重組人紅細(xì)胞生成素治療脊髓沖擊性損傷的實(shí)驗(yàn)研究

作者：王波，姜偉，劉海鷹，陳定寶,鄭姝穎

【摘要】

［目的］研究重組人紅細(xì)胞生成素(recombinanthumanerythropoietin，rhEPO)對(duì)脊髓沖擊性損傷的治療效果。［方法］24只新西蘭白兔采用重物墜落的方法造成脊髓沖擊性損傷。損傷12h后，對(duì)照組靜脈給予生理鹽水；小劑量組、中等劑量組和大劑量組分別靜脈給予rhEPO100、500、1000IU／kg。損傷后24h、48h、1周評(píng)估下肢神經(jīng)功能。損傷后1周時(shí)處死動(dòng)物，脊髓標(biāo)本進(jìn)行HE和Caspase3組化染色，電子顯微鏡評(píng)估超微結(jié)構(gòu)損傷。［結(jié)果］EPO治療組的神經(jīng)功能評(píng)分明顯高于對(duì)照組，HE染色和電子顯微鏡顯示組織和超微結(jié)構(gòu)損傷明顯輕于對(duì)照組，Caspase3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯少于對(duì)照組。中等劑量組和大劑量組的治療效果無(wú)顯著性差異。［結(jié)論］脊髓沖擊性損傷后12h給予人紅細(xì)胞生成素可減輕脊髓的組織和超微結(jié)構(gòu)繼發(fā)性損傷，并可對(duì)抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)脊髓功能恢復(fù)。中等劑量EPO是治療脊髓損傷的適當(dāng)選擇?！娟P(guān)鍵詞】

重組人紅細(xì)胞生成素；脊髓損傷；凋亡；超微結(jié)構(gòu)

脊髓損傷從受傷至經(jīng)檢查明確診斷及開(kāi)始治療，一般需數(shù)小時(shí)甚至更長(zhǎng)時(shí)間。除手術(shù)解除脊髓壓迫外，大劑量甲基強(qiáng)的松龍沖擊是被廣泛應(yīng)用的藥物治療方法，但功能恢復(fù)令人失望，同時(shí)大劑量甲基強(qiáng)的松龍的副作用也不能忽視［1］，探索脊髓損傷新的藥物治療方法是迫切需要解決的問(wèn)題。已證實(shí)紅細(xì)胞生成素是一種具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)作用的細(xì)胞因子，脊髓損傷后即刻給予EPO可減輕脊髓損傷程度［2］，但脊髓損傷后數(shù)小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間后給予EPO的治療效果及EPO的劑量-效應(yīng)關(guān)系分析尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究觀察兔脊髓損傷后12h給予不同劑量重組人紅細(xì)胞生成素(rhEPO)的治療效果。

1

材料和方法1.1

脊髓損傷方法

速眠欣(0.2ml／kg)肌肉注射麻醉，俯臥于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。胸背部正中切開(kāi)，顯露棘突及椎板。切除T8棘突及全椎板，顯露硬膜囊。以20g圓柱狀(直徑3mm)重物通過(guò)導(dǎo)向套管，于脊髓上方4cm垂直落下(80g／cm)，造成脊髓沖擊損傷。關(guān)閉切口，12h后靜脈給予不同藥物治療。每日行人工擠壓排尿3次，直至可自主排尿。1.2

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

新西蘭白兔24只，8～12個(gè)月齡，體重2.2～3.2kg，置于室溫、濕度控制的房間內(nèi)單籠分別飼養(yǎng)。隨機(jī)分為4組，每組6只。(1)對(duì)照組(Control)，脊髓損傷12h后靜脈注射生理鹽水2ml;(2)小劑量EPO組(E100)，脊髓損傷12h后靜脈rhEPO(濟(jì)脈欣，華北制藥金坦科技有限公司，下同)100IU／kg;(3)中等劑量EPO組(E500)，脊髓損傷后12h后靜脈給予rhEPO500IU／kg;(4)大劑量EPO組(E1000)，脊髓損傷12h后靜脈給予rh-EPO1000IU／kg。

麻醉覺(jué)醒后及脊髓損傷后24h、48h、1周采用Drummond，J．C.&Moore標(biāo)準(zhǔn)［3］評(píng)價(jià)下肢運(yùn)動(dòng)機(jī)能。

