周俊宜中山醫(yī)科大學(xué)生化教研室服從真理，就能征服一切事物周俊宜中山醫(yī)科大學(xué)生化教研室周俊宜中山醫(yī)科大學(xué)生化教研室服從真理，就能征服一切事物周俊宜中山醫(yī)科大學(xué)生化教研室與細(xì)胞衰老和癌變周俊宜基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化教研室端粒、端粒酶概論周俊宜中山醫(yī)科大學(xué)生化教研室服從真理，就能征服一切事物周俊宜1生化教研室課件2生化教研室課件3生化教研室課件4生化教研室課件5DNA決定蛋白質(zhì)的功能

將基因信息代代相傳復(fù)制轉(zhuǎn)錄和翻譯生命活動(dòng)的執(zhí)行者生命延續(xù)的物質(zhì)基礎(chǔ)DNA決定蛋白質(zhì)的功能將基因信息代代相傳復(fù)制轉(zhuǎn)65’5’端粒消耗端粒維持細(xì)胞衰老細(xì)胞永生化染色體DNA端粒端粒5’5’端粒消耗端粒維持細(xì)胞衰老細(xì)胞永生化染色體DNA端粒端7

七十年代：端粒分子組成確定

八十年代：端粒酶的發(fā)現(xiàn)

九十年代：端粒酶與細(xì)胞衰老和癌癥

三十年代：端粒概念首次提出研究概況

8“端粒和端粒酶的研究歷程就象不斷伸縮的端粒本身變幻無(wú)窮，并且不時(shí)帶給人們某些驚訝。從三十年代端粒概念首次提出，一直到今天活躍在惡性細(xì)胞中的端粒酶研究熱潮的興起，人們眼中的端粒和端粒酶已不僅僅限于它們所形成的染色體的‘保護(hù)帽’，它還顯現(xiàn)出更加意味深長(zhǎng)的內(nèi)涵……”“端粒和端粒酶的研究歷程就象不斷伸縮的端粒本身變幻9“人體的正常細(xì)胞經(jīng)過(guò)有限的分裂次數(shù)后即進(jìn)入衰老階段，停止增殖而最終走向衰亡。呈惡性生長(zhǎng)的癌細(xì)胞似乎擺脫了正常衰老過(guò)程的約束，在無(wú)拘無(wú)束地高速生長(zhǎng)中獲得“永生”。衰老和腫瘤相互對(duì)立卻又同為人類的“天敵”，兩者之間千絲萬(wàn)縷的關(guān)聯(lián)一直以來(lái)為人們所關(guān)注。

近年來(lái)端粒酶熱點(diǎn)的出現(xiàn)被認(rèn)為是聯(lián)結(jié)著腫瘤和衰老研究的一條全新紐帶，國(guó)際權(quán)威期刊Cell、Science等逐年遞增地刊載相關(guān)論文和報(bào)道，對(duì)端粒和端粒酶這一研究方向予以相當(dāng)關(guān)注，認(rèn)為有可能對(duì)腫瘤、衰老等重大生命課題產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響?！薄叭梭w的正常細(xì)胞經(jīng)過(guò)有限的分裂次數(shù)后即進(jìn)入衰老階段，10主要內(nèi)容端粒的結(jié)構(gòu)與功能端粒酶的結(jié)構(gòu)與功能端粒、端粒酶與細(xì)胞衰老端粒、端粒酶與惡性腫瘤主要內(nèi)容端粒的結(jié)構(gòu)與功能11端粒的結(jié)構(gòu)與功能端粒的結(jié)構(gòu)與功能12二十世紀(jì)三十年代，兩位著名的遺傳學(xué)家BarbavaMcClintock和HermannJ.Muller發(fā)現(xiàn)，染色體的末端有一種能穩(wěn)定染色體結(jié)構(gòu)和功能的特殊成分。如果缺少了這種成分，染色體之間就會(huì)互相粘連、出現(xiàn)結(jié)構(gòu)的變化或其它錯(cuò)誤的行為，以致影響到染色體的生存和正確復(fù)制并進(jìn)一步威脅到細(xì)胞的存亡。于是Muller從希臘文的"末端"（telos）和"部分"（meros）二詞為這種特殊的成分創(chuàng)造了一個(gè)全新的術(shù)語(yǔ)"端粒"（telomere）。1端粒的發(fā)現(xiàn)二十世紀(jì)三十年代，兩位著名的遺傳學(xué)家Barbava13斷端降解、斷端融合、結(jié)構(gòu)功能破壞染色體DNAX射線斷端降解、斷端融合、結(jié)構(gòu)功能破壞染色體DNAX射線14從希臘字的末端“telos”和部分“meros”創(chuàng)造了一個(gè)全新的單詞：端?！猼elomere

