第二章獸醫(yī)生物制品的免疫學(xué)基礎(chǔ)【知識目標(biāo)】熟悉免疫學(xué)診斷與檢測的常用技術(shù);理解免疫耐受及免疫應(yīng)答的機制;掌握體液免疫應(yīng)答和細胞免疫應(yīng)答;了解動物早期(胚胎)免疫應(yīng)答機理..第二章獸醫(yī)生物制品的免疫學(xué)基礎(chǔ)【知識目標(biāo)】.1第二章獸醫(yī)生物制品的免疫學(xué)基礎(chǔ)【能力目標(biāo)】能進行血球凝集(HA)與血球凝集抑制(HI)試驗、瓊脂免疫擴散試驗、補體結(jié)合試驗、病毒中和(VN)試驗等操作;能應(yīng)用免疫熒光杭體技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、單克隆抗體技術(shù)、PCR技術(shù)等進行免疫檢測..第二章獸醫(yī)生物制品的免疫學(xué)基礎(chǔ)【能力目標(biāo)】.2第一節(jié)免疫應(yīng)答免疫應(yīng)答是動物機體免疫系統(tǒng)識別各類異物，并將其殺死、降解和排除的過程。其中包括體液免疫應(yīng)答和細胞免疫應(yīng)答兩方面。.第一節(jié)免疫應(yīng)答免疫應(yīng)答是動物機體免疫系統(tǒng)識別各3一、體液免疫應(yīng)答巴斯德發(fā)現(xiàn)用疫苗接種可以預(yù)防某些家畜、家禽的傳染病后，不久便弄清了提供這種抵抗力的物質(zhì)存在于血清之中，并證明、應(yīng)用接種過疫苗的動物血清可以將這種抵抗力被動地傳遞給未接種的動物.如用經(jīng)過疫苗接種而對破傷風(fēng)毒素產(chǎn)生了抵抗力。.一、體液免疫應(yīng)答巴斯德發(fā)現(xiàn)用疫苗接種可以預(yù)防某4一、體液免疫應(yīng)答動物機體初次和再次接觸抗原后，引起體內(nèi)抗體產(chǎn)生的種類、抗體水平等均有差異。.一、體液免疫應(yīng)答動物機體初次和再次接觸抗原后，引起體內(nèi)抗體產(chǎn)5一、體液免疫應(yīng)答

再次的應(yīng)答是有特異性的，它只能由與第一次相同的抗原所引起。即使動物對第一次抗原注射的應(yīng)答微弱到不能測出的程度，也仍然可激發(fā)起再次的應(yīng)答。這說明抗體形成的細胞對已接觸過的抗原具有“記憶能力”。.一、體液免疫應(yīng)答再次的應(yīng)答是有特異性的，它只能6二、細胞免疫應(yīng)答如果將皮膚移植物從一個供體移植給與供體無關(guān)的另一個同類受體動物，該移植物大約只能存活10d左右。緩慢的排異過程稱為“第一次應(yīng)答”：1周左右的時間?？焖俚呐懦膺^程稱為“第二次應(yīng)答”：不超過1~2天。.二、細胞免疫應(yīng)答如果將皮膚移植物從一個供體移植給與供體無關(guān)的7二、細胞免疫應(yīng)答.二、細胞免疫應(yīng)答.8二、細胞免疫應(yīng)答然而，移植物的排斥過程與抗毒素的保護作用并不完全相同，因為前者不能用血清抗體從致敏動物傳遞給正常動物對移植物發(fā)生第二次反應(yīng)，只能用活細胞從一個動物傳遞給另一個動物?？蓤?zhí)行這種傳遞作用的細胞，通常是脾、淋巴結(jié)及外周血液中的T淋巴細胞，而不是血清抗體。.二、細胞免疫應(yīng)答然而，移植物的排斥過程與抗毒素的保護作用并不9三、免疫耐受免疫系統(tǒng)能將外源性抗原(微生物性抗原和異體移植物)識別為異物，這對免疫系統(tǒng)來說是非常重要的。那么我們必然會推論出，免疫系統(tǒng)還必須能識別本身的細胞抗原為“非異物”，所以不去發(fā)動對其免疫應(yīng)答。也就是說，免疫系統(tǒng)必須“耐受”其自身的抗原。.三、免疫耐受免疫系統(tǒng)能將外源性抗原(微生物性抗原和異體移植物10免疫應(yīng)答是抗體與細胞的免疫應(yīng)答和免疫耐受性。動物機體應(yīng)有自身監(jiān)視和抵抗入侵微生物的免疫系統(tǒng)?？梢哉J為，細胞免疫應(yīng)答是免疫監(jiān)視功能的反應(yīng)，而抗體免疫應(yīng)答則是預(yù)防功能的反應(yīng)。然而，這樣的區(qū)分并不是絕對的，因為抗體的存在有助于移植物的排斥，而細胞免疫應(yīng)答也參與抗體防御各種傳染病。至于耐受性則代表著兄一種必不可少的保護機制，它能保護動物免遭免疫應(yīng)答不加選擇的傷害作用。.免疫應(yīng)答是抗體與細胞的免疫應(yīng)答和免疫耐受性。動物11四、免疫應(yīng)答的機制當(dāng)抗原性物質(zhì)入侵機體之后，它首先被識別為外源性的并被捕獲。然后這種信息被傳遞到抗體生成系統(tǒng)或細胞免疫系統(tǒng)，隨后這些系統(tǒng)開始發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生特異性抗體或致敏性淋巴細胞去消滅侵入的抗原。免疫系統(tǒng)還可以將這種信息“記憶”儲存起來，以便以后再遇到同一抗原時作出更有效的反應(yīng)。.四、免疫應(yīng)答的機制當(dāng)抗原性物質(zhì)入侵機體之后，它首先被識別為外12四、免疫應(yīng)答的機制所以，可認為免疫系統(tǒng)包括以下的基本構(gòu)成:捕捉與處理抗原的系統(tǒng)(圖1-3);與抗原發(fā)生特異性反應(yīng)的機構(gòu)—抗原敏感細胞:產(chǎn)生抗體及參與細胞免疫的細胞;保持對信息的“一記憶”并在將來的遭遇中與抗原發(fā)生特異性反應(yīng)的細胞;以及最終消滅抗原的細胞。捕捉、處理與最終消滅抗原的細胞是巨噬細胞;無論是初次應(yīng)答開始時的抗原敏感細胞，還是發(fā)動再次應(yīng)答的記憶細胞之類的抗原敏感細胞。以及細胞免疫應(yīng)答的效應(yīng)細胞，都是小淋巴細胞;而抗體生成細胞是漿細胞。.四、免疫應(yīng)答的機制所以，可認為免疫系統(tǒng)包括以下的基本構(gòu)成:捕13..14五、動物早期(胚胎)免疫應(yīng)答胚胎對抗原的應(yīng)答能力在淋巴樣器官出現(xiàn)以后很快就形成了。但各種抗原刺激胎兒淋巴樣組織的能力有所不同，并不是對所有抗原都能產(chǎn)生應(yīng)答。已證明，隨著胎兒的發(fā)育，能引起其形成的抗體也逐漸增多。發(fā)動細胞免疫應(yīng)答的能力大約在抗體生成的同時形成。.五、動物早期(胚胎)免疫應(yīng)答胚胎對抗原的應(yīng)答能力在淋巴樣器官15(一)常見動物免疫系統(tǒng)的個體發(fā)生1.犢牛犢牛的免疫系統(tǒng)在胚胎早期即已形成。雖然母牛的妊娠期是280d，但胎兒的胸腺在受胎后40d即可出現(xiàn)。骨髓和脾臟在55d時出現(xiàn)，淋巴結(jié)在60d可以見到，但peyer氏淋巴集結(jié)要到75d才出現(xiàn)。因為淋巴集結(jié)的發(fā)生較晚，說明它們可能不是一級淋巴樣組織，所以不能將它們看作是相當(dāng)于禽類的法氏囊器官。在胎犢45日齡時可見到外周血液淋巴細胞，59d可見到帶IgM的細胞，135d時可見到IgG的細胞出現(xiàn)。血清抗體的檢出最早時間，依賴于所用方法的靈敏程度。所以應(yīng)用極其敏感的病毒中和試驗，一定能最旱檢出針對病毒的免疫應(yīng)答。.(一)常見動物免疫系統(tǒng)的個體發(fā)生1.犢牛.16

