HIV樣品的采集和處理

皮膚性病防治中心1主要內(nèi)容1各種檢測的基本知識2樣品采集的種類3操作步驟4影響因素2基本知識

HIV檢測方法

抗體檢測、抗原檢測、核酸檢測、耐藥檢測、CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞測定、HIV分離培養(yǎng)

樣品的種類

全血、血清、血漿、細(xì)胞、唾液、尿液、濾紙干血斑

支持性文件:《全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范》(2009)、《艾滋病病毒感染者及艾滋病患者CD4+T淋巴細(xì)胞檢測質(zhì)量保證指南》(2006)、《HIV-1病毒載量測定及質(zhì)量保證指南》(2008)、《可感染人類的高致病性病原微生物菌(毒)種或樣本運(yùn)輸管理規(guī)定》(衛(wèi)生部45號令，2006)3樣品種類

HIV抗體檢測：全血、血清、血漿、唾液、尿液、DBS

CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞測定：抗凝全血

病毒載量檢測：血漿

耐藥、基因型檢測：血漿、DBS核酸定性檢測：全血、血漿、淋巴細(xì)胞、DBS分離培養(yǎng)：全血、淋巴細(xì)胞5抗病毒治療的目標(biāo)病毒學(xué)目標(biāo)：最大程度地減少病毒載量，將其維持在不可檢測水平的時間越長越好免疫學(xué)目標(biāo)：維持免疫功能，獲得免疫功能重建和/或部分免疫重建終極目標(biāo)：延長生命并提高生活質(zhì)量6病毒載量與CD4+T計數(shù)

HIVinfectionJ.Coffin,XIInternationalConf.onAIDS,Vancouver,1996AIDS病程：一列迫近懸崖的列車病毒載量=火車的速度CD4+T計數(shù)=離懸崖的距離抗病毒治療：制動火車的外力7病毒載量與CD4+T計數(shù)8HAART的目標(biāo)UltimateGoalofHAARTRelativeLevelsMonthsYearsAfterHIVInfectionCD4+T-cellsPlasmaHIVViremiaAcuteHIVinfectionSymptomLimitofdetection10病毒載量檢測的意義急性HIV感染，窗口期復(fù)制高峰每毫升血液RNA拷貝可達(dá)9×107，一年以后仍然可達(dá)2-4×104判定病人疾病的進(jìn)程和進(jìn)展。血漿中病毒水平是病毒增殖和免疫清除機(jī)制共同作用的結(jié)果，CD4+T細(xì)胞越少顯示病毒載量水平越高12HIV-1病毒載量檢測方法病毒載量檢測主要有三種方法：bDNA、RT-PCR及NASBANASBA檢測是通過核酸釋放、提取、核酸擴(kuò)增(NASBA擴(kuò)增)及核酸檢測來完成對血漿中HIV病毒RNA的定量測定生物梅里埃公司將NASBA核酸擴(kuò)增技術(shù)與實(shí)驗(yàn)時(real-time)檢測技術(shù)結(jié)合起來，“分子信標(biāo)實(shí)時擴(kuò)增檢測技術(shù)”，能夠?qū)z測進(jìn)行實(shí)時監(jiān)控，即稱為“EasyQ”14病毒載量檢測樣品采集運(yùn)輸保存HIV-1，血漿樣品EDTA抗凝真空無菌采血管全血5ml或3ml*2,采集的樣品量應(yīng)盡可能與定量采血管的刻度一致，采集量過多或不足，會造成血液凝固或被稀釋。采集血液后，立即輕輕上下顛倒抗凝管約10次，使血液與抗凝劑充分混勻，避免劇烈振蕩導(dǎo)致溶血15病毒載量檢測樣品采集運(yùn)輸保存務(wù)必在采集全血的4小時內(nèi)分離血漿，室溫下1500-3000r/min離心15分鐘送檢血漿2管，每管>1ml，冷凍(藏)運(yùn)輸血漿樣本3天內(nèi)送檢可在2-8℃暫時保存，1個月以內(nèi)應(yīng)凍存于-20℃以下，1年以內(nèi)應(yīng)置于-70℃以下血漿樣品凍融不應(yīng)超過3次16病毒載量檢測結(jié)果的解釋單位：copies/ml檢測限：20cps/ml(0.5ml)；10cps/ml(1ml);100cps/ml(0.1ml)結(jié)果舉例：

＜20copies/ml(檢測到HIV核酸，但是低于方法檢測下限，無法定量)TND(未檢出，使用現(xiàn)有的檢測方法對本次樣本未檢測到HIV核酸)17樣品處理對病毒載量結(jié)果的影響一般地講，血漿中病毒載量水平比血清中的要高出30％～80％用EDTA抗凝劑的采血管采集全血后分離血漿樣本，其HIVRNA含量比ACD和肝素抗凝管相應(yīng)含量多10％～15％及20％～25％18樣品處理對病毒載量結(jié)果的影響血漿樣本在-20℃冰柜保存3-14個月，與起始病毒載量水平值(0月)相比，3個月時變化沒有顯著性差異；6個月后下降值明顯，有隨著保存時間延長病毒載量水平下降幅度越大的趨勢。在-20℃冰柜內(nèi)保存6個月，樣本病毒載量水平已不能真實(shí)反映樣本采集之初的水平，對疾病進(jìn)展和療效評價，尤其對回顧性研究已無指導(dǎo)意義。20樣品處理對病毒載量結(jié)果的影響-20℃條件下凍融3次比凍融1次HIVRNA降低約20％。許多研究者用多種檢測方法和不同人群樣本的研究結(jié)果證實(shí)，技術(shù)和生物因素對樣本RNA水平的影響是持續(xù)的和可預(yù)測的，大約在0.3-0.6log/ml之間。21CD4+T淋巴細(xì)胞測定準(zhǔn)確及時地對殘留CD4細(xì)胞計數(shù)，不僅是評價性試驗(yàn)，也是對存活的HIV感染者實(shí)施治療與關(guān)懷的一部分CD4細(xì)胞減少與機(jī)會感染增加和病情發(fā)展相聯(lián)系