端粒帽染色體

端粒帽從希臘字的末端“telos”和部分“meros”創(chuàng)造了一個(gè)全15端粒的精確組成則是在七十年代末才首次被提出。1978年，美國(guó)科學(xué)家Blackburn和JosephG.Gall發(fā)現(xiàn)，單細(xì)胞池塘生物四膜蟲(chóng)（Tetrahymena）的端粒是由一種極短的簡(jiǎn)單重復(fù)序列TTGGGG多次重復(fù)而成。從那以后，包括動(dòng)物、植物和微生物在內(nèi)的多種生物的端粒序列已被確定，它們均是由富含G和T的簡(jiǎn)單重復(fù)序列不斷重復(fù)而成。正是這些連接在染色體末端的核苷酸重復(fù)序列和結(jié)合在其上的一些蛋白質(zhì)共同構(gòu)成了真核生物染色體的“末端保護(hù)帽”

。2端粒的精確組成端粒的精確組成則是在七十年代末才首次被提出。1978年，161978年首次發(fā)現(xiàn)四膜蟲(chóng)端粒的分子組成：

端粒染色體DNA端粒n（CCCCAA）n（GGGGTT）3’5’（TTGGGG）n（AACCCC）nn（CCCTAA）n（GGGATT）3’5’（TTAGGG）n（AATCCC）n人端粒的分子組成：1978年首次發(fā)現(xiàn)四膜蟲(chóng)端粒的分子組成：端粒17端粒末端回折結(jié)構(gòu)5‘3‘重復(fù)的GGGGTT鏈重復(fù)的CCCCAA鏈5’-CCCCAAOHCCCAACCCCAACCCCAAOHCCCAA-----3’3’-GGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTT-------5’端粒染色體DNA端粒端粒末端回折結(jié)構(gòu)5‘3‘重復(fù)的GGGGTT鏈重復(fù)的CCCCA181)GT鏈的5’3’總是指向染色體的末端。2)重復(fù)次數(shù)不保守。3)鏈區(qū)內(nèi)有缺口即游離的3’-端羥基存在。4)DNA的最末端不能進(jìn)行末端標(biāo)記，推測(cè)其分子是一個(gè)回折結(jié)構(gòu)。端粒結(jié)構(gòu)的特征：1)GT鏈的5’3’總是指向染色體的末端。端粒結(jié)19n（CCCTAA）n（GGGATT）3’5’（TTAGGG）n（AATCCC）n3’5’n（CCCTAA）n（GGGATT）3’5’（TTAGGG）20生化教研室課件21DNA聚合酶Ⅰ-32P-dNTP端粒DNA缺口平移DNA聚合酶Ⅰ-32P-dNTP端粒DNA缺口平移225’-CCCCAAOHCCCAACCCCAACCCCAAOHCCCAA-----3’3’-GGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTT-------5’DNA聚合酶Ⅰ5‘3’聚合酶5‘3’外切酶5’5’5’-CCCCAAOHCCCAACCCCAACCCCAAOH235’-CCCCAACCC……3’-GTTGGG……末端標(biāo)記物-32P-dNTP5’-CCCCAACCC……3’-GGGGTTGGG……5’-CCCCAACCC……末端標(biāo)記物-32P-dNTP524

端粒帽染色體DNA端粒帽n（CCCCAA）（TTGGGG）nn（GGGGTT）（AACCCC）n3’5’3端粒結(jié)合蛋白保護(hù)端粒不受核酸酶或化學(xué)修飾的作用一般是緊密的非共價(jià)鍵結(jié)合端粒帽染色體DNA端粒帽n25人類纖毛蟲(chóng)類人類纖毛蟲(chóng)類26

隨著對(duì)端粒分子組成結(jié)構(gòu)的闡明，端粒對(duì)維護(hù)染色體完整性的功能已不是一個(gè)籠統(tǒng)的概念?；钴S在細(xì)胞中樞并當(dāng)擔(dān)著延續(xù)生命重任的染色體DNA其實(shí)面臨的是一個(gè)“危機(jī)四伏”的境界，它對(duì)外要抵御核酸酶等各種因素襲擊，對(duì)內(nèi)則有一個(gè)難以“自圓其身”的所謂“末端復(fù)制問(wèn)題”。端粒的存在正是扮演了一個(gè)衛(wèi)士的角色，它就象是一個(gè)盡忠職守的“生命衛(wèi)士”，不但避免了外界因素的入侵，而且在復(fù)制過(guò)程中，把基因組序列包裹在內(nèi)部，以犧牲自身而避免染色體結(jié)構(gòu)基因被侵蝕，從而防止了遺傳信息的丟失，維護(hù)了染色體結(jié)構(gòu)和功能的完整性。4端粒的功能隨著對(duì)端粒分子組成結(jié)構(gòu)的闡明，端粒對(duì)維護(hù)染色體27