2.羔羊母羊的妊娠期為145d，胸腺和淋巴結(jié)分別于受胎后35d和50d可以認出，但peyer氏淋巴集結(jié)到80～90d才出現(xiàn)。外周血液淋巴細胞可見于35日齡的胎羊。在第41d它們能產(chǎn)生對φX174噬菌體的抗體；77d時可排斥不同種皮膚移植物；90d時能對SV40病毒產(chǎn)生抗休；105d時能產(chǎn)生抗T4噬菌體抗體；122d時可產(chǎn)生抗藍舌病毒抗體;140d時產(chǎn)生抗淋巴細胞性脈絡(luò)從腦膜炎病毒抗體。.2.羔羊.173.仔豬母豬妊娠期為114d胎豬的胸腺在40d時形成。胎豬在42d時可產(chǎn)生對細小病毒的抗體，與此同時能排斥同種移植物。血液循環(huán)中帶Is的細胞在70d和80d之間急劇增加。胎豬對抗原的應(yīng)答主要是IgM型抗體。但新生仔豬和胎豬還生成一種沒有輕鏈的4S免疫球蛋白。.3.仔豬.184.仔狗母狗的妊娠期為60d，在受胎后20d前后胎狗胸腺分化。胎狗在40d時對噬菌體φX174產(chǎn)生應(yīng)答。外周血液淋巴細胞在受胎的45d對植物凝集素產(chǎn)生應(yīng)答。在45～50d前后可在淋巴結(jié)中檢出淋巴細胞，在脾臟中是50～55d。在45d前后還形成了排斥同種移植物的能力，但排斥過程較為緩慢。在42d以前，子宮內(nèi)注射抗原可使仔狗獲得耐受性。所以，狗的胸腺T細胞植入二級淋巴器官以及體液免疫應(yīng)答能力的形成與其他家畜相比似乎較遲。.4.仔狗.195.雛雞在孵化后5～7d，卵黃膜中的T細胞出現(xiàn)，并在趨化性的影響下遷移到胸腺和法氏囊。這些細胞在法氏囊中分化，并于孵化后第12d，在囊中形成濾泡。在14d，在法氏囊中可以查到帶有IgM表面膜標(biāo)志的淋巴細胞，這種IgM的表面膜標(biāo)志能結(jié)合抗原。孵化后第16d和第18d，可以分別產(chǎn)生抗鑰孔血藍蛋白的抗體和抗綿羊紅細胞抗體。在第21d出殼前后，形成帶有表面膜標(biāo)志IgG的淋巴細胞。而IgA陽性細胞在出生后3～7d才一首次出現(xiàn)于腸中。.5.雛雞.20(二)新生動物的免疫應(yīng)答新生動物產(chǎn)生的任何一種免疫應(yīng)答畢竟還是一級應(yīng)答，其延續(xù)期長，所產(chǎn)生的杭體也是低濃度的。如果不為其提供“免疫學(xué)的幫助”，新生動物就容易死于微生物感染，而這些微生物對成年動物卻危害不大。這種“免疫學(xué)的幫助”就是通過初乳或卵黃從母體獲得抗體，建立起被動性免疫。.(二)新生動物的免疫應(yīng)答新生動物產(chǎn)生的任何一種免疫應(yīng)答畢竟還21(二)新生動物的免疫應(yīng)答母體抗體到達胎兒的途徑取決于胎盤屏障的性質(zhì)。反芻動物的胎盤是結(jié)締絨毛膜性的，即絨毛膜上皮直接與子宮組織相接觸。馬與貓的胎盤是上皮絨毛膜性的，胎兒絨毛膜上皮和完整的子宮上皮相接觸。這兩種胎盤的動物，免疫球蛋白分子通過胎盤的通路全被阻斷，這些動物的新生幼仔所需的抗體完全是通過初乳獲得的。.(二)新生動物的免疫應(yīng)答母體抗體到達胎兒的途徑取決于胎盤屏障22(二)新生動物的免疫應(yīng)答新生動物血清中免疫球蛋白的水平，可以應(yīng)用鋇(定血清中免疫球蛋白試驗，如硫酸鋅濁度試驗或輻射狀態(tài)免疫擴散試驗等來檢查。對缺乏免疫球蛋白的新生動物可以進行人工補給，如補給冷凍貯存的初乳，成年動物的正常血清以及粗制的免疫球蛋白制劑等。雖然初乳轉(zhuǎn)移的免疫對幼齡動物的防病與保健是重要的，但也會發(fā)生問題。如母畜被其胎兒的紅細胞免疫，產(chǎn)生了抗紅細胞抗體，而初乳中的抗體可以引起胎兒紅細胞的大量破壞，造成新生動物的溶血性貧血等。.(二)新生動物的免疫應(yīng)答新生動物血清中免疫球蛋白的水平，可以23(三)新生動物免疫應(yīng)答的產(chǎn)生1.局部免疫應(yīng)答在初乳轉(zhuǎn)變成乳汁的時候，新生動物腸道的淋巴樣組織已能對攝入的抗原充分地發(fā)生應(yīng)答。如犢牛在出生時口服冠狀病毒疫苗，經(jīng)3～14d即能抵抗強毒株的攻擊。小豬出生后3d口服接種傳染性胃腸炎病毒疫苗。大部分早期的抵抗力應(yīng)歸功于干擾素，還有早期腸道中的IgM應(yīng)答，后者大約在14d時轉(zhuǎn)變?yōu)镮gA應(yīng)答。生長中的動物，分泌性IgA應(yīng)答出現(xiàn)較早，并在其他類型的免疫球蛋白之前達到成年動物的水平。無菌仔豬未接觸過抗原的腸道，也一可對抗原產(chǎn)生快速應(yīng)答。這些動物腸道內(nèi)合成的抗體，在感染大腸桿菌后4d即可測到，而到第10d，腸道似乎已變成免疫學(xué)的“正常狀態(tài)”。.(三)新生動物免疫應(yīng)答的產(chǎn)生1.局部免疫應(yīng)答.24(三)新生動物免疫應(yīng)答的產(chǎn)生2.全身免疫應(yīng)答免疫應(yīng)答水平部分地受負反饋作用的控制，即特異性抗體能抑制更多的相同特異性抗體產(chǎn)生。新生動物從母體被動獲得的抗體也可以抑制新生動物的免疫應(yīng)答。這種抑制作用的確切機制尚不清楚。如果犢牛未吃初乳，因而表現(xiàn)低丙種球蛋白血癥，它們大約在1周齡時即能開始合成自己的免疫球蛋白；而已吃了初乳的犢牛，就有了血清免疫球蛋白，它們大約在4周齡時才開始合成自己的免疫球蛋白。未吃過初乳的仔豬生后2d就能很好的對偽狂犬病毒產(chǎn)生應(yīng)答:如果吃了初乳，到5～6周齡以前不合成免疫球蛋白。末吃初乳的羔羊在1周齡時能合成IgG，3～4周齡時合成磅IgG；如果吃過初乳，則于5～6周齡以前不能合成IgG。.(三)新生動物免疫應(yīng)答的產(chǎn)生2.全身免疫應(yīng)答.25(三)新生動物免疫應(yīng)答的產(chǎn)生2.全身免疫應(yīng)答被動傳遞母源抗體不僅可以抑制新生動物合成免疫球蛋白，而且還能阻止新生動物有效疫苗接種。這種無效期可以持續(xù)幾個月之久，其長短取決于轉(zhuǎn)移到新生動物體內(nèi)的抗體的量和所涉及的免疫球蛋白的半衰期。類似的情況也發(fā)生于通過卵黃獲得母源性抗體的禽類(包括鳥類)。.(三)新生動物免疫應(yīng)答的產(chǎn)生2.全身免疫應(yīng)答.26(三)新生動物免疫應(yīng)答的產(chǎn)生2.全身免疫應(yīng)答雛雞從卵黃中護獲得母源抗體。在液相的卵黃中，IgG的水平和母雞血清中水平相等。當(dāng)卵通過輸卵管時，在獲得蛋白的同時也獲得了分泌型的IgA和IgM。當(dāng)胚胎發(fā)育時它吸收一部分卵黃IgG,然后出現(xiàn)于血液循環(huán)中。在蛋白中的母體IgM和IgA也出現(xiàn)于羊水中而被雞胚吸收。結(jié)果，當(dāng)雛雞被孵出時，血清中有了IgG，而腸道中有了lgM和IgA。新出殼的雛雞，直至約24h才將其卵黃中抗體吸收完畢。至孵出后10～20d，母源抗體才消失。.(三)新生動物免疫應(yīng)答的產(chǎn)生2.