfluenceofPartic32■

溶離液是以擴(kuò)散方式進(jìn)出膠球：■溶離液是以擴(kuò)散方式進(jìn)出膠球：33■

洗脫液對(duì)膠球的擴(kuò)散：■洗脫液對(duì)膠球的擴(kuò)散：34二、裝置柱色譜裝置—般由進(jìn)樣、流動(dòng)相供給、色譜柱、檢測(cè)及流分收集器等部分構(gòu)成，其中色譜柱是色譜分離裝置的關(guān)鍵部件。(一)進(jìn)樣及流動(dòng)相供給裝置在制備型和工業(yè)型高效液相色譜中，流動(dòng)相供給部分一般包括貯液罐、高壓泵、液體混合室及梯度洗脫系統(tǒng)。二、裝置35生化工程下游技術(shù)課件第十二章色譜分離36

(1)具有較高的輸出壓力。層析劑顆粒越細(xì)，色譜柱越長，流動(dòng)相粘度越大，所需高壓泵的輸出壓力就越高。(2)能使流動(dòng)相以均勻的流速進(jìn)入色譜柱，脈沖式進(jìn)料會(huì)使分離效果下降。(3)耐腐蝕性強(qiáng)。(4)泵的死角體積小，以便于迅速更換流動(dòng)相和梯度洗脫。

高壓泵是流動(dòng)相供給的關(guān)鍵設(shè)備，分恒壓和恒流兩種基本類型。無論采用哪種泵都必須滿足下列基本要求：(1)具有較高的輸出壓力。層析劑顆粒越細(xì)，色譜柱越長，流動(dòng)37(二)色譜往

色譜柱通常用玻璃柱，這樣可直接觀察色帶的移動(dòng)情況，柱應(yīng)該平直，直徑均勻。柱的入口端應(yīng)有進(jìn)料分布器，使進(jìn)入柱內(nèi)的流動(dòng)相分布均勻并有規(guī)則的流型。柱的底部用以支持固定相。柱的出口管子應(yīng)該盡量短些，這樣可以避免已分離的組分重新混合。在分離生物物質(zhì)時(shí)，有些色譜柱需帶有夾套，以保持操作過程能在適宜的溫度下進(jìn)行。還有些柱應(yīng)能進(jìn)行消毒，以免微生物的污染。(二)色譜往38

柱的分離效率與柱長成正比，與柱的直徑成反比，因此色譜柱通常是細(xì)長的。

柱徑的增加可使樣品負(fù)載量成平方地增加，但柱徑大時(shí)，流動(dòng)很難均勻，色帶不易規(guī)則，因而分離效果差；柱徑太小時(shí)，進(jìn)樣量少，且使用不便，裝柱困難。色譜柱的長度與許多因素有關(guān)，包括色譜分離的方法、層析劑的種類、容量和粒度，填裝的方法和填裝的均勻度等。就目前采用的勻漿填裝技術(shù)，填裝長度一般不能超過50cm。而大多數(shù)色譜柱的長度在25cm左右。柱的分離效率與柱長成正比，與柱的直徑成反比，因此39■層析柱的裝填方法預(yù)估體積清洗凝膠緩沖液平衡溫度平衡靜置凝膠膠體裝填凝膠暫停流洗已堆積尚未沉降加壓流洗沉降緊密■層析柱的裝填方法預(yù)估體積緩沖液平衡溫度平衡膠體裝填凝膠40■液相柱層析系統(tǒng)緩沖液梯度混合儀分步收集器監(jiān)視器凝膠床體記錄器蠕動(dòng)泵■液相柱層析系統(tǒng)緩沖液梯度混合儀分步收集器監(jiān)41(三)檢測(cè)器與流分收集器通過檢測(cè)器連續(xù)監(jiān)測(cè)柱底出口處液體中各組分的濃度變化，可以了解樣品中組分的分辨情況。根據(jù)組分的物理化學(xué)特性，例如紫外吸收、熒光性、電導(dǎo)率、旋光性以及可見光光密度等，選用適當(dāng)?shù)膬x器，進(jìn)行在線檢測(cè)。