對(duì)外:抵御核酸酶等外界對(duì)內(nèi):染色體DNA的因素的襲擊末端復(fù)制問(wèn)題保護(hù)染色體結(jié)構(gòu)和功能的完整性染色體對(duì)外:抵御核酸酶等外界對(duì)內(nèi):染色體DNA的28染色體DNA的末端復(fù)制問(wèn)題：3’5’5’3’RNA引物3’3’RNA引物水解即DNA復(fù)制過(guò)程不能"自始至終"完整地復(fù)制整個(gè)線性染色體，而是每次都在其5'末端留下一個(gè)空缺未能填補(bǔ)（即RNA引物降解），如果細(xì)胞沒(méi)有辦法添補(bǔ)這些空隙，染色體DNA將隨著每一次的細(xì)胞分裂而不斷縮短，直至這種缺隙侵蝕到染色體的結(jié)構(gòu)基因而使細(xì)胞消亡。染色體DNA的末端復(fù)制問(wèn)題：3’5’5’3’RNA引物293’5’5’3’RNA引物水解端粒染色體DNA端粒3’5’5’3’RNA引物水解端粒染色體DNA301)纖毛原蟲(chóng)動(dòng)物四膜蟲(chóng)：其巨核形成過(guò)程中，經(jīng)歷了端粒從無(wú)到有的發(fā)育過(guò)程。2)酵母外源DNA轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞后，在其末端形成新端粒的效率很高。5端粒的研究體系1)纖毛原蟲(chóng)動(dòng)物5端粒的研究體系311）早期的原始復(fù)制模型2）端粒酶模型3）重組模型6端粒的復(fù)制模型1）早期的原始復(fù)制模型2）端粒酶模型6端粒的復(fù)制模型32端粒酶的結(jié)構(gòu)與功能端粒酶的結(jié)構(gòu)與功能33酵母細(xì)胞

酵母細(xì)胞酵母TS四膜蟲(chóng)TSShampay的加尾實(shí)驗(yàn)1端粒酶的發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞酵母細(xì)胞酵母TS四膜蟲(chóng)TSShampay的加尾實(shí)34Blackburn的實(shí)驗(yàn)加熱或蛋白酶孵育四GT酵GTpBR322四CA孵育四膜蟲(chóng)抽提物5’3’Blackburn的實(shí)驗(yàn)加熱或蛋白酶孵育四GT酵GTpB351）端粒的加尾方向是按GT鏈從5’端3’端。2）每次加一個(gè)重復(fù)單位。3）似為無(wú)模板復(fù)制。4）被加尾的末端序列具有特異性。5）催化加尾的應(yīng)是細(xì)胞抽提物中一種具有酶活性的物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)推論：1）端粒的加尾方向是按GT鏈從5’端3’端。實(shí)驗(yàn)推論362端粒酶的結(jié)構(gòu)1987年，Blackburn柱層析RNP結(jié)構(gòu)四膜蟲(chóng)端粒酶RNP含有RNA組分和蛋白質(zhì)組分，兩者均為酶活性所必需。對(duì)RNA酶極為敏感。

RNA組分Protein2端粒酶的結(jié)構(gòu)1987年，Blackburn柱層37CAACCCCAACAACCCCAA端粒酶RNA1）CAACCCCAA結(jié)構(gòu)，有堿基修飾。2）反義RNA封閉，能抑制酶活性。反義RNACAACCCCAACAACCCCAA端粒酶RNA1）CA383）Greider的點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)：點(diǎn)突變端粒酶RNA序列CA3）Greider的點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)：點(diǎn)突變端粒酶RNA序列CA39端粒端粒酶AACTTGCGCAT端粒端粒酶AACTTGCGCAT40CAACAA41端粒酶蛋白質(zhì)1995年，CollinsK等首次從四膜蟲(chóng)克隆到端粒酶蛋白質(zhì)組分：

p80p95端粒酶蛋白質(zhì)1995年，CollinsK等首次從四膜蟲(chóng)42遺傳密碼堿基互補(bǔ)遺傳密碼堿基互補(bǔ)43人類端粒酶蛋白質(zhì)？同源序列核酸探針重組DNA分子人類端粒酶蛋白質(zhì)？同源序列核酸探針重組DNA分子44TTGGGGTTGGGGTTGGGG5’5’TTGGGGTTGGGGTTGGGGCCAACCCC3’5‘oH3’5’CCAACCCC3’5’TTGGGGTTGGGGTTGGGGCCAACCCC2.聚合

1.結(jié)合3.移位

爬行模式3端粒酶的功能TTGGGGTTGGGGCCAACCCCTTGGGGTTGGGGTTGGGG5’5’TTGGGGTT45末端補(bǔ)齊機(jī)制：5‘GGGGTT（GGGGTT）n端粒酶5’G-G配對(duì)回折3‘5’DNA聚合酶末端補(bǔ)齊機(jī)制：5‘GGGGTT（GGGGTT）n端粒酶5’G464端粒酶活性的測(cè)定4端粒酶活性的測(cè)定471994年，Kim首創(chuàng)端粒重復(fù)擴(kuò)增法（TRAP）。1994年，Kim首創(chuàng)端粒重復(fù)擴(kuò)增法（TRAP）。48TRAP的電泳檢測(cè)梯形條帶加樣孔TRAP的電泳檢測(cè)梯形條帶加樣孔49TS引物CX引物細(xì)胞提取物端粒重復(fù)序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物TS引物CX引物細(xì)胞提取物端粒重復(fù)序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物50