全身免疫應(yīng)答.27第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)一、概述利用抗原與抗體在體內(nèi)或體外均能發(fā)生特異性結(jié)合的特性設(shè)計的檢測抗原或抗體的一系列檢測技術(shù)，稱之為免疫血清學(xué)檢測技術(shù)?？梢娀虿豢梢姷姆磻?yīng)，主要有凝聚性反應(yīng)(凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng))、標(biāo)記抗體技術(shù)(熒光抗體、酶標(biāo)記抗休、放射免疫)、有補體參與的反應(yīng)(溶菌反應(yīng)、溶血反應(yīng)、補體結(jié)合反應(yīng)、免疫粘附血凝、團集反應(yīng))和中和試驗(病毒中和試驗、毒素中和試驗)。.第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)一、概述.28第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)免疫血清學(xué)檢測技術(shù)具有特異性強、敏感性高、適應(yīng)面廣、方法簡便、快速、制樣簡單等特點。各種血清學(xué)檢測技術(shù)幾乎均可用于動物傳染病的診斷，但以凝集性反應(yīng)和標(biāo)記抗體技術(shù)應(yīng)用最廣。下面主要介紹一些常用的動物傳染病血清學(xué)診斷技術(shù)。.第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)免疫血清學(xué)檢測技術(shù)具有特異性強、敏感性高29第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)二、血球凝集與血球凝集抑制試驗(一)原理有很多禽類病毒如雞新城疫病毒、流感病毒、傳染性喉氣管炎病毒、產(chǎn)蛋下降綜合征病毒（EDS-76）及用酶處理后的傳染性支氣管炎病毒等，能使雞或(和)其他動物的紅細胞發(fā)生凝集反應(yīng)，且這種凝集反應(yīng)可被其特異性抗體所抑制。因此，可采用HA和HI試驗檢測血凝性的病毒及其特異性抗體。.第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)二、血球凝集與血球凝集抑制試驗.30第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)(二)血球凝集試驗血球凝集試驗（HA）主要用于新分離的具有血凝特性的病毒的常規(guī)檢測(確定血凝、測定血凝效價)和確定HI試驗時病毒的血凝單位。1.材料2.操作.第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)(二)血球凝集試驗.31第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)（三）血凝抑制(HI)試驗HI試驗除可用特異性抗體鑒定新分離的具有血凝特性的病毒外，還可應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)病毒抗原測定血清中的相應(yīng)抗體。HI試驗操作簡便，無需特殊的儀器設(shè)備，亦無需活的試驗宿主系統(tǒng)，因而是診斷和鑒定某些禽病病毒及進行免疫監(jiān)測和抗體流行病學(xué)調(diào)查的常用方法。其中以NDV和EDS-76的HI試驗應(yīng)用最普遍。1.材料2.操作.第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)（三）血凝抑制(HI)試驗.32第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)三、瓊脂免疫擴散試驗(一)原理瓊脂在高溫時能溶于水中，1%的瓊脂冷膠冷卻后的孔徑約為85nm，因此，能允許各種抗原抗體在瓊脂凝膠中自由擴散?？乖贵w在瓊脂凝膠中擴散，當(dāng)二者在適當(dāng)比例處相遇，即會發(fā)生沉淀反應(yīng)，而形成肉眼可見的沉淀線。此種反應(yīng)稱瓊脂免疫擴散，免疫擴散的方法有單向單擴散、單向雙擴散，雙向單擴散、雙向雙擴一散。該項技術(shù)具有準(zhǔn)確、經(jīng)濟、簡便等優(yōu)點，經(jīng)常用于禽病病毒抗原和抗體的檢測，如馬立克氏病、傳染性法氏囊病、傳染性支氣管炎、病毒性關(guān)節(jié)炎、新城疫、禽痘、支原體病等的診斷及免疫監(jiān)測。.第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)三、瓊脂免疫擴散試驗.33瓊脂免疫擴散試驗(二)材料(1)1%緩沖瓊脂(含8%的NaCI)。(2)瓊脂凝膠的支持物。(3)需根據(jù)不同的疫病和不同的目的采取不同的待檢樣品。(三)操作1.瓊脂凝膠板打孔2.加樣3.結(jié)果判定.瓊脂免疫擴散試驗(二)材料.34第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)四、直接凝集試驗(一)原理細菌菌體與全血或血清中的特異性抗體反應(yīng)會發(fā)生凝集或形成聚團塊。凝集試驗是丁“泛應(yīng)用于禽細菌性傳染病的血清學(xué)診斷方法之一。常用凝集試驗進行診斷的雞病有傳染性鼻炎、沙門氏菌病(雞白痢、雞傷寒)、雞支原體病。試驗操作有平板法(在載玻片、塑料板或瓷板上進行)、試管法(在試管中進行)或微量法〔在微量反應(yīng)板上進行)凝集試驗，其中微量法可減少血清用量、降低費用和時間。.第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)四、直接凝集試驗.35直接凝集試驗(二)操作1.平板法以快速全血平板凝集試驗檢測抗雛雞白痢沙門氏菌抗體為例說明。2.試管法本法一般用于抗體的定量檢測，用以比較不同的雞群或不同個體之間的血清抗體水平。3.微量法本試驗是在一次性的塑料微量試驗板中進行。由于使用的血清和抗原的量很少，因而可降低試驗成本，縮短試驗時間。.直接凝集試驗(二)操作.36第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)五、間接血球凝集試驗(一)原理將可溶性抗原(如細菌裂解物、浸出液、病毒抗原)或抗體吸附(稱之為致敏)于比其體積大千萬倍的紅細胞表面，此致敏的紅細胞FJ相應(yīng)的抗體或抗原結(jié)合，即可產(chǎn)生肉眼可見的凝集現(xiàn)象。若用抗原致敏紅細胞檢測抗體，稱為間接血凝(IHA或PHA)；而用抗體吸附于紅細胞表面檢測抗原，則稱為反向間接血凝(RIHA或RPHA)。這種血清學(xué)技術(shù)具有快速、簡便、靈敏、特異等優(yōu)點，已少、一泛應(yīng)用于雞病的診斷與檢測，如檢測傳染性支氣管炎抗體、霉形體抗體的間接血凝試驗，檢測傳染性法氏囊病病毒的反向間接血凝試驗等。.第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)五、間接血球凝集試驗.37直接凝集試驗(二)材料1.醛化紅細胞的制備