流分收集器是將底部流出的液體，每次按一定量分別收集的儀器。有滴數(shù)式、容量式、質(zhì)量式等若干種。其中以容量式和質(zhì)量式較為方便實(shí)用。在以相對(duì)密度不同的洗脫劑依次洗脫時(shí)，容量式一般更為有利。(三)檢測(cè)器與流分收集器42三、操作技術(shù)(一)樣品溶解與進(jìn)樣方法1）采用色譜方法分離和純化生物大分子物質(zhì)時(shí)，制備合適的樣品溶液是成敗的關(guān)鍵之一。蛋白質(zhì)類樣品的溶解度有限，通常需加其他試劑，以增加它們?cè)谒械娜芙舛取?）溶劑的性質(zhì)也必須適應(yīng)所用的固定相，使大量的樣品溶液導(dǎo)入色譜往后不馬上擴(kuò)散，集中在柱頭，以達(dá)到“活塞式”進(jìn)樣的目的。3）適宜的進(jìn)料方法三、操作技術(shù)43(二)展開操作樣品上柱后，加入洗脫劑，使樣品分離并收集目的產(chǎn)物。下面將介紹幾種常用的展開方式。1．洗脫展開法洗脫展開法是展開操作中應(yīng)用最廣的一種方法。操作時(shí)，先將樣品輸入色譜柱，隨即加入一種不與固定相發(fā)生作用的溶劑或幾種溶劑的混合物作為流動(dòng)相沖洗。在洗脫過程中，各組分因與固定相的作用力不同而分離，并隨溶劑向下移動(dòng)，最后有順序地全部流出色譜柱。

(二)展開操作44生化工程下游技術(shù)課件第十二章色譜分離45

根據(jù)洗脫過程中洗脫劑的組成是否改變，洗脫展開法可分為如下3種。

1）恒定洗脫法恒定洗脫法在整個(gè)洗脫過程中不改變洗脫劑的組成。2）逐次洗脫法此法在洗脫過程中，洗脫劑的組成至少改變一次。3）梯度洗脫法所謂梯度洗脫法就是逐漸改變洗脫劑的組成，使洗脫條件更有利于混合物的分離，從而消除重疊峰現(xiàn)象。根據(jù)洗脫過程中洗脫劑的組成是否改變，洗脫展開法可分46生化工程下游技術(shù)課件第十二章色譜分離47生化工程下游技術(shù)課件第十二章色譜分離482．前沿分析法

在前沿分析法中，樣品溶液不是作為一部分進(jìn)入色譜柱，而是連續(xù)不斷地輸入色譜柱，即樣品溶液本身起流動(dòng)相的作用。只能得到其中作用最弱的純物質(zhì)，不能用于混合物的分離。2．前沿分析法493．置換展開法

置換展開法又名頂替法或取代法。置換展開法與洗脫展開法差別不大，其主要的不同之處是樣品輸入色譜柱后，用一種與固定相作用力極強(qiáng)的置換劑作為流動(dòng)相，去替代結(jié)合在固定相表面的溶質(zhì)分子。3．置換展開法50四、洗脫色譜動(dòng)力學(xué)（略）五、徑向色譜（為解決大直徑色譜柱分離效果較差的問題）徑向色譜柱的結(jié)構(gòu)及原理如圖所示。在徑向色譜住中，樣品和流動(dòng)相是從柱的圓周圍流向柱圓心。四、洗脫色譜動(dòng)力學(xué)（略）51生化工程下游技術(shù)課件第十二章色譜分離52徑向色譜有以下特點(diǎn)：