1.3

HE和Caspase3染色及電子顯微鏡觀察

7d后大劑量速眠欣(0.5ml／kg)麻醉試驗(yàn)動(dòng)物，再次顯露并完整取出脊髓損傷節(jié)段，長(zhǎng)約10mm。以損傷中心為界，將脊髓橫切分成兩半，一半脊髓標(biāo)本進(jìn)行HE染色和Caspase3染色。另一半行電子顯微鏡檢查，觀察超微結(jié)構(gòu)損傷情況。1.4

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包，采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，組間比較采用MannWhitney統(tǒng)計(jì)，以P<0.05為差異具有顯著性。

2

結(jié)果

麻醉清醒后，各實(shí)驗(yàn)組均出現(xiàn)完全性下肢癱瘓癥狀。脊髓損傷24h后各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物神經(jīng)功能開(kāi)始有所恢復(fù)，48h、1周時(shí)神經(jīng)功能進(jìn)一步恢復(fù)，中等劑量(500IU／Kg)和大劑量(1000IU／Kg)EPO治療組神經(jīng)功能評(píng)分明顯優(yōu)于對(duì)照組和小劑量組，大劑量治療組神經(jīng)功能略優(yōu)于中等劑量，但兩者差異無(wú)顯著性(圖2)。

1周后的HE染色顯示：對(duì)照組的脊髓損傷嚴(yán)重，灰質(zhì)變細(xì)、萎縮，神經(jīng)元數(shù)量減少，呈損傷或壞死表現(xiàn)：神經(jīng)元胞漿紅染，尼氏體消失，細(xì)胞核濃縮或消失。后索白質(zhì)有大片囊腔及空洞形成，周?chē)z質(zhì)細(xì)胞增生，單核炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。小劑量EPO治療組脊髓損傷程度減輕，中等劑量和大劑量EPO治療組的神經(jīng)細(xì)胞損傷明顯減輕，偶見(jiàn)胞漿紅染和細(xì)胞核輕度濃縮，無(wú)明顯空泡變性和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。對(duì)照組Caspase3染色顯示灰質(zhì)中許多神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞呈陽(yáng)性染色，給予小劑量rhEPO治療后Caspase3陽(yáng)性染色神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量有所減少，中等劑量和大劑量EPO治療組Caspase3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組具有顯著性差異，中等劑量組與大劑量組Caspase3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)無(wú)顯著性差異(圖3、4)。

電子顯微鏡顯示對(duì)照組細(xì)胞胞漿水腫、細(xì)胞核損傷、軸索變性、髓鞘破壞斷裂和線粒體損傷，EPO治療可顯著減輕脊髓損傷。Kaptanoglu評(píng)分顯示EPO100(P<0.05)、EPO500(P<0.01)和EP01000(P<0.01)顯著低于對(duì)照組的超微結(jié)構(gòu)評(píng)分(圖5、6)。

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討論

脊髓的機(jī)械沖擊暴力可造成原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷。原發(fā)性損傷是暴力即刻引起的組織結(jié)構(gòu)破壞，無(wú)法進(jìn)行有效的干預(yù)。原發(fā)性損傷產(chǎn)生的細(xì)胞碎片和破裂的軸索等可誘導(dǎo)并引起一系列進(jìn)行性生化和代謝變化，導(dǎo)致組織繼發(fā)性損傷，主要是軸索髓鞘破壞、細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。繼發(fā)損傷發(fā)生于傷后數(shù)小時(shí)至數(shù)天，有比較從容的時(shí)機(jī)通過(guò)藥物干預(yù)得到減輕。rhEPO曾被廣泛應(yīng)用于各種原因引起的貧血疾病，具有優(yōu)良的安全性。近年來(lái)許多文獻(xiàn)報(bào)道提出，EPO具有重要的神經(jīng)保護(hù)作用［5］。免疫組化研究表明：正常脊髓組織中存在EPO及其EPO受體表達(dá)，特別是在神經(jīng)元和有髓軸索上表達(dá)更多，損傷后8～48h可見(jiàn)神經(jīng)元和血管內(nèi)皮細(xì)胞EPO及其受體表達(dá)明顯增強(qiáng)［6］。rhEPO雖也是大分子，但已證實(shí)可通過(guò)血脊髓屏障，