新鮮紅細胞也可用于間接血凝試驗，但由丁新鮮紅細胞質(zhì)脆、易溶、保存時間短、重復(fù)性差等缺點，因而多將紅細胞用醛類固定劑固定制成醛化紅細胞。2.甲醛化紅細胞的致敏(1)抗原和抗體(2)紅細胞致敏(3)樣品稀釋液〔供稀釋致敏紅細胞和檢測樣品)(三)操作.直接凝集試驗(二)材料.38第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)六、補體結(jié)合試驗(一)原理補體參與的試驗可大致分為兩類:一類是補體與細胞的免疫復(fù)合物結(jié)合后，直接引起溶細胞的可見反應(yīng)，如溶血反應(yīng)、溶菌反應(yīng)、殺菌反應(yīng)、免疫翻附反應(yīng)、團集反應(yīng)等。另一類是補體與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合后不引起可見反應(yīng)(可溶性抗原一與抗體)，但可用指示系統(tǒng)如溶血反應(yīng)來測定補體是否己被結(jié)合，從而間接地檢測反應(yīng)系統(tǒng)是否存在抗原抗體復(fù)合物，如補體結(jié)合試驗、團集性補體吸收試驗等。其中補體結(jié)合試驗最為常用，該試驗以溶血反應(yīng)作為指示系統(tǒng)，檢測抗原抗體反應(yīng)系統(tǒng)中是否存在相應(yīng)的抗原和抗體。參與補體結(jié)合反應(yīng)的抗體稱為補體結(jié)合抗體。補體結(jié)合抗體主要為IgG和IgM。通常是利用已知抗原檢測未知抗體。.第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)六、補體結(jié)合試驗.39補體結(jié)合試驗(二)材料

1.待檢血清2.補體3.紅細胞懸液4.溶血素5.致敏紅細胞懸液(三)操作.補體結(jié)合試驗(二)材料.40第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)七、病毒中和試驗(一)原理根據(jù)抗體能否中和病毒的感染性而建立的免疫學(xué)試驗稱為中和試驗(ITV)。中和試驗極為特異和敏感，主要用于病毒感染的血清學(xué)診斷、病毒分離株的鑒定、不同病毒株的抗原關(guān)系研究、疫苗免疫原性的評價、兔疫血清的質(zhì)量評價和檢測動物血清中的抗體等。根據(jù)測定的方法不同，中和試驗可分為兩種。.第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)七、病毒中和試驗.41病毒中和試驗(二)操作1.終點法中和試驗本法是通過滴定使病毒感染力減少至50%的血清中和效價或中和指數(shù)。有固定病毒稀釋血清及固定血清稀釋病毒兩種滴定方法。(1)固定病毒稀釋血清法將己知的病毒量固定而血清作倍比稀釋，常用于測定抗血清的中和效價。①病毒毒價的滴定②正式試驗:.病毒中和試驗(二)操作.42病毒中和試驗(2)固定血清稀釋病毒法將病毒原液作10倍遞進稀釋，分裝兩列無菌試管。第一列加等量正常血清(對照組)，第二列加待檢血一清(中和組)，混合后37℃下放置1h，分別接種實驗動物(或雞胚、細胞培養(yǎng))，記錄每組死亡數(shù)、累積死亡數(shù)和累積存活數(shù)，用Reed-Muench法或Karber法計算LD50，然后計算中和指數(shù)。中和指數(shù)=中和組LD50/對照組LD50。通常待檢血清的中和指數(shù)>50者即為陽性，10~400為可疑，<10為陰性。.病毒中和試驗(2)固定血清稀釋病毒法.43病毒中和試驗2.空斑減少試驗空斑減少試驗系應(yīng)用空斑技術(shù)，以使空斑數(shù)減少so%的血清量作為中和滴度。試驗時，將己知空斑單位的病毒稀釋成每一接種劑量含100空斑單位(pFU)，加等量遞進稀釋的血清，37℃下放置1h。每一稀釋度接種3個已形成單層細胞的空斑瓶，每瓶0.25～0.5ml。37℃下放置1h，使病毒吸附，然后加入在44℃水浴預(yù)溫的營養(yǎng)瓊脂(在0.5%水解乳蛋白或Eagles液中，加2%小牛血清、1.5%瓊脂及0.1%中性紅3.3ml)10ml，平放1h后凝固，將細胞面向上37℃培養(yǎng)。同時用稀釋的病毒加等量Hanks液同樣處理，作為病毒對照。數(shù)大后分別計算空斑數(shù)，用Reel-Muench或Karber或內(nèi)插法計算血清的中和滴度。.病毒中和試驗2.空斑減少試驗.44Karber法計算TCID50公式為.Karber法計算TCID50公式為.45第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)八、其他檢測技術(shù)(一)免疫熒光杭體技術(shù)1.原理免疫熒光抗體(IF)技術(shù)是利用抗原抗體反應(yīng)的特異性與熒光顯微技術(shù)的精確性、敏感性相結(jié)合的免疫學(xué)標(biāo)記技術(shù)。其基本原理是，熒光色素(常用異硫氰酸熒光素)與抗體分子結(jié)合后，并不影響抗體蛋白分子的免疫活性，當(dāng)標(biāo)木涂片(或切片)中有特異性抗原存在時，熒光素標(biāo)記的抗體可與之特異性結(jié)合，且這種結(jié)合較為牢固，用緩沖液浸洗時不會洗脫，在熒光顯微鏡下檢查時，可見到熒光，從而判斷抗原或抗體的存在、定位和分布情況。IF技術(shù)已用于多種禽病抗原或抗體的檢測，成為禽病診斷的常用血清學(xué)手段。.第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)八、其他檢測技術(shù).46免疫熒光杭體技術(shù)2.操作(1)染色標(biāo)本片的準(zhǔn)備①檢測抗原的標(biāo)本片②檢測抗體的標(biāo)木片(2)標(biāo)本片的固定(3)染色方法①直接法②間接法.免疫熒光杭體技術(shù)2.操作.47第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)(二)酶聯(lián)免疫吸附試驗1.原理酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶促反應(yīng)的敏感性相結(jié)合而建立起來的免疫學(xué)標(biāo)記技術(shù)。其基本原理是，酶分子【常用辣根過氧化物酶(HRP)】與抗體或抗抗體分子可共價結(jié)合，這種結(jié)合既不改變抗體的免疫反應(yīng)活性，也不影響酶的生物化學(xué)活性。這種酶標(biāo)記抗體可與標(biāo)本巾的抗原或抗體特異性結(jié)合后，在底物溶液的參與下，產(chǎn)生肉眼可見的顏色反應(yīng)，顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中抗原或抗體的量成正比。.第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)(二)酶聯(lián)免疫吸附試驗.48酶聯(lián)免疫吸附試驗2.操作