1）可在較小的柱床層高度時(shí)使用較大的流動(dòng)相流速；

2）圓柱表面積一般大于其橫截面積，所以在流動(dòng)相保持較高的體積速率時(shí)，反壓降較低；

3）當(dāng)保持制備色譜柱直徑不變，只增加柱長時(shí)，可以線性增大樣品處理量，樣品的規(guī)?？稍诒３窒嗨频纳V條件下直接放大，各組分的保留時(shí)間及分辨情況與小試時(shí)完全相同。徑向色譜有以下特點(diǎn)：53生化工程下游技術(shù)課件第十二章色譜分離54生化工程下游技術(shù)課件第十二章色譜分離55親和色譜親和色譜是專門用于純化生物大分子的色譜分離技術(shù)，它是基于固定相的配基與生物分子間的特殊生物親和能力的不同來進(jìn)行相互分離的。親和色譜的顯著特點(diǎn)是，具有其他分離技術(shù)所不能比擬的高選擇性，且色譜過程操作條件溫和，能有效地保持生物大分子高級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，活性樣品的回收率也比較高。親和色譜的局限性在于不是任何生物高分子都有特定的配基，針對(duì)某一分離對(duì)象需要制備專一的配基和選擇特定的色譜條件。親和色譜56生化工程下游技術(shù)課件第十二章色譜分離57

在親和色譜分離法中，經(jīng)常被采用的生物親和關(guān)系如下：①酶：底物、底物類似物、抑制劑、輔酶、金屬離子；②抗體：抗原、病毒、細(xì)胞；⑦激素、維生素：受體蛋白、載體蛋白；④外源凝集素：多糖、糖蛋白、細(xì)胞表面受體蛋白、細(xì)胞；⑤核酸：互補(bǔ)堿基鏈段、組蛋白、核酸聚合酶、核酸結(jié)合蛋白；⑥細(xì)胞：細(xì)胞表面特異蛋白、外源凝集素。在親和色譜分離法中，經(jīng)常被采用的生物親和關(guān)系如下：58

根據(jù)親和色譜選擇性的高低，可將親和色譜分為專一性和基團(tuán)性兩大類。專一性的配基僅對(duì)某種生物物質(zhì)有特別強(qiáng)的親和性?；鶊F(tuán)性的配基則指固定相配基對(duì)一類基團(tuán)有極強(qiáng)的親和關(guān)系，能與許多需要這些輔酶才起催化作用的酶(各種脫氫酶、激酶等)發(fā)生親和結(jié)合。

基團(tuán)性親和色譜具有實(shí)用意義，它可以擴(kuò)大親和色譜的適應(yīng)范圍.根據(jù)親和色譜選擇性的高低，可將親和色譜分為59二、親和層析劑

親和層析劑的制備過程一般包括3步，即載體(基質(zhì))的選擇、載體的活化和配基的連接。親和色譜的理想載體應(yīng)具有下列特性：①不溶性；②滲透性，即具有疏松的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，容許大分子自由通過；③高硬度及適當(dāng)?shù)念w粒形式，最好為均勻的珠狀；④最低的吸附力；⑤較好的化學(xué)穩(wěn)定性；⑥抗微生物和酶的侵蝕；⑦親水性；⑧具有大量的供反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán)，能與大量配基共價(jià)連接。二、親和層析劑親和色譜的理想載體應(yīng)具有下列特性：60生化工程下游技術(shù)課件第十二章色譜分離61生化工程下游技術(shù)課件第十二章色譜分離62三、親和色譜操作中的洗脫方法親和色譜一般采用柱色譜法。由于生物大分子與配基的作用形式是多種多樣的，因此，它們的洗脫條件通常需要通過實(shí)驗(yàn)獲得。在親和色譜洗脫操作中，洗脫方法有兩類，即普通洗脫法和專一性洗脫法。通過改變?nèi)軇┗蚓彌_液的類型，改變緩沖液的pH和離子強(qiáng)度，改變洗脫溫度，以及添加促溶劑等措施進(jìn)行洗脫。專一性洗脫法是指溶液中的配基、抑制劑或半抗原等物質(zhì)與親和層析劑上的配基，同時(shí)對(duì)生物活性物質(zhì)產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合，從而達(dá)到洗脫的目的。三、親和色譜操作中的洗脫方法63第十二章色譜分離色譜分離又稱層析分離1）利用各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差別2）使各組分不同程度的分布于流動(dòng)和固定的兩相中3）造成各組分的移動(dòng)速度產(chǎn)生差別使各組分相互分離。第十二章色譜分離色譜分離又稱層析分離64特點(diǎn)：（1）純化倍數(shù)高（2）操作規(guī)模小，放大困難（3）

