?短篇論著?持續(xù)高尿酸血癥對大鼠血管內(nèi)皮細胞功能影響的實驗研究黃修獻吳新華李利華賴敏楊瑛【摘要】目的探討持續(xù)高尿酸血癥對大鼠血管內(nèi)皮細胞功能的影響。方法SD雄性大鼠２０只，持續(xù)１２d給予氧嗪酸鉀（７５０mg?kg－１?d－１）灌胃，建立高尿酸血癥模型。分次在灌胃前以及第４、８和１２天通過大鼠眼球后靜脈叢取血，測定血尿酸和一氧化氮水平。第１２天取血后處死大鼠并留取腹主動脈和腎臟標(biāo)本行HE染色觀察尿酸鹽沉積。測量值采用自身配對ｔ檢驗分析。結(jié)果灌胃第４天大鼠血尿酸升高，與基線血尿酸水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Ｐ＜０暢０５）。第８天，大鼠血尿酸較第４天下降，但仍比基線血尿酸的均值高。第１２天血尿酸水平又上升，與基線血尿酸水平比較明顯升高（Ｐ＜０暢０５）。與基線水平比較，灌胃第４、８天一氧化氮水平呈下降趨勢，第１２天一氧化氮水平下降有統(tǒng)計學(xué)差異（Ｐ＜０暢０５）。腹主動脈和腎臟標(biāo)本均未見尿酸鹽沉積。結(jié)論高尿酸血癥呈時間依賴性對血管內(nèi)皮細胞功能損傷，促進心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。【關(guān)鍵詞】高尿酸血癥；尿酸；一氧化氮；內(nèi)皮，血管；大鼠，Sprague唱Dawley多數(shù)流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）與高血壓病、冠心病、代謝綜合征和糖尿病相關(guān)聯(lián)，但HUA作為心血管疾病獨立危險因素還存在爭議，尚需要進一步研究來證實［１］。通過研究各種心血管危險因素對血管內(nèi)皮細胞功能損傷的機制來探討其對心血管疾病的作用是醫(yī)學(xué)研究的重要途徑。本研究通過建立持續(xù)大鼠HUA模型，動態(tài)檢測血尿酸（u唱ricacid，UA）和一氧化氮（nitricoxide，NO）的水平，探討HUA對大鼠血管內(nèi)皮細胞功能的影響。一、資料與方法１暢動物：SD雄性大鼠，１２周齡，體重（２００±３０）mg，由大理學(xué)院動物實驗中心提供。２暢試劑：氧嗪酸鉀（Oxonicacid），購自德國Biobasicinc公司；NO試劑盒，購自南京建成生物公司；UA試劑盒，購自上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司。３暢HUA動物模型建立：SD雄性大鼠２０只，分籠喂養(yǎng)。適應(yīng)性喂養(yǎng)１周后，１次／d給予氧嗪酸鉀（７５０mg／kg），并按大鼠體重給以生理鹽水（１ml／kg）稀釋灌胃，共１２d。分別在灌胃前、第４天、第８天和第１２天通過吸入異氟烷麻醉大鼠后，經(jīng)大鼠眼球后靜脈叢取血１～１暢５ml。于第１２天取血后處死大鼠并留取腹主動脈和腎臟標(biāo)本。實驗期間動物飲水，飼料喂養(yǎng)均不限，每隔４d稱體重，期間依據(jù)大鼠體重變化調(diào)整氧嗪酸鉀的劑量。４暢血標(biāo)本處理：每次所取血標(biāo)本經(jīng)離心（４５００r／min，５min，離心半徑１２暢３cm），取血清５０μl行血清UA測量。剩余血清裝于EP離心管中，在－２０℃冰箱中保存１個月后集中行NO測定。５暢血UA和NO測定：血UA經(jīng)日立全自動７１８０生化分析儀采用Trinder′s方法測定；血清NO水平經(jīng)７５２型分光光度儀采用硝酸還原酶法測定，按試劑說明書進行操作。６暢腹主動脈和腎臟標(biāo)本病理檢查：標(biāo)本經(jīng)１０％的中性甲醛液固定、脫水和石蠟包埋后，用Leitz切片機連續(xù)切片。經(jīng)HE染色后，分別經(jīng)電子顯微鏡觀察腹主動脈內(nèi)膜、腎小球的病理變化。ｘ±ｓ）表示，測量值采用自身配對ｔ檢７暢統(tǒng)計學(xué)分析：應(yīng)用SPSS１５暢０軟件包進行統(tǒng)計分析，計量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（珋驗統(tǒng)計分析。