ELISA是將抗原(或抗體)吸附于聚苯乙烯酶標(biāo)反應(yīng)板等固相載體，在載體上進行免疫酶染色，加底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB-H2O2)或鄰苯二胺（OPD-H2O2）顯色后，用肉眼或分光光度計判定結(jié)果。在禽病的診斷和血清抗體檢測上，常用的ELISA法有間接法ELISA、雙抗體夾心ELISA和斑點ELISA。(1)間接法ELISA(2)雙抗體夾心ELISA(3)斑點ELISA(Dot-ELISA).酶聯(lián)免疫吸附試驗2.操作.49第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)(三)單克隆杭體技術(shù)

1975年英國學(xué)者首次提出了單克隆抗體雜交瘤技術(shù)，它是將產(chǎn)生特異性抗體(針對單個抗原決定簇)的B淋巴細胞與能無限生長的骨髓瘤細胞融合，形成H淋巴細胞雜交瘤，由該雜交瘤細胞所分泌的抗體即是單克隆抗體，簡稱單抗。由于單抗在分子結(jié)構(gòu)、氨基酸排列順序等方面都是一致的.因而其純度高，特異性強，重復(fù)性好，并可以大量、快速、連續(xù)地在動物體內(nèi)或體外產(chǎn)生同質(zhì)性單抗。正由于此，使用單克隆抗體替代多克隆抗血清進行疫病的檢測將更有利于各種血清學(xué)診斷方法的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化，因而單抗已被廣泛地用于疫病的診斷、毒(菌)株鑒定、檢疫、治療及預(yù)防等各個方面。.第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)(三)單克隆杭體技術(shù).50單克隆杭體技術(shù)

十幾年來我國在動物用單抗研究方面發(fā)展迅速，其中包括國內(nèi)流行較廣’、危害較嚴(yán)重的大多數(shù)雞病毒性和細菌性疫病病原的單抗，如抗雞馬立克氏病病毒、新城疫病毒、傳染性法氏囊病病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒、禽痘病毒、產(chǎn)蛋下降綜合征病毒及沙門氏菌OH抗原的單抗等，這些單抗多能替代多克隆抗血清，用于有關(guān)疫病的診斷和檢疫?？闺uIgMμ鏈(重鏈)單抗的成功研制為雞疫病的早期診斷提供了快速、特異、靈敏的方法。.單克隆杭體技術(shù)十幾年來我國在動物用單抗研究51第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)(四)核酸探針技術(shù)

核酸探針技術(shù)是20世紀(jì)80年代中期才異軍突起的一種新的診斷技術(shù)。其基本原理是將某種微生物特異的核昔酸序列與樣品的核普酸序列互補時，發(fā)生雜交，形成雙股核酸，不發(fā)生雜交的單股核酸被去除。雜交的探針可用放射自顯影(放射性分子標(biāo)記)檢測或比色(非放射性分子標(biāo)記)測定。核酸探針是以病原體的核酸為檢測目標(biāo)，其診斷原理與以抗原抗體特異性反應(yīng)為基礎(chǔ)的血清學(xué)診斷原理有著明顯的區(qū)別。.第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)(四)核酸探針技術(shù).52第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)(五)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

聚合酶鏈反應(yīng)模擬體內(nèi)DNA復(fù)制過程，它利用兩個引物，經(jīng)過高溫(模板DNA)變性、低溫(模板DNA物)退火和適溫(在DNA聚合酶催化下發(fā)生引物鏈)延伸反應(yīng)，形成一個周期，進行模板DNA的合成，新合成的產(chǎn)物再經(jīng)高溫變性后又可作為與引物退火的模板，并再發(fā)生引物鏈延伸反應(yīng)，如此循環(huán)數(shù)次，可使靶DIVA序列成幾何級數(shù)量倍增。.第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)(五)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng).53(五)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR技術(shù)具有操作簡便、快速、高度特異性、選擇性和敏感性等特點，且對樣品要求不高，無論新鮮組織或陳舊組織、細胞或體液、粗提或純化RNA和DNA均可，加之TaqDNA聚合酶的使用促進了PCR技術(shù)自動化，因而PCR非常適合于感染性疫病的監(jiān)測和診斷。PCR已成功地用于傳染性支氣管炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒、傳染性法氏囊病病毒、馬立克氏病病毒、雞敗血霉形體、貧血病毒和禽流感病毒等的診斷和研究。.(五)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng).54復(fù)習(xí)思考題1.試述免疫應(yīng)答的基本過程。初次應(yīng)答和再次應(yīng)答的抗體產(chǎn)生有何特點?2.常用的免疫血清學(xué)技術(shù)有哪些，其基本原理是什么?.復(fù)習(xí)思考題1.試述免疫應(yīng)答的基本過程。初次應(yīng)答和再次應(yīng)答的抗55第二章獸醫(yī)生物制品的免疫學(xué)基礎(chǔ)【知識目標(biāo)】熟悉免疫學(xué)診斷與檢測的常用技術(shù);理解免疫耐受及免疫應(yīng)答的機制;掌握體液免疫應(yīng)答和細胞免疫應(yīng)答;了解動物早期(胚胎)免疫應(yīng)答機理..第二章獸醫(yī)生物制品的免疫學(xué)基礎(chǔ)【知識目標(biāo)】.56第二章獸醫(yī)生物制品的免疫學(xué)基礎(chǔ)【能力目標(biāo)】能進行血球凝集(HA)與血球凝集抑制(HI)試驗、瓊脂免疫擴散試驗、補體結(jié)合試驗、病毒中和(VN)試驗等操作;能應(yīng)用免疫熒光杭體技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、單克隆抗體技術(shù)、PCR技術(shù)等進行免疫檢測..第二章獸醫(yī)生物制品的免疫學(xué)基礎(chǔ)【能力目標(biāo)】.57第一節(jié)免疫應(yīng)答免疫應(yīng)答是動物機體免疫系統(tǒng)識別各類異物，并將其殺死、降解和排除的過程。其中包括體液免疫應(yīng)答和細胞免疫應(yīng)答兩方面。.第一節(jié)免疫應(yīng)答免疫應(yīng)答是動物機體免疫系統(tǒng)識別各58一、體液免疫應(yīng)答巴斯德發(fā)現(xiàn)用疫苗接種可以預(yù)防某些家畜、家禽的傳染病后，不久便弄清了提供這種抵抗力的物質(zhì)存在于血清之中，并證明、應(yīng)用接種過疫苗的動物血清可以將這種抵抗力被動地傳遞給未接種的動物.如用經(jīng)過疫苗接種而對破傷風(fēng)毒素產(chǎn)生了抵抗力。.一、體液免疫應(yīng)答巴斯德發(fā)現(xiàn)用疫苗接種可以預(yù)防某59一、體液免疫應(yīng)答動物機體初次和再次接觸抗原后，引起體內(nèi)抗體產(chǎn)生的種類、抗體水平等均有差異。.一、體液免疫應(yīng)答動物機體初次和再次接觸抗原后，引起體內(nèi)抗體產(chǎn)60一、體液免疫應(yīng)答