T4g32,RnasinTRAPbufferdNTPsextractTSprimerTaqECXprimer23～25℃30minPCR儀T4g32,RnasinTRAPbufferdN51端粒、端粒酶與細(xì)胞衰老端粒、端粒酶與細(xì)胞衰老52染色體端粒端粒端粒與細(xì)胞存亡密切相關(guān)染色體端粒端粒端粒與細(xì)胞存亡密切相關(guān)53細(xì)胞分裂細(xì)胞分裂端粒長(zhǎng)短與細(xì)胞生命歷程密切相關(guān)染色體端粒端粒細(xì)胞將停止分裂而趨于老化細(xì)胞分裂細(xì)胞分裂端粒長(zhǎng)短與細(xì)胞生命歷程密切相關(guān)染色體端粒端粒541）培養(yǎng)細(xì)胞：

端粒長(zhǎng)度隨分裂次數(shù)增多而縮短。端粒長(zhǎng)度和細(xì)胞分化程度呈反比。2）人體：

端粒平均長(zhǎng)度隨年齡增大而變短。體細(xì)胞端粒長(zhǎng)度大大短于生殖細(xì)胞。相關(guān)實(shí)驗(yàn)證據(jù)1）培養(yǎng)細(xì)胞：相關(guān)實(shí)驗(yàn)證據(jù)55端粒酶與細(xì)胞存亡端粒酶端粒端粒酶催化端粒不斷延長(zhǎng)，從而抵消因染色體復(fù)制、細(xì)胞分裂導(dǎo)致的DNA縮短，使得染色體DNA完好無(wú)損，細(xì)胞能夠順利地分裂繁殖。端粒酶與細(xì)胞存亡端粒酶端粒端粒酶催化端粒不斷延長(zhǎng)，從而抵56相關(guān)實(shí)驗(yàn)證據(jù)：1）四膜蟲(chóng)：

端粒酶改變時(shí)端?？s短、細(xì)胞死亡。2）酵母：端粒酶基因突變導(dǎo)致端粒變短、細(xì)胞衰老。相關(guān)實(shí)驗(yàn)證據(jù)：1）四膜蟲(chóng)：57

正常人體細(xì)胞缺乏端粒酶活性。與其他有端粒酶活性的生物體細(xì)胞相比,人體細(xì)胞具有很長(zhǎng)的端粒。人的胚胎細(xì)胞具有明顯可探測(cè)的端粒酶活性。人的端粒與端粒酶正常人體細(xì)胞缺乏端粒酶活性。與其他有端粒酶活性的生58端粒染色體DNA端粒端粒酶端粒酶胚胎期端粒染色體DNA端粒端59“人體細(xì)胞中端粒酶合成和延長(zhǎng)端粒的作用是在胚系細(xì)胞中完成的，當(dāng)胚胎發(fā)育完成以后，端粒酶活性就被抑制。即在胚胎發(fā)育時(shí)期獲得的端粒，應(yīng)已足夠維系人體的整個(gè)生命過(guò)程中因細(xì)胞分裂所致的端?？s短。所以，當(dāng)人體出生以后，染色體端粒就象是一個(gè)伴隨著細(xì)胞分裂繁殖的“生命之鐘”，它歷數(shù)著細(xì)胞可分裂的次數(shù)同時(shí)也見(jiàn)證了細(xì)胞由旺盛地生長(zhǎng)繁殖到走向衰老死亡的整個(gè)生命歷程?！薄叭梭w細(xì)胞中端粒酶合成和延長(zhǎng)端粒的作用是在胚系細(xì)胞中完成60

正常細(xì)胞：細(xì)胞分裂細(xì)胞分裂

衰老死亡

細(xì)胞年輕化

端粒酶重新引入抗衰老正常細(xì)胞：細(xì)胞分裂細(xì)胞分裂衰老死61端粒、端粒酶與惡性腫瘤端粒、端粒酶與惡性腫瘤62細(xì)胞分裂細(xì)胞分裂細(xì)胞衰老端粒酶永生化抗腫瘤靶點(diǎn)細(xì)胞分裂細(xì)胞分裂細(xì)胞衰老端粒酶永生化抗腫瘤靶點(diǎn)63