終產(chǎn)品純化（4）適用于價(jià)格昂貴的產(chǎn)品特點(diǎn)：65

色譜分離包括一個(gè)流動(dòng)相（氣相或液相）和一個(gè)固定相，分離的基礎(chǔ)是組分的差速遷移。在色譜柱中流動(dòng)相沿固定相流動(dòng)，混合物中各組分在此固定相與流動(dòng)相間的分配不同，在固定相中相對(duì)量多的組分，與固定相在一起的時(shí)間分率大，隨流動(dòng)相一起流動(dòng)的速度就慢。這樣，由于混合物中各組分被固定相滯留的程度不同，它們隨流動(dòng)相移動(dòng)的速度就不同（稱為差速遷移），隨流動(dòng)相移動(dòng)快的組分先離開色譜柱，隨流動(dòng)相移動(dòng)慢的組分后離開色譜柱，因而可使混合物的各組分互相分離。第一節(jié)色譜分離的分類一、根據(jù)分離機(jī)理分類色譜分離包括一個(gè)流動(dòng)相（氣相或液相）和661、根據(jù)分離機(jī)理分類吸附色譜依靠對(duì)固體的吸附作用。分配色譜依靠溶質(zhì)在液液兩相的溶解分配離子交換色譜依靠離子交換作用位阻排斥色譜依靠多孔固體或凝膠的排斥效應(yīng)親和色譜依靠生物分子的專一性結(jié)合

生化工程下游技術(shù)課件第十二章色譜分離67StationaryphaseMobilephaseOnePlateofSeparationLLLADSORPTIONPARTITIONLiquid-SolidLiquid-LiquidABC（㏕﹚■

色層分析法的基本原理：非極性極性非極性極性兩相系統(tǒng)樣品分子依據(jù)分子極性選擇性進(jìn)入流動(dòng)相或固定相樣品樣品樣品StationaryphaseMobilephaseOne68凝膠過濾法：樣本固定相流動(dòng)相小分子被延滯大分子流出較快小分子大分子Stokesradius分子大小、形狀凝膠過濾法：樣本固流小分子大分子小分子大分子Stokesr69■凝膠過濾法的洗脫圖譜：目標(biāo)酶（E）最好不要落在主要蛋白質(zhì)峰（Y）的范圍內(nèi)V0之前不應(yīng)有物質(zhì)洗脫出來Vt之后不應(yīng)有物質(zhì)洗脫出來■凝膠過濾法的洗脫圖譜：目標(biāo)酶（E）最好不要落在V0之前不應(yīng)70載體++++++++++++++++樣品分子流動(dòng)相固定相陽離子基團(tuán)Counterion陰離子+

■離子交換法

AnionExchange載體++++++++++++++++樣品分子流動(dòng)相固定相陽71■選擇離子交換介質(zhì)■選擇離子交換介質(zhì)72■親和層析法四項(xiàng)要素耦合反應(yīng)雜質(zhì)洗脫■親和層析法四項(xiàng)要素耦合反應(yīng)雜質(zhì)洗脫73■親和層析法的作用機(jī)理：親和基團(tuán)配體固相載體■親和層析法的作用機(jī)理：親和基團(tuán)固相載體74Ni固相載體MetalChelateAffinityChromatographyHisHisHisProtein■

金屬螯合層析法：Ni固相載體MetalChelateAffinity752、按固定相形狀不同分類柱色譜分離體系采用圓柱管空柱色譜色譜柱是空心——無阻礙的中心通道形色譜紙上色譜固定相是濾紙或?qū)⒐潭ㄏ噍d于紙上

薄層色譜固定相是一層吸附劑物料，平鋪于惰性平板上2、按固定相形狀不同分類76

3、按流動(dòng)相和固定相分類氣相色譜流動(dòng)相是氣體液相色譜流動(dòng)相是液體超臨界色譜流動(dòng)相是超臨界流體4、按色譜操作分類迎頭或前沿色譜以階梯進(jìn)料的形式操作沖洗色譜連續(xù)加入沖洗劑，脈沖進(jìn)料3、按流動(dòng)相和固定相分類77