再次的應(yīng)答是有特異性的，它只能由與第一次相同的抗原所引起。即使動物對第一次抗原注射的應(yīng)答微弱到不能測出的程度，也仍然可激發(fā)起再次的應(yīng)答。這說明抗體形成的細胞對已接觸過的抗原具有“記憶能力”。.一、體液免疫應(yīng)答再次的應(yīng)答是有特異性的，它只能61二、細胞免疫應(yīng)答如果將皮膚移植物從一個供體移植給與供體無關(guān)的另一個同類受體動物，該移植物大約只能存活10d左右。緩慢的排異過程稱為“第一次應(yīng)答”：1周左右的時間?？焖俚呐懦膺^程稱為“第二次應(yīng)答”：不超過1~2天。.二、細胞免疫應(yīng)答如果將皮膚移植物從一個供體移植給與供體無關(guān)的62二、細胞免疫應(yīng)答.二、細胞免疫應(yīng)答.63二、細胞免疫應(yīng)答然而，移植物的排斥過程與抗毒素的保護作用并不完全相同，因為前者不能用血清抗體從致敏動物傳遞給正常動物對移植物發(fā)生第二次反應(yīng)，只能用活細胞從一個動物傳遞給另一個動物?？蓤?zhí)行這種傳遞作用的細胞，通常是脾、淋巴結(jié)及外周血液中的T淋巴細胞，而不是血清抗體。.二、細胞免疫應(yīng)答然而，移植物的排斥過程與抗毒素的保護作用并不64三、免疫耐受免疫系統(tǒng)能將外源性抗原(微生物性抗原和異體移植物)識別為異物，這對免疫系統(tǒng)來說是非常重要的。那么我們必然會推論出，免疫系統(tǒng)還必須能識別本身的細胞抗原為“非異物”，所以不去發(fā)動對其免疫應(yīng)答。也就是說，免疫系統(tǒng)必須“耐受”其自身的抗原。.三、免疫耐受免疫系統(tǒng)能將外源性抗原(微生物性抗原和異體移植物65免疫應(yīng)答是抗體與細胞的免疫應(yīng)答和免疫耐受性。動物機體應(yīng)有自身監(jiān)視和抵抗入侵微生物的免疫系統(tǒng)?？梢哉J為，細胞免疫應(yīng)答是免疫監(jiān)視功能的反應(yīng)，而抗體免疫應(yīng)答則是預(yù)防功能的反應(yīng)。然而，這樣的區(qū)分并不是絕對的，因為抗體的存在有助于移植物的排斥，而細胞免疫應(yīng)答也參與抗體防御各種傳染病。至于耐受性則代表著兄一種必不可少的保護機制，它能保護動物免遭免疫應(yīng)答不加選擇的傷害作用。.免疫應(yīng)答是抗體與細胞的免疫應(yīng)答和免疫耐受性。動物66四、免疫應(yīng)答的機制當(dāng)抗原性物質(zhì)入侵機體之后，它首先被識別為外源性的并被捕獲。然后這種信息被傳遞到抗體生成系統(tǒng)或細胞免疫系統(tǒng)，隨后這些系統(tǒng)開始發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生特異性抗體或致敏性淋巴細胞去消滅侵入的抗原。免疫系統(tǒng)還可以將這種信息“記憶”儲存起來，以便以后再遇到同一抗原時作出更有效的反應(yīng)。.四、免疫應(yīng)答的機制當(dāng)抗原性物質(zhì)入侵機體之后，它首先被識別為外67四、免疫應(yīng)答的機制所以，可認為免疫系統(tǒng)包括以下的基本構(gòu)成:捕捉與處理抗原的系統(tǒng)(圖1-3);與抗原發(fā)生特異性反應(yīng)的機構(gòu)—抗原敏感細胞:產(chǎn)生抗體及參與細胞免疫的細胞;保持對信息的“一記憶”并在將來的遭遇中與抗原發(fā)生特異性反應(yīng)的細胞;以及最終消滅抗原的細胞。捕捉、處理與最終消滅抗原的細胞是巨噬細胞;無論是初次應(yīng)答開始時的抗原敏感細胞，還是發(fā)動再次應(yīng)答的記憶細胞之類的抗原敏感細胞。以及細胞免疫應(yīng)答的效應(yīng)細胞，都是小淋巴細胞;而抗體生成細胞是漿細胞。.四、免疫應(yīng)答的機制所以，可認為免疫系統(tǒng)包括以下的基本構(gòu)成:捕68..69五、動物早期(胚胎)免疫應(yīng)答胚胎對抗原的應(yīng)答能力在淋巴樣器官出現(xiàn)以后很快就形成了。但各種抗原刺激胎兒淋巴樣組織的能力有所不同，并不是對所有抗原都能產(chǎn)生應(yīng)答。已證明，隨著胎兒的發(fā)育，能引起其形成的抗體也逐漸增多。發(fā)動細胞免疫應(yīng)答的能力大約在抗體生成的同時形成。.五、動物早期(胚胎)免疫應(yīng)答胚胎對抗原的應(yīng)答能力在淋巴樣器官70(一)常見動物免疫系統(tǒng)的個體發(fā)生1.犢牛犢牛的免疫系統(tǒng)在胚胎早期即已形成。雖然母牛的妊娠期是280d，但胎兒的胸腺在受胎后40d即可出現(xiàn)。骨髓和脾臟在55d時出現(xiàn)，淋巴結(jié)在60d可以見到，但peyer氏淋巴集結(jié)要到75d才出現(xiàn)。因為淋巴集結(jié)的發(fā)生較晚，說明它們可能不是一級淋巴樣組織，所以不能將它們看作是相當(dāng)于禽類的法氏囊器官。在胎犢45日齡時可見到外周血液淋巴細胞，59d可見到帶IgM的細胞，135d時可見到IgG的細胞出現(xiàn)。血清抗體的檢出最早時間，依賴于所用方法的靈敏程度。所以應(yīng)用極其敏感的病毒中和試驗，一定能最旱檢出針對病毒的免疫應(yīng)答。.(一)常見動物免疫系統(tǒng)的個體發(fā)生1.犢牛.71

2.羔羊母羊的妊娠期為145d，胸腺和淋巴結(jié)分別于受胎后35d和50d可以認出，但peyer氏淋巴集結(jié)到80～90d才出現(xiàn)。外周血液淋巴細胞可見于35日齡的胎羊。在第41d它們能產(chǎn)生對φX174噬菌體的抗體；77d時可排斥不同種皮膚移植物；90d時能對SV40病毒產(chǎn)生抗休；105d時能產(chǎn)生抗T4噬菌體抗體；122d時可產(chǎn)生抗藍舌病毒抗體;140d時產(chǎn)生抗淋巴細胞性脈絡(luò)從腦膜炎病毒抗體。.2.羔羊.723.仔豬母豬妊娠期為114d胎豬的胸腺在40d時形成。胎豬在42d時可產(chǎn)生對細小病毒的抗體，與此同時能排斥同種移植物。血液循環(huán)中帶Is的細胞在70d和80d之間急劇增加。胎豬對抗原的應(yīng)答主要是IgM型抗體。但新生仔豬和胎豬還生成一種沒有輕鏈的4S免疫球蛋白。.3.仔豬.734.仔狗母狗的妊娠期為60d，在受胎后20d前后胎狗胸腺分化。胎狗在40d時對噬菌體φX174產(chǎn)生應(yīng)答。外周血液淋巴細胞在受胎的45d對植物凝集素產(chǎn)生應(yīng)答。在45～50d前后可在淋巴結(jié)中檢出淋巴細胞，在脾臟中是50～55d。在45d前后還形成了排斥同種移植物的能力，但排斥過程較為緩慢。在42d以前，子宮內(nèi)注射抗原可使仔狗獲得耐受性。所以，狗的胸腺T細胞植入二級淋巴器官以及體液免疫應(yīng)答能力的形成與其他家畜相比似乎較遲。.4.仔狗.745.雛雞在孵化后5～7d，卵黃膜中的T細胞出現(xiàn)，并在趨化性的影響下遷移到胸腺和法氏囊。這些細胞在法氏囊中分化，并于孵化后第12d，在囊中形成濾泡。在14d，在法氏囊中可以查到帶有IgM表面膜標(biāo)志的淋巴細胞，這種IgM的表面膜標(biāo)志能結(jié)合抗原。