1端粒酶活性特異表達(dá)于惡性細(xì)胞TRAP（-）TRAP（-）

正常細(xì)胞

良性腫瘤

惡性腫瘤1994年，Kim創(chuàng)立“TRAP”法檢測(cè)端粒酶活性。1端粒酶活性特異表達(dá)于惡性細(xì)胞TRAP（-）TRAP642端粒酶特異性表達(dá)于惡性細(xì)胞的成因解釋性研究：衰老死亡誘導(dǎo)蛋白端粒極度縮短，細(xì)胞死亡細(xì)胞永生化2端粒酶特異性表達(dá)于惡性細(xì)胞的成因解釋性研究：衰老死亡65P53基因、Rb基因介導(dǎo)細(xì)胞衰老P53基因、Rb基因突變細(xì)胞繼續(xù)分裂至“危象期”大量細(xì)胞死亡少量細(xì)胞“永生化”（端粒酶活化）（端?？s短）P53基因、Rb基因介導(dǎo)細(xì)胞衰老P53基因、Rb基因突變細(xì)胞663端粒酶抑制劑-抗癌治療的新靶點(diǎn)1）端粒酶靶點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)A特異性：B廣譜性：存在于各類惡性腫瘤細(xì)胞中

85%以上的惡性細(xì)胞中TRAP（+）正常細(xì)胞癌細(xì)胞3端粒酶抑制劑-抗癌治療的新靶點(diǎn)1）端粒酶靶點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)B672）抗癌策略反義核酸突變RNA的引入端粒酶蛋白抑制劑端粒酶生物學(xué)抑制劑2）抗癌策略反義核酸突變RNA的引入端粒酶蛋白抑制劑端粒酶68A針對(duì)人端粒酶RNA組分反義核酸核酶突變RNA的引入A針對(duì)人端粒酶RNA組分反義核酸核酶突變RNA的引入69B針對(duì)端粒酶蛋白質(zhì)

HTERTTP1同源序列分析P230-240p1271300KuB針對(duì)端粒酶蛋白質(zhì)HTERT70謝謝！61、奢侈是舒適的，否則就不是奢侈?！狢ocoChanel

62、少而好學(xué)，如日出之陽(yáng)；壯而好學(xué)，如日中之光；志而好學(xué)，如炳燭之光?！?jiǎng)⑾?/p>

63、三軍可奪帥也，匹夫不可奪志也?！浊?/p>

64、人生就是學(xué)校。在那里，與其說(shuō)好的教師是幸福，不如說(shuō)好的教師是不幸。——海貝爾

65、接受挑戰(zhàn)，就可以享受勝利的喜悅?！芗{勒爾·喬治·S·巴頓謝謝！61、奢侈是舒適的，否則就不是奢侈?！狢ocoCha71周俊宜中山醫(yī)科大學(xué)生化教研室服從真理，就能征服一切事物周俊宜中山醫(yī)科大學(xué)生化教研室周俊宜中山醫(yī)科大學(xué)生化教研室服從真理，就能征服一切事物周俊宜中山醫(yī)科大學(xué)生化教研室與細(xì)胞衰老和癌變周俊宜基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化教研室端粒、端粒酶概論周俊宜中山醫(yī)科大學(xué)生化教研室服從真理，就能征服一切事物周俊宜72生化教研室課件73生化教研室課件74生化教研室課件75生化教研室課件76DNA決定蛋白質(zhì)的功能

將基因信息代代相傳復(fù)制轉(zhuǎn)錄和翻譯生命活動(dòng)的執(zhí)行者生命延續(xù)的物質(zhì)基礎(chǔ)DNA決定蛋白質(zhì)的功能將基因信息代代相傳復(fù)制轉(zhuǎn)775’5’端粒消耗端粒維持細(xì)胞衰老細(xì)胞永生化染色體DNA端粒端粒5’5’端粒消耗端粒維持細(xì)胞衰老細(xì)胞永生化染色體DNA端粒端78

七十年代：端粒分子組成確定

八十年代：端粒酶的發(fā)現(xiàn)

九十年代：端粒酶與細(xì)胞衰老和癌癥

三十年代：端粒概念首次提出研究概況

79“端粒和端粒酶的研究歷程就象不斷伸縮的端粒本身變幻無(wú)窮，并且不時(shí)帶給人們某些驚訝。從三十年代端粒概念首次提出，一直到今天活躍在惡性細(xì)胞中的端粒酶研究熱潮的興起，人們眼中的端粒和端粒酶已不僅僅限于它們所形成的染色體的‘保護(hù)帽’，它還顯現(xiàn)出更加意味深長(zhǎng)的內(nèi)涵……”“端粒和端粒酶的研究歷程就象不斷伸縮的端粒本身變幻80“人體的正常細(xì)胞經(jīng)過(guò)有限的分裂次數(shù)后即進(jìn)入衰老階段，停止增殖而最終走向衰亡。呈惡性生長(zhǎng)的癌細(xì)胞似乎擺脫了正常衰老過(guò)程的約束，在無(wú)拘無(wú)束地高速生長(zhǎng)中獲得“永生”。衰老和腫瘤相互對(duì)立卻又同為人類的“天敵”，兩者之間千絲萬(wàn)縷的關(guān)聯(lián)一直以來(lái)為人們所關(guān)注。