置換色譜在前沿色譜的基礎(chǔ)上，用吸附能力最強(qiáng)的組分置換程序升溫色譜床層溫度升高，吸附等溫線的斜率減小，有規(guī)則的升高色譜柱的溫度，有利于吸附力強(qiáng)的組分脫附階梯淋洗色譜用不同離子強(qiáng)度(如pH值或鹽濃度等)的溶液有規(guī)律地沖洗床層，使性質(zhì)接近的離子或組分得以分離。5、根據(jù)操作壓力的不同分類低壓色譜<0.5MPa中壓色譜0.55MPa高壓色譜550MPa置換色譜在前沿色譜的基礎(chǔ)上，用吸附能力最強(qiáng)的組分置78第二節(jié)生物工業(yè)中的色譜分離

一、色譜分離的規(guī)模色譜分析：<10mg半制備（中等規(guī)模制備）：10-50mg制備（樣品制備）：0.1-1g工業(yè)生產(chǎn)：>20g/d第二節(jié)生物工業(yè)中的色譜分離79二、色譜分離方法的選擇選擇不同的色譜分離方法的依據(jù)：1）目的產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)、物理化學(xué)特性及分子量的大小。2）主要雜質(zhì)，特別是分子結(jié)構(gòu)、大小和理化特性與目的產(chǎn)物相接近的雜質(zhì)的成分與含量。3）目的產(chǎn)物在色譜分離過程中生理活性的穩(wěn)定性。二、色譜分離方法的選擇80三、分析色譜與制備色譜和工業(yè)色譜的比較

1）應(yīng)用色譜技術(shù)范圍的不同2）操作上的不同

3）色譜分離理論上的不同

理論塔板數(shù)的不同

2分配系數(shù)的不同

3樣品保留值與峰高的不同三、分析色譜與制備色譜和工業(yè)色譜的比較81

第四節(jié)色譜分離的基本原理在色譜操作中，加入洗脫劑而使各組分分層的操作稱為展開洗脫時(shí)從柱中流出的溶液稱為洗脫液展開后各組分的分布情況稱為色譜一、分配色譜

分配色譜是利用混合物中各組分在兩種互不相溶的溶劑中的分配系數(shù)不同而得以分離，其過程相當(dāng)于連續(xù)性的溶劑抽提。第四節(jié)色譜分離的基本原理一、分配色譜82(一)分配系數(shù)在一定條件下，一定量的溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中達(dá)到平衡時(shí)，溶質(zhì)在兩種中的濃度之比為一常數(shù)，此常數(shù)稱為分配系數(shù)。(二)阻滯因數(shù)溶質(zhì)在色譜柱(紙、板)中的移動(dòng)速率與流動(dòng)相移動(dòng)速率之比稱為阻滯因數(shù)，以Rf表示，因而也稱為Rf值。

Rf=1，溶質(zhì)不溶于固定相Rf=0，溶質(zhì)不溶于流動(dòng)相0<Rf<1，Rf越大，溶質(zhì)隨流動(dòng)相流動(dòng)的速度越快(三)塔板理論同化工原理中的蒸餾操作一樣，色譜柱的分離效率也可用塔板理論來描述。(一)分配系數(shù)83生化工程下游技術(shù)課件第十二章色譜分離84二、吸附色譜吸附現(xiàn)象是表面的一個(gè)重要性質(zhì)之一。固體表面的分子(離子或原子)和固體內(nèi)部分于所受的吸引力不相等。表面層所受的作用力小，因而溶質(zhì)分子在流動(dòng)過程中碰到固體表面時(shí)受到表面剩余力的影響，被吸附而停留下來。二、吸附色譜85