孵化后第16d和第18d，可以分別產(chǎn)生抗鑰孔血藍蛋白的抗體和抗綿羊紅細胞抗體。在第21d出殼前后，形成帶有表面膜標(biāo)志IgG的淋巴細胞。而IgA陽性細胞在出生后3～7d才一首次出現(xiàn)于腸中。.5.雛雞.75(二)新生動物的免疫應(yīng)答新生動物產(chǎn)生的任何一種免疫應(yīng)答畢竟還是一級應(yīng)答，其延續(xù)期長，所產(chǎn)生的杭體也是低濃度的。如果不為其提供“免疫學(xué)的幫助”，新生動物就容易死于微生物感染，而這些微生物對成年動物卻危害不大。這種“免疫學(xué)的幫助”就是通過初乳或卵黃從母體獲得抗體，建立起被動性免疫。.(二)新生動物的免疫應(yīng)答新生動物產(chǎn)生的任何一種免疫應(yīng)答畢竟還76(二)新生動物的免疫應(yīng)答母體抗體到達胎兒的途徑取決于胎盤屏障的性質(zhì)。反芻動物的胎盤是結(jié)締絨毛膜性的，即絨毛膜上皮直接與子宮組織相接觸。馬與貓的胎盤是上皮絨毛膜性的，胎兒絨毛膜上皮和完整的子宮上皮相接觸。這兩種胎盤的動物，免疫球蛋白分子通過胎盤的通路全被阻斷，這些動物的新生幼仔所需的抗體完全是通過初乳獲得的。.(二)新生動物的免疫應(yīng)答母體抗體到達胎兒的途徑取決于胎盤屏障77(二)新生動物的免疫應(yīng)答新生動物血清中免疫球蛋白的水平，可以應(yīng)用鋇(定血清中免疫球蛋白試驗，如硫酸鋅濁度試驗或輻射狀態(tài)免疫擴散試驗等來檢查。對缺乏免疫球蛋白的新生動物可以進行人工補給，如補給冷凍貯存的初乳，成年動物的正常血清以及粗制的免疫球蛋白制劑等。雖然初乳轉(zhuǎn)移的免疫對幼齡動物的防病與保健是重要的，但也會發(fā)生問題。如母畜被其胎兒的紅細胞免疫，產(chǎn)生了抗紅細胞抗體，而初乳中的抗體可以引起胎兒紅細胞的大量破壞，造成新生動物的溶血性貧血等。.(二)新生動物的免疫應(yīng)答新生動物血清中免疫球蛋白的水平，可以78(三)新生動物免疫應(yīng)答的產(chǎn)生1.局部免疫應(yīng)答在初乳轉(zhuǎn)變成乳汁的時候，新生動物腸道的淋巴樣組織已能對攝入的抗原充分地發(fā)生應(yīng)答。如犢牛在出生時口服冠狀病毒疫苗，經(jīng)3～14d即能抵抗強毒株的攻擊。小豬出生后3d口服接種傳染性胃腸炎病毒疫苗。大部分早期的抵抗力應(yīng)歸功于干擾素，還有早期腸道中的IgM應(yīng)答，后者大約在14d時轉(zhuǎn)變?yōu)镮gA應(yīng)答。生長中的動物，分泌性IgA應(yīng)答出現(xiàn)較早，并在其他類型的免疫球蛋白之前達到成年動物的水平。無菌仔豬未接觸過抗原的腸道，也一可對抗原產(chǎn)生快速應(yīng)答。這些動物腸道內(nèi)合成的抗體，在感染大腸桿菌后4d即可測到，而到第10d，腸道似乎已變成免疫學(xué)的“正常狀態(tài)”。.(三)新生動物免疫應(yīng)答的產(chǎn)生1.局部免疫應(yīng)答.79(三)新生動物免疫應(yīng)答的產(chǎn)生2.全身免疫應(yīng)答免疫應(yīng)答水平部分地受負反饋作用的控制，即特異性抗體能抑制更多的相同特異性抗體產(chǎn)生。新生動物從母體被動獲得的抗體也可以抑制新生動物的免疫應(yīng)答。這種抑制作用的確切機制尚不清楚。如果犢牛未吃初乳，因而表現(xiàn)低丙種球蛋白血癥，它們大約在1周齡時即能開始合成自己的免疫球蛋白；而已吃了初乳的犢牛，就有了血清免疫球蛋白，它們大約在4周齡時才開始合成自己的免疫球蛋白。未吃過初乳的仔豬生后2d就能很好的對偽狂犬病毒產(chǎn)生應(yīng)答:如果吃了初乳，到5～6周齡以前不合成免疫球蛋白。末吃初乳的羔羊在1周齡時能合成IgG，3～4周齡時合成磅IgG；如果吃過初乳，則于5～6周齡以前不能合成IgG。.(三)新生動物免疫應(yīng)答的產(chǎn)生2.全身免疫應(yīng)答.80(三)新生動物免疫應(yīng)答的產(chǎn)生2.全身免疫應(yīng)答被動傳遞母源抗體不僅可以抑制新生動物合成免疫球蛋白，而且還能阻止新生動物有效疫苗接種。這種無效期可以持續(xù)幾個月之久，其長短取決于轉(zhuǎn)移到新生動物體內(nèi)的抗體的量和所涉及的免疫球蛋白的半衰期。類似的情況也發(fā)生于通過卵黃獲得母源性抗體的禽類(包括鳥類)。.(三)新生動物免疫應(yīng)答的產(chǎn)生2.全身免疫應(yīng)答.81(三)新生動物免疫應(yīng)答的產(chǎn)生2.全身免疫應(yīng)答雛雞從卵黃中護獲得母源抗體。在液相的卵黃中，IgG的水平和母雞血清中水平相等。當(dāng)卵通過輸卵管時，在獲得蛋白的同時也獲得了分泌型的IgA和IgM。當(dāng)胚胎發(fā)育時它吸收一部分卵黃IgG,然后出現(xiàn)于血液循環(huán)中。在蛋白中的母體IgM和IgA也出現(xiàn)于羊水中而被雞胚吸收。結(jié)果，當(dāng)雛雞被孵出時，血清中有了IgG，而腸道中有了lgM和IgA。新出殼的雛雞，直至約24h才將其卵黃中抗體吸收完畢。至孵出后10～20d，母源抗體才消失。.(三)新生動物免疫應(yīng)答的產(chǎn)生2.全身免疫應(yīng)答.82第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)一、概述利用抗原與抗體在體內(nèi)或體外均能發(fā)生特異性結(jié)合的特性設(shè)計的檢測抗原或抗體的一系列檢測技術(shù)，稱之為免疫血清學(xué)檢測技術(shù)?？梢娀虿豢梢姷姆磻?yīng)，主要有凝聚性反應(yīng)(凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng))、標(biāo)記抗體技術(shù)(熒光抗體、酶標(biāo)記抗休、放射免疫)、有補體參與的反應(yīng)(溶菌反應(yīng)、溶血反應(yīng)、補體結(jié)合反應(yīng)、免疫粘附血凝、團集反應(yīng))和中和試驗(病毒中和試驗、毒素中和試驗)。.第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)一、概述.83第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)免疫血清學(xué)檢測技術(shù)具有特異性強、敏感性高、適應(yīng)面廣、方法簡便、快速、制樣簡單等特點。各種血清學(xué)檢測技術(shù)幾乎均可用于動物傳染病的診斷，但以凝集性反應(yīng)和標(biāo)記抗體技術(shù)應(yīng)用最廣。下面主要介紹一些常用的動物傳染病血清學(xué)診斷技術(shù)。.第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)免疫血清學(xué)檢測技術(shù)具有特異性強、敏感性高84第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)二、血球凝集與血球凝集抑制試驗(一)原理有很多禽類病毒如雞新城疫病毒、流感病毒、傳染性喉氣管炎病毒、產(chǎn)蛋下降綜合征病毒（EDS-76）及用酶處理后的傳染性支氣管炎病毒等，能使雞或(和)其他動物的紅細胞發(fā)生凝集反應(yīng)，且這種凝集反應(yīng)可被其特異性抗體所抑制。