近年來(lái)端粒酶熱點(diǎn)的出現(xiàn)被認(rèn)為是聯(lián)結(jié)著腫瘤和衰老研究的一條全新紐帶，國(guó)際權(quán)威期刊Cell、Science等逐年遞增地刊載相關(guān)論文和報(bào)道，對(duì)端粒和端粒酶這一研究方向予以相當(dāng)關(guān)注，認(rèn)為有可能對(duì)腫瘤、衰老等重大生命課題產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響?！薄叭梭w的正常細(xì)胞經(jīng)過(guò)有限的分裂次數(shù)后即進(jìn)入衰老階段，81主要內(nèi)容端粒的結(jié)構(gòu)與功能端粒酶的結(jié)構(gòu)與功能端粒、端粒酶與細(xì)胞衰老端粒、端粒酶與惡性腫瘤主要內(nèi)容端粒的結(jié)構(gòu)與功能82端粒的結(jié)構(gòu)與功能端粒的結(jié)構(gòu)與功能83二十世紀(jì)三十年代，兩位著名的遺傳學(xué)家BarbavaMcClintock和HermannJ.Muller發(fā)現(xiàn)，染色體的末端有一種能穩(wěn)定染色體結(jié)構(gòu)和功能的特殊成分。如果缺少了這種成分，染色體之間就會(huì)互相粘連、出現(xiàn)結(jié)構(gòu)的變化或其它錯(cuò)誤的行為，以致影響到染色體的生存和正確復(fù)制并進(jìn)一步威脅到細(xì)胞的存亡。于是Muller從希臘文的"末端"（telos）和"部分"（meros）二詞為這種特殊的成分創(chuàng)造了一個(gè)全新的術(shù)語(yǔ)"端粒"（telomere）。1端粒的發(fā)現(xiàn)二十世紀(jì)三十年代，兩位著名的遺傳學(xué)家Barbava84斷端降解、斷端融合、結(jié)構(gòu)功能破壞染色體DNAX射線斷端降解、斷端融合、結(jié)構(gòu)功能破壞染色體DNAX射線85從希臘字的末端“telos”和部分“meros”創(chuàng)造了一個(gè)全新的單詞：端?！猼elomere

端粒帽染色體

端粒帽從希臘字的末端“telos”和部分“meros”創(chuàng)造了一個(gè)全86端粒的精確組成則是在七十年代末才首次被提出。1978年，美國(guó)科學(xué)家Blackburn和JosephG.Gall發(fā)現(xiàn)，單細(xì)胞池塘生物四膜蟲(chóng)（Tetrahymena）的端粒是由一種極短的簡(jiǎn)單重復(fù)序列TTGGGG多次重復(fù)而成。從那以后，包括動(dòng)物、植物和微生物在內(nèi)的多種生物的端粒序列已被確定，它們均是由富含G和T的簡(jiǎn)單重復(fù)序列不斷重復(fù)而成。正是這些連接在染色體末端的核苷酸重復(fù)序列和結(jié)合在其上的一些蛋白質(zhì)共同構(gòu)成了真核生物染色體的“末端保護(hù)帽”

。2端粒的精確組成端粒的精確組成則是在七十年代末才首次被提出。1978年，871978年首次發(fā)現(xiàn)四膜蟲(chóng)端粒的分子組成：

端粒染色體DNA端粒n（CCCCAA）n（GGGGTT）3’5’（TTGGGG）n（AACCCC）nn（CCCTAA）n（GGGATT）3’5’（TTAGGG）n（AATCCC）n人端粒的分子組成：1978年首次發(fā)現(xiàn)四膜蟲(chóng)端粒的分子組成：端粒88端粒末端回折結(jié)構(gòu)5‘3‘重復(fù)的GGGGTT鏈重復(fù)的CCCCAA鏈5’-CCCCAAOHCCCAACCCCAACCCCAAOHCCCAA-----3’3’-GGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTT-------5’端粒染色體DNA端粒端粒末端回折結(jié)構(gòu)5‘3‘重復(fù)的GGGGTT鏈重復(fù)的CCCCA891)GT鏈的5’3’總是指向染色體的末端。2)重復(fù)次數(shù)不保守。3)鏈區(qū)內(nèi)有缺口即游離的3’-端羥基存在。4)DNA的最末端不能進(jìn)行末端標(biāo)記，推測(cè)其分子是一個(gè)回折結(jié)構(gòu)。端粒結(jié)構(gòu)的特征：1)GT鏈的5’3’總是指向染色體的末端。端粒結(jié)90n（CCCTAA）n（GGGATT）3’5’（TTAGGG）n（AATCCC）n3’5’n（CCCTAA）n（GGGATT）3’5’（TTAGGG）91生化教研室課件92DNA聚合酶Ⅰ-32P-dNTP端粒DNA缺口平移DNA聚合酶Ⅰ-32P-dNTP端粒DNA缺口平移935’-CCCCAAOHCCCAACCCCAACCCCAAOHCCCAA-----3’3’-GGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTT-------5’DNA聚合酶Ⅰ5‘3’聚合酶5‘3’外切酶5’5’5’-CCCCAAOHCCCAACCCCAACCCCAAOH945’-CCCCAACCC……3’-GTTGGG……末端標(biāo)記物-32P-dNTP5’-CCCCAACCC……3’-GGGGTTGGG……5’-CCCCAACCC……末端標(biāo)記物-32P-dNTP595