吸附色譜可分為無機(jī)基質(zhì)吸附色譜(多種作用力)、疏水作用吸附色譜(疏水作用)、共價(jià)作用吸附色譜(共價(jià)鍵)、金屬整合作用吸附色譜(整合作用)、聚既胺吸附色譜(氫鍵作用)等。此外，離子交換色譜和親和色譜也可歸類于吸附色譜，(一)等溫曲線吸附等溫曲線是指在一定溫度下溶質(zhì)分子在兩相界面上進(jìn)行的吸附過程達(dá)到平衡時(shí)它們?cè)趦上嘀袧舛戎g的關(guān)系曲線。(二)解離常數(shù)與分離因數(shù)在反應(yīng)工程中，人們習(xí)慣于應(yīng)用解離常數(shù)來討論分子間的相互作用。吸附色譜可分為無機(jī)基質(zhì)吸附色譜(多種作用力)、疏水作86三、凝膠色譜分離凝膠色譜分離具有許多特點(diǎn)：(1)凝膠為不帶電荷的惰性物質(zhì)，不與溶質(zhì)分子發(fā)生任何作用，因此分離條件溫和，蛋白質(zhì)收率高，重現(xiàn)性好；(2)、應(yīng)用范圍廣，分離分子量的覆蓋面大，可分離從幾百到數(shù)百萬分子量的分子；(3)設(shè)備簡(jiǎn)單，易于操作，周期短，層析劑不需再生即可反復(fù)使用，有的可連續(xù)使用幾百次至上千次。

這些優(yōu)點(diǎn)使凝膠色譜分離已成為一種通用的分離方法，在生物大分子物質(zhì)的制備與生產(chǎn)技術(shù)中被廣泛應(yīng)用。三、凝膠色譜分離這些優(yōu)點(diǎn)使凝膠色譜分離已成為87生化工程下游技術(shù)課件第十二章色譜分離88

第五節(jié)柱色譜分離法工業(yè)規(guī)模的色譜分離大多采用柱色譜分離法，而且吸附色譜、分配色譜、凝膠色譜、離子交換色譜和親和色譜等都可在柱中進(jìn)行，它們的實(shí)驗(yàn)裝置和操作方法也基本類似。一、層析劑用于色譜分離技術(shù)中的固定相或分離介質(zhì)，總稱為層析劑。它由基質(zhì)和表面活性官能團(tuán)(或活動(dòng)中心)組成。其中，層析劑的基質(zhì)材料應(yīng)為化學(xué)惰性物質(zhì)，與目的產(chǎn)物和雜質(zhì)都無結(jié)合作用；活性官能團(tuán)則根據(jù)所用色譜分離方法選用或者制取。第五節(jié)柱色譜分離法89生物產(chǎn)品所需固定相或?qū)游鰟?yīng)具有下列特性：(1)不溶于流動(dòng)相，且具有較好的化學(xué)穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度；能經(jīng)受使用、清洗和再生時(shí)的各種環(huán)境條件；對(duì)于生物活性物質(zhì)的分離，還必須能耐受生物降解作用。(2)具有較大的表面積和孔隙度，且粒度、孔徑分布均勻。(3)有較高的回收率和負(fù)載量，能達(dá)到所需的分離效率，且重現(xiàn)性好。(4)有些分離過程，層析劑使用前后需要高壓消毒，此時(shí)層析劑應(yīng)具有較好的熱穩(wěn)定性。(5)無毒性，分離過程不引起目的產(chǎn)物的變性或失活。(6)成本較低，價(jià)格合理。生物產(chǎn)品所需固定相或?qū)游鰟?yīng)具有下列特性：90