Ｐ＜０暢０５為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。二、結(jié)果１暢大鼠HUA模型的一般情況：實驗期間動物因吸入麻醉過深致呼吸抑制死亡６只，經(jīng)眼球后靜脈叢取血引起感染死亡４只。實驗結(jié)束時，存活動物體重均有增加，同實驗前體重比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。２暢血UA水平的變化：在灌胃第４天后大鼠血UA升高，與基線血UA水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。繼續(xù)灌胃至第８天，大鼠血UA較第４天下降，但仍較基線血UA的均值升高。在灌胃第１２天大鼠血UA水平又上升，分別比基線、第４天和第８天的血UA水平明顯升高（表１）。３暢NO水平的變化：灌胃后NO水平與其基線水平比較呈下降趨勢?；€NO水平與其在第４天和第８天的水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。第１２天NO水平與基線水平比較有統(tǒng)計學(xué)差異（表１）。DOI：１０．３８７７／cma．j．issn．１６７４唱０７８５．２０１１．０１．０４０作者單位：６７１０００云南省，大理學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科（黃修獻、吳新華、李利華、楊瑛）；海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科（賴敏）通訊作者：吳新華，Email：henryhuang＠hotmail．com萬方數(shù)據(jù)表1不同時間血UA及NO水平比較時間（d）例數(shù)UAμmol／L，珋ｘ±ｓＰ值NOμmol／L，珋ｘ±ｓＰ值０１０８５暢７０±３８暢０８－２２暢７２±５暢０６－４１０１５０暢９０±６４暢８４０暢０２２２１暢９２±５暢３６０暢５５１８１０９５暢３０±２７暢３１０暢５５４１５暢０５±８暢４９０暢０７５１２１０１８２暢７０±９２暢４４０暢０１４１３暢８１±６暢５００暢００９注：表中的Ｐ值均是與０d（基線水平）比較所得４暢病理標(biāo)本檢查結(jié)果：腹主動脈和腎臟標(biāo)本HE染色后在光鏡下觀察，分別示腎小球、腎小管、血管內(nèi)膜、中膜和外膜的結(jié)構(gòu)完整。兩者均未見尿酸鹽沉積（圖１，２）。三、討論UA是人體嘌呤代謝的產(chǎn)物，血UA水平升高與體內(nèi)的核酸代謝異常和腎臟排泄減少有關(guān)。NO是在NO合成酶（endothe唱lialnitricoxidesynthase，eNOS）作用下，催化體內(nèi)的左旋精氨酸轉(zhuǎn)變成L唱瓜氨酸而生成。NO主要由血管內(nèi)皮細胞合成，是反映血管內(nèi)皮細胞功能障礙的公認(rèn)指標(biāo)之一，當(dāng)內(nèi)皮細胞功能障礙時釋放NO可減少。多項研究支持血管內(nèi)皮細胞釋放NO減少與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展呈負相關(guān)，改善血管內(nèi)皮細胞的NO水平是心血管疾病治療的靶點［２］。UA對血管內(nèi)皮細胞功能的損傷機制尚未完全闡明。體外細胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，UA可通過內(nèi)皮細胞的氧化應(yīng)激和激活RAS導(dǎo)致人臍靜脈內(nèi)皮細胞功能障礙［３］。Gersch等［４］報道血漿中的UA可直接與NO發(fā)生快速而且不可逆的反應(yīng)，生成氨基尿嘧啶，導(dǎo)致NO下降而損傷血管內(nèi)皮細胞功能。有研究認(rèn)為UA對血管內(nèi)皮細胞功能的損傷是通過氧化應(yīng)激引起的炎癥反應(yīng)［５］。最近有研究報道，UA在體外細胞培養(yǎng)可激活人類T細胞，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)［６］。