端粒帽染色體DNA端粒帽n（CCCCAA）（TTGGGG）nn（GGGGTT）（AACCCC）n3’5’3端粒結(jié)合蛋白保護(hù)端粒不受核酸酶或化學(xué)修飾的作用一般是緊密的非共價(jià)鍵結(jié)合端粒帽染色體DNA端粒帽n96人類纖毛蟲(chóng)類人類纖毛蟲(chóng)類97

隨著對(duì)端粒分子組成結(jié)構(gòu)的闡明，端粒對(duì)維護(hù)染色體完整性的功能已不是一個(gè)籠統(tǒng)的概念。活躍在細(xì)胞中樞并當(dāng)擔(dān)著延續(xù)生命重任的染色體DNA其實(shí)面臨的是一個(gè)“危機(jī)四伏”的境界，它對(duì)外要抵御核酸酶等各種因素襲擊，對(duì)內(nèi)則有一個(gè)難以“自圓其身”的所謂“末端復(fù)制問(wèn)題”。端粒的存在正是扮演了一個(gè)衛(wèi)士的角色，它就象是一個(gè)盡忠職守的“生命衛(wèi)士”，不但避免了外界因素的入侵，而且在復(fù)制過(guò)程中，把基因組序列包裹在內(nèi)部，以犧牲自身而避免染色體結(jié)構(gòu)基因被侵蝕，從而防止了遺傳信息的丟失，維護(hù)了染色體結(jié)構(gòu)和功能的完整性。4端粒的功能隨著對(duì)端粒分子組成結(jié)構(gòu)的闡明，端粒對(duì)維護(hù)染色體98

對(duì)外:抵御核酸酶等外界對(duì)內(nèi):染色體DNA的因素的襲擊末端復(fù)制問(wèn)題保護(hù)染色體結(jié)構(gòu)和功能的完整性染色體對(duì)外:抵御核酸酶等外界對(duì)內(nèi):染色體DNA的99染色體DNA的末端復(fù)制問(wèn)題：3’5’5’3’RNA引物3’3’RNA引物水解即DNA復(fù)制過(guò)程不能"自始至終"完整地復(fù)制整個(gè)線性染色體，而是每次都在其5'末端留下一個(gè)空缺未能填補(bǔ)（即RNA引物降解），如果細(xì)胞沒(méi)有辦法添補(bǔ)這些空隙，染色體DNA將隨著每一次的細(xì)胞分裂而不斷縮短，直至這種缺隙侵蝕到染色體的結(jié)構(gòu)基因而使細(xì)胞消亡。染色體DNA的末端復(fù)制問(wèn)題：3’5’5’3’RNA引物1003’5’5’3’RNA引物水解端粒染色體DNA端粒3’5’5’3’RNA引物水解端粒染色體DNA1011)纖毛原蟲(chóng)動(dòng)物四膜蟲(chóng)：其巨核形成過(guò)程中，經(jīng)歷了端粒從無(wú)到有的發(fā)育過(guò)程。2)酵母外源DNA轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞后，在其末端形成新端粒的效率很高。5端粒的研究體系1)纖毛原蟲(chóng)動(dòng)物5端粒的研究體系1021）早期的原始復(fù)制模型2）端粒酶模型3）重組模型6端粒的復(fù)制模型1）早期的原始復(fù)制模型2）端粒酶模型6端粒的復(fù)制模型103端粒酶的結(jié)構(gòu)與功能端粒酶的結(jié)構(gòu)與功能104酵母細(xì)胞

酵母細(xì)胞酵母TS四膜蟲(chóng)TSShampay的加尾實(shí)驗(yàn)1端粒酶的發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞酵母細(xì)胞酵母TS四膜蟲(chóng)TSShampay的加尾實(shí)105Blackburn的實(shí)驗(yàn)加熱或蛋白酶孵育四GT酵GTpBR322四CA孵育四膜蟲(chóng)抽提物5’3’Blackburn的實(shí)驗(yàn)加熱或蛋白酶孵育四GT酵GTpB1061）端粒的加尾方向是按GT鏈從5’端3’端。2）每次加一個(gè)重復(fù)單位。3）似為無(wú)模板復(fù)制。4）被加尾的末端序列具有特異性。5）催化加尾的應(yīng)是細(xì)胞抽提物中一種具有酶活性的物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)推論：1）端粒的加尾方向是按GT鏈從5’端3’端。實(shí)驗(yàn)推論1072端粒酶的結(jié)構(gòu)1987年，Blackburn柱層析RNP結(jié)構(gòu)四膜蟲(chóng)端粒酶RNP含有RNA組分和蛋白質(zhì)組分，兩者均為酶活性所必需。對(duì)RNA酶極為敏感。