層析劑的分類方法很多：1）按化合物的種類可分成無機(jī)基質(zhì)層析劑和有機(jī)基質(zhì)層析劑兩大類；2）按色譜分離機(jī)理可分成吸附、分配、離子交換、凝膠和親和層析劑5類；3）按形狀可分成球形和無定形兩類；4）按硬度可分成硬質(zhì)層析劑、半硬質(zhì)凝膠層析劑及一些如瓊脂糖的生物軟膠；5）按結(jié)構(gòu)可分成表面多孔薄層層析劑和完全多孔層析劑層析劑的分類方法很多：91(一)無機(jī)基質(zhì)層析劑無機(jī)基質(zhì)層析劑常用的基本材料有硅膠、氧化鋁、活性炭、多孔玻璃、磷酸鈣等。將這些無機(jī)材料制成適宜應(yīng)用的球形或無定形顆粒，可直接用于吸附和正相分配色譜。其中有些無機(jī)材料經(jīng)化學(xué)修飾或涂層改性后，可制成不同分離機(jī)理的層析劑，以滿足不同的分離目的。(一)無機(jī)基質(zhì)層析劑92(二)有機(jī)基質(zhì)層析劑與無機(jī)基質(zhì)比較，有機(jī)基質(zhì)材料具有如下特征：(1)基質(zhì)微?？蓮V泛選擇單體和交聯(lián)劑聚合進(jìn)行化學(xué)改性處理，所合成的層析劑產(chǎn)品普遍具有良好的選擇性；(2)層析劑負(fù)載能力強(qiáng)，有較高的色譜容量；(3)具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性，可在廣泛的pH范圍內(nèi)使用；(4)不易產(chǎn)生不可逆的吸附作用，特別是對(duì)于生化物質(zhì)的分離能較好地保存其生物活性。

有機(jī)基質(zhì)的不足之處在于機(jī)械強(qiáng)度較低，孔結(jié)構(gòu)復(fù)雜，洗脫時(shí)體積會(huì)變化。(二)有機(jī)基質(zhì)層析劑有機(jī)基質(zhì)的不足之處在于機(jī)93■

膠體粒子的粗細(xì)影溶離液的流動(dòng)：■膠體粒子的粗細(xì)影溶離液的流動(dòng)：9430μm15μm5μmInfluenceofParticleSizeontheSeparationeffect30μm15μm5μmInfluenceofPartic95■

溶離液是以擴(kuò)散方式進(jìn)出膠球：■溶離液是以擴(kuò)散方式進(jìn)出膠球：96■

洗脫液對(duì)膠球的擴(kuò)散：■洗脫液對(duì)膠球的擴(kuò)散：97二、裝置柱色譜裝置—般由進(jìn)樣、流動(dòng)相供給、色譜柱、檢測(cè)及流分收集器等部分構(gòu)成，其中色譜柱是色譜分離裝置的關(guān)鍵部件。(一)進(jìn)樣及流動(dòng)相供給裝置在制備型和工業(yè)型高效液相色譜中，流動(dòng)相供給部分一般包括貯液罐、高壓泵、液體混合室及梯度洗脫系統(tǒng)。二、裝置98生化工程下游技術(shù)課件第十二章色譜分離99

(1)具有較高的輸出壓力。層析劑顆粒越細(xì)，色譜柱越長，流動(dòng)相粘度越大，所需高壓泵的輸出壓力就越高。(2)能使流動(dòng)相以均勻的流速進(jìn)入色譜柱，脈沖式進(jìn)料會(huì)使分離效果下降。(3)耐腐蝕性強(qiáng)。(4)泵的死角體積小，以便于迅速更換流動(dòng)相和梯度洗脫。

高壓泵是流動(dòng)相供給的關(guān)鍵設(shè)備，分恒壓和恒流兩種基本類型。無論采用哪種泵都必須滿足下列基本要求：(1)具有較高的輸出壓力。層析劑顆粒越細(xì)，色譜柱越長，流動(dòng)100(二)色譜往

色譜柱通常用玻璃柱，這樣可直接觀察色帶的移動(dòng)情況，柱應(yīng)該平直，直徑均勻。柱的入口端應(yīng)有進(jìn)料分布器，使進(jìn)入柱內(nèi)的流動(dòng)相分布均勻并有規(guī)則的流型。柱的底部用以支持固定相。柱的出口管子應(yīng)該盡量短些，這樣可以避免已分離的組分重新混合。在分離生物物質(zhì)時(shí)，有些色譜柱需帶有夾套，以保持操作過程能在適宜的溫度下進(jìn)行。還有些柱應(yīng)能進(jìn)行消毒，以免微生物的污染。(二)色譜往101