Khosla等［７］通過建立HUA大鼠模型，發(fā)現(xiàn)血UA增高的同時伴有NO水平減低，但沒有對兩者動態(tài)觀察。本研究動態(tài)觀察UA對血管內(nèi)皮細胞功能的影響。灌胃后大鼠血UA均較基線水平升高，第４天大鼠血UA較基線水平明顯升高，且有統(tǒng)計學(xué)意義，表明HUA模型建立成功。觀察到第８天大鼠的血UA水平較第４天降低，第１２天又上升。Habu等［８］通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腎小管的有機陰離子家族（organicaniontransporter，rOAT）在血UA升高時可代償表達，加強轉(zhuǎn)運血UA到腎小管中，有助于UA排出體外，而且在達到平臺期前，rOAT對UA轉(zhuǎn)運呈劑量和時間依賴性。第８天血UA較第４天下降，筆者推測期間大鼠腎小管的rOAT在達到平臺期之前，隨著血UA的升高而加強對血UA排泄，從而引起血UA較前下降可能。第１２天血UA水平又升高，可能是腎小管的rOAT對血UA轉(zhuǎn)運隨著時間的延長而達到飽和狀態(tài)，血UA排出到腎小管中減少，導(dǎo)致血UA進一步升高。但以上推論缺少測定大鼠尿液中的UA水平等相關(guān)指標(biāo)的證據(jù)，可待以后進一步研究支持。大鼠血清NO水平進行性下降，在第１２天時血清NO水平與基線NO比較有統(tǒng)計學(xué)意義，在第８天大鼠血UA水平較第４天下降，血清NO并沒有相應(yīng)的上升，表明HUA對內(nèi)皮細胞功能損傷呈時間依賴性和持續(xù)性，而且早期并不需要尿酸鹽沉積在血管內(nèi)皮細胞才發(fā)揮損傷作用。這可能有助于解釋W(xué)aring等［９］在健康人群中給予UA造成急性HUA，研究UA對血管內(nèi)皮細胞功能的影響，結(jié)論認(rèn)為UA沒有對血管內(nèi)皮細胞功能發(fā)生損傷作用，其可能原因是其觀察時間不夠長?？傊?，本研究表明HUA呈時間依賴性地對大鼠血管內(nèi)皮細胞功能損傷，而且持續(xù)大鼠HUA模型符合人體HUA的慢性病理狀態(tài)，較可靠地證實HUA對血管內(nèi)皮細胞功能損傷的影響。但研究只初步探討HUA對血管內(nèi)皮細胞功能的損傷作用，對其損傷的分子細胞信號傳導(dǎo)機制尚需深入研究闡明。參考文獻［１］FeigDI，KangDH，JohnsonRJ．Uricacidandcardiovascularrisk．NEnglJMed，２００８，３５９（１７）：１８１１唱１８２１．萬方數(shù)據(jù)［２］NaseemKM．Theroleofnitricoxideincardiovasculardiseases．MolAspectsMed，２００５，２６（１／２）：３３唱６５．［３］YuMA，Sánchez唱LozadaLG，JohnsonRJ，etal．Oxidativestresswithanactivationoftherenin唱angiotensinsysteminhumanvascularendothelialcellsasanovelmechanismofuricacid唱inducedendothelialdysfunction．JHypertens，２０１０，２８（６）：１２３４唱１２４２．［４］GerschC，PaliiSP，KimKM，etal．Inactivationofnitricoxidebyuricacid．NucleosidesNucleotidesNucleicAcids，２００８，２７（８）：９６７唱９７８．［５］CorryDB，TuckML．Uricacidandthevasculature．CurrHypertensRep，２００６，８（２）：１１６唱１１９．［６］WebbR，JeffriesM，SawalhaAH．UricaciddirectlypromoteshumanT唱cellactivation．AmJMedSci，２００９，３３７（１）：２３唱２７．［７］KhoslaUM，ZharikovS，F(xiàn)inchJL，etal．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