CD4細(xì)胞計數(shù)為HIV感染臨床分期、疾病進(jìn)展監(jiān)測、機(jī)會性感染的風(fēng)險評估、抗病毒治療適應(yīng)癥選擇及療效評價的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)23流式細(xì)胞術(shù)(FCM)FCM是以流式細(xì)胞儀為檢測手段的一項(xiàng)能快速、精確的對單個細(xì)胞理化特性進(jìn)行多參數(shù)定量分析和分選的技術(shù)。FALSSensorLaser24CD4+T淋巴細(xì)胞測定的方法CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞計數(shù)的方法分為兩大類，一類是應(yīng)用流式細(xì)胞儀測定法，另一類是非流式細(xì)胞儀測定法常用的淋巴細(xì)胞計數(shù)檢測方法為自動檢測方法，包括流式細(xì)胞儀（主要有多平臺法和單平臺法）和專門的細(xì)胞計數(shù)儀26雙平臺法雙平臺方法是一種細(xì)胞群體的絕對計數(shù)方法，利用血球計數(shù)儀檢測淋巴細(xì)胞數(shù)量，再根據(jù)流式細(xì)胞儀得到的細(xì)胞群體百分比，計算得到每微升的淋巴細(xì)胞數(shù)量。雙平臺法需要兩種儀器，由于儀器有系統(tǒng)誤差，計算結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性影響因素較多，導(dǎo)致不同實(shí)驗(yàn)室計數(shù)結(jié)果差異很大。最大的缺點(diǎn)在于操作步驟復(fù)雜，操作人員多、費(fèi)時，因此很難將變異水平減小到最低。27單平臺法應(yīng)用三色、四色流式試劑配以內(nèi)參絕對計數(shù)微球，加上流式細(xì)胞儀淋巴細(xì)胞亞群獲取和分析軟件，一步即可獲得T細(xì)胞亞群的相對數(shù)(百分比)和絕對數(shù)。單平臺法最大程度地減少了多個儀器檢測帶來的檢測誤差，細(xì)胞絕對計數(shù)結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性都得到了良好的保證。28CD4細(xì)胞計數(shù)樣品的采集運(yùn)輸采血時間：鑒于CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)日間自然變化的個體差異，每一病人采樣時間應(yīng)盡可能集中在某個相同的時段運(yùn)輸條件：37℃以上的溫度會破壞細(xì)胞，使血液學(xué)和流式儀的檢測結(jié)果受到影響。因此應(yīng)在室溫(18-25℃)保存和運(yùn)輸樣品，避免極端溫度(結(jié)冰或大于37℃)。高溫季節(jié)，需用隔熱容器盛裝樣品，并將其置于有冰袋和吸熱物質(zhì)的容器中樣品應(yīng)存放于室溫，不得冰凍保存，并且在24小時之內(nèi)送達(dá)檢測實(shí)驗(yàn)室30CD4細(xì)胞計數(shù)結(jié)果解釋CD4+T淋巴細(xì)胞是T輔助淋巴細(xì)胞。報告該值的正確細(xì)胞是CD3和CD4全部雙陽性的細(xì)胞絕對計數(shù)和百分比。CD45陽性細(xì)胞是所有白細(xì)胞的計數(shù)。結(jié)果報告單中附有參考范圍(例如，CD4+T淋巴細(xì)胞絕對數(shù)和百分?jǐn)?shù))。31CD4細(xì)胞計數(shù)的影響因素CD4+T淋巴細(xì)胞水平會受到一些因素的影響，采血前應(yīng)了解患者的狀況。服用腎上腺皮質(zhì)激素，急性病毒感染以及術(shù)后病人等均不宜采血。影響因素影響結(jié)果Zidovudine(AZT)使細(xì)胞易碎性增加使紅細(xì)胞對裂解試劑的敏感性降低散射光變暗(粒細(xì)胞和RBC污染淋巴細(xì)胞門)一些抗菌素(如頭孢菌素cephalosporins)使細(xì)胞的自身熒光增強(qiáng)增強(qiáng)自身熒光皮質(zhì)醇類Corticosteroids降低CD4+T淋巴細(xì)胞水平降低CD4+T淋巴細(xì)胞百分率和絕對值強(qiáng)烈的鍛煉降低淋巴細(xì)胞數(shù)降低淋巴細(xì)胞亞群絕對數(shù)每天的變化淋巴細(xì)胞絕對值的改變淋巴細(xì)胞亞群絕對數(shù)變化32檢測項(xiàng)目樣品類型抗凝劑采血量離心處理運(yùn)輸條件保存時限病毒載量血漿(>2ml)K2EDTA5ml