柱的分離效率與柱長成正比，與柱的直徑成反比，因此色譜柱通常是細(xì)長的。

柱徑的增加可使樣品負(fù)載量成平方地增加，但柱徑大時(shí)，流動(dòng)很難均勻，色帶不易規(guī)則，因而分離效果差；柱徑太小時(shí)，進(jìn)樣量少，且使用不便，裝柱困難。色譜柱的長度與許多因素有關(guān)，包括色譜分離的方法、層析劑的種類、容量和粒度，填裝的方法和填裝的均勻度等。就目前采用的勻漿填裝技術(shù)，填裝長度一般不能超過50cm。而大多數(shù)色譜柱的長度在25cm左右。柱的分離效率與柱長成正比，與柱的直徑成反比，因此102■層析柱的裝填方法預(yù)估體積清洗凝膠緩沖液平衡溫度平衡靜置凝膠膠體裝填凝膠暫停流洗已堆積尚未沉降加壓流洗沉降緊密■層析柱的裝填方法預(yù)估體積緩沖液平衡溫度平衡膠體裝填凝膠103■液相柱層析系統(tǒng)緩沖液梯度混合儀分步收集器監(jiān)視器凝膠床體記錄器蠕動(dòng)泵■液相柱層析系統(tǒng)緩沖液梯度混合儀分步收集器監(jiān)104(三)檢測(cè)器與流分收集器通過檢測(cè)器連續(xù)監(jiān)測(cè)柱底出口處液體中各組分的濃度變化，可以了解樣品中組分的分辨情況。根據(jù)組分的物理化學(xué)特性，例如紫外吸收、熒光性、電導(dǎo)率、旋光性以及可見光光密度等，選用適當(dāng)?shù)膬x器，進(jìn)行在線檢測(cè)。

流分收集器是將底部流出的液體，每次按一定量分別收集的儀器。有滴數(shù)式、容量式、質(zhì)量式等若干種。其中以容量式和質(zhì)量式較為方便實(shí)用。在以相對(duì)密度不同的洗脫劑依次洗脫時(shí)，容量式一般更為有利。(三)檢測(cè)器與流分收集器105三、操作技術(shù)(一)樣品溶解與進(jìn)樣方法1）采用色譜方法分離和純化生物大分子物質(zhì)時(shí)，制備合適的樣品溶液是成敗的關(guān)鍵之一。蛋白質(zhì)類樣品的溶解度有限，通常需加其他試劑，以增加它們?cè)谒械娜芙舛取?）溶劑的性質(zhì)也必須適應(yīng)所用的固定相，使大量的樣品溶液導(dǎo)入色譜往后不馬上擴(kuò)散，集中在柱頭，以達(dá)到“活塞式”進(jìn)樣的目的。3）適宜的進(jìn)料方法三、操作技術(shù)106(二)展開操作樣品上柱后，加入洗脫劑，使樣品分離并收集目的產(chǎn)物。下面將介紹幾種常用的展開方式。1．洗脫展開法洗脫展開法是展開操作中應(yīng)用最廣的一種方法。操作時(shí)，先將樣品輸入色譜柱，隨即加入一種不與固定相發(fā)生作用的溶劑或幾種溶劑的混合物作為流動(dòng)相沖洗。在洗脫過程中，各組分因與固定相的作用力不同而分離，并隨溶劑向下移動(dòng)，最后有順序地全部流出色譜柱。

(二)展開操作107生化工程下游技術(shù)課件第十二章色譜分離108

根據(jù)洗脫過程中洗脫劑的組成是否改變，洗脫展開法可分為如下3種。

1）恒定洗脫法恒定洗脫法在整個(gè)洗脫過程中不改變洗脫劑的組成。2）逐次洗脫法此法在洗脫過程中，洗脫劑的組成至少改變一次。3）梯度洗脫法所謂梯度洗脫法就是逐漸改變洗脫劑的組成，使洗脫條件更有利于混合物的分離，從而消除重疊峰現(xiàn)象。根據(jù)洗脫過程中洗脫劑的組成是否改變，洗脫展開法可分109生化工程下游技術(shù)課件第十二章色譜分離110生化工程下游技術(shù)課件第十二章色譜分離1112．前沿分析法

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