RNA組分Protein2端粒酶的結(jié)構(gòu)1987年，Blackburn柱層108CAACCCCAACAACCCCAA端粒酶RNA1）CAACCCCAA結(jié)構(gòu)，有堿基修飾。2）反義RNA封閉，能抑制酶活性。反義RNACAACCCCAACAACCCCAA端粒酶RNA1）CA1093）Greider的點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)：點(diǎn)突變端粒酶RNA序列CA3）Greider的點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)：點(diǎn)突變端粒酶RNA序列CA110端粒端粒酶AACTTGCGCAT端粒端粒酶AACTTGCGCAT111CAACAA112端粒酶蛋白質(zhì)1995年，CollinsK等首次從四膜蟲(chóng)克隆到端粒酶蛋白質(zhì)組分：

p80p95端粒酶蛋白質(zhì)1995年，CollinsK等首次從四膜蟲(chóng)113遺傳密碼堿基互補(bǔ)遺傳密碼堿基互補(bǔ)114人類端粒酶蛋白質(zhì)？同源序列核酸探針重組DNA分子人類端粒酶蛋白質(zhì)？同源序列核酸探針重組DNA分子115TTGGGGTTGGGGTTGGGG5’5’TTGGGGTTGGGGTTGGGGCCAACCCC3’5‘oH3’5’CCAACCCC3’5’TTGGGGTTGGGGTTGGGGCCAACCCC2.聚合

1.結(jié)合3.移位

爬行模式3端粒酶的功能TTGGGGTTGGGGCCAACCCCTTGGGGTTGGGGTTGGGG5’5’TTGGGGTT116末端補(bǔ)齊機(jī)制：5‘GGGGTT（GGGGTT）n端粒酶5’G-G配對(duì)回折3‘5’DNA聚合酶末端補(bǔ)齊機(jī)制：5‘GGGGTT（GGGGTT）n端粒酶5’G1174端粒酶活性的測(cè)定4端粒酶活性的測(cè)定1181994年，Kim首創(chuàng)端粒重復(fù)擴(kuò)增法（TRAP）。1994年，Kim首創(chuàng)端粒重復(fù)擴(kuò)增法（TRAP）。119TRAP的電泳檢測(cè)梯形條帶加樣孔TRAP的電泳檢測(cè)梯形條帶加樣孔120TS引物CX引物細(xì)胞提取物端粒重復(fù)序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物TS引物CX引物細(xì)胞提取物端粒重復(fù)序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物121

T4g32,RnasinTRAPbufferdNTPsextractTSprimerTaqECXprimer23～25℃30minPCR儀T4g32,RnasinTRAPbufferdN122端粒、端粒酶與細(xì)胞衰老端粒、端粒酶與細(xì)胞衰老123染色體端粒端粒端粒與細(xì)胞存亡密切相關(guān)染色體端粒端粒端粒與細(xì)胞存亡密切相關(guān)124細(xì)胞分裂細(xì)胞分裂端粒長(zhǎng)短與細(xì)胞生命歷程密切相關(guān)染色體端粒端粒細(xì)胞將停止分裂而趨于老化細(xì)胞分裂細(xì)胞分裂端粒長(zhǎng)短與細(xì)胞生命歷程密切相關(guān)染色體端粒端粒1251）培養(yǎng)細(xì)胞：

端粒長(zhǎng)度隨分裂次數(shù)增多而縮短。端粒長(zhǎng)度和細(xì)胞分化程度呈反比。2）人體：

端粒平均長(zhǎng)度隨年齡增大而變短。體細(xì)胞端粒長(zhǎng)度大大短于生殖細(xì)胞。相關(guān)實(shí)驗(yàn)證據(jù)1）培養(yǎng)細(xì)胞：相關(guān)實(shí)驗(yàn)證據(jù)126端粒酶與細(xì)胞存亡端粒酶端粒端粒酶催化端粒不斷延長(zhǎng)，從而抵消因染色體復(fù)制、細(xì)胞分裂導(dǎo)致的DNA縮短，使得染色體DNA完好無(wú)損，細(xì)胞能夠順利地分裂繁殖。端粒酶與細(xì)胞存亡端粒酶端粒端粒酶催化端粒不斷延長(zhǎng)，從而抵127相關(guān)實(shí)驗(yàn)證據(jù)：1）四膜蟲(chóng)：

端粒酶改變時(shí)端?？s短、細(xì)胞死亡。2）酵母：端粒酶基因突變導(dǎo)致端粒變短、細(xì)胞衰老。相關(guān)實(shí)驗(yàn)證據(jù)：1）四膜蟲(chóng)：128

正常人體細(xì)胞缺乏端粒酶活性。與其他有端粒酶活性的生物體細(xì)胞相比,人體細(xì)胞具有很長(zhǎng)的端粒。人的胚胎細(xì)胞具有明顯可探測(cè)的端粒酶活性。人的端粒與端粒酶