因此，可采用HA和HI試驗檢測血凝性的病毒及其特異性抗體。.第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)二、血球凝集與血球凝集抑制試驗.85第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)(二)血球凝集試驗血球凝集試驗（HA）主要用于新分離的具有血凝特性的病毒的常規(guī)檢測(確定血凝、測定血凝效價)和確定HI試驗時病毒的血凝單位。1.材料2.操作.第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)(二)血球凝集試驗.86第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)（三）血凝抑制(HI)試驗HI試驗除可用特異性抗體鑒定新分離的具有血凝特性的病毒外，還可應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)病毒抗原測定血清中的相應(yīng)抗體。HI試驗操作簡便，無需特殊的儀器設(shè)備，亦無需活的試驗宿主系統(tǒng)，因而是診斷和鑒定某些禽病病毒及進行免疫監(jiān)測和抗體流行病學(xué)調(diào)查的常用方法。其中以NDV和EDS-76的HI試驗應(yīng)用最普遍。1.材料2.操作.第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)（三）血凝抑制(HI)試驗.87第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)三、瓊脂免疫擴散試驗(一)原理瓊脂在高溫時能溶于水中，1%的瓊脂冷膠冷卻后的孔徑約為85nm，因此，能允許各種抗原抗體在瓊脂凝膠中自由擴散。抗原抗體在瓊脂凝膠中擴散，當(dāng)二者在適當(dāng)比例處相遇，即會發(fā)生沉淀反應(yīng)，而形成肉眼可見的沉淀線。此種反應(yīng)稱瓊脂免疫擴散，免疫擴散的方法有單向單擴散、單向雙擴散，雙向單擴散、雙向雙擴一散。該項技術(shù)具有準(zhǔn)確、經(jīng)濟、簡便等優(yōu)點，經(jīng)常用于禽病病毒抗原和抗體的檢測，如馬立克氏病、傳染性法氏囊病、傳染性支氣管炎、病毒性關(guān)節(jié)炎、新城疫、禽痘、支原體病等的診斷及免疫監(jiān)測。.第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)三、瓊脂免疫擴散試驗.88瓊脂免疫擴散試驗(二)材料(1)1%緩沖瓊脂(含8%的NaCI)。(2)瓊脂凝膠的支持物。(3)需根據(jù)不同的疫病和不同的目的采取不同的待檢樣品。(三)操作1.瓊脂凝膠板打孔2.加樣3.結(jié)果判定.瓊脂免疫擴散試驗(二)材料.89第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)四、直接凝集試驗(一)原理細菌菌體與全血或血清中的特異性抗體反應(yīng)會發(fā)生凝集或形成聚團塊。凝集試驗是丁“泛應(yīng)用于禽細菌性傳染病的血清學(xué)診斷方法之一。常用凝集試驗進行診斷的雞病有傳染性鼻炎、沙門氏菌病(雞白痢、雞傷寒)、雞支原體病。試驗操作有平板法(在載玻片、塑料板或瓷板上進行)、試管法(在試管中進行)或微量法〔在微量反應(yīng)板上進行)凝集試驗，其中微量法可減少血清用量、降低費用和時間。.第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)四、直接凝集試驗.90直接凝集試驗(二)操作1.平板法以快速全血平板凝集試驗檢測抗雛雞白痢沙門氏菌抗體為例說明。2.試管法本法一般用于抗體的定量檢測，用以比較不同的雞群或不同個體之間的血清抗體水平。3.微量法本試驗是在一次性的塑料微量試驗板中進行。由于使用的血清和抗原的量很少，因而可降低試驗成本，縮短試驗時間。.直接凝集試驗(二)操作.91第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)五、間接血球凝集試驗(一)原理將可溶性抗原(如細菌裂解物、浸出液、病毒抗原)或抗體吸附(稱之為致敏)于比其體積大千萬倍的紅細胞表面，此致敏的紅細胞FJ相應(yīng)的抗體或抗原結(jié)合，即可產(chǎn)生肉眼可見的凝集現(xiàn)象。若用抗原致敏紅細胞檢測抗體，稱為間接血凝(IHA或PHA)；而用抗體吸附于紅細胞表面檢測抗原，則稱為反向間接血凝(RIHA或RPHA)。這種血清學(xué)技術(shù)具有快速、簡便、靈敏、特異等優(yōu)點，已少、一泛應(yīng)用于雞病的診斷與檢測，如檢測傳染性支氣管炎抗體、霉形體抗體的間接血凝試驗，檢測傳染性法氏囊病病毒的反向間接血凝試驗等。.第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)五、間接血球凝集試驗.92直接凝集試驗(二)材料1.醛化紅細胞的制備

新鮮紅細胞也可用于間接血凝試驗，但由丁新鮮紅細胞質(zhì)脆、易溶、保存時間短、重復(fù)性差等缺點，因而多將紅細胞用醛類固定劑固定制成醛化紅細胞。2.甲醛化紅細胞的致敏(1)抗原和抗體(2)紅細胞致敏(3)樣品稀釋液〔供稀釋致敏紅細胞和檢測樣品)(三)操作.直接凝集試驗(二)材料.93第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)六、補體結(jié)合試驗(一)原理補體參與的試驗可大致分為兩類:一類是補體與細胞的免疫復(fù)合物結(jié)合后，直接引起溶細胞的可見反應(yīng)，如溶血反應(yīng)、溶菌反應(yīng)、殺菌反應(yīng)、免疫翻附反應(yīng)、團集反應(yīng)等。另一類是補體與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合后不引起可見反應(yīng)(可溶性抗原一與抗體)，但可用指示系統(tǒng)如溶血反應(yīng)來測定補體是否己被結(jié)合，從而間接地檢測反應(yīng)系統(tǒng)是否存在抗原抗體復(fù)合物，如補體結(jié)合試驗、團集性補體吸收試驗等。其中補體結(jié)合試驗最為常用，該試驗以溶血反應(yīng)作為指示系統(tǒng)，檢測抗原抗體反應(yīng)系統(tǒng)中是否存在相應(yīng)的抗原和抗體。參與補體結(jié)合反應(yīng)的抗體稱為補體結(jié)合抗體。補體結(jié)合抗體主要為IgG和IgM。通常是利用已知抗原檢測未知抗體。.第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)六、補體結(jié)合試驗.94補體結(jié)合試驗(二)材料

1.待檢血清2.補體3.紅細胞懸液4.溶血素5.致敏紅細胞懸液(三)操作.補體結(jié)合試驗(二)材料.95第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)七、病毒中和試驗(一)原理根據(jù)抗體能否中和病毒的感染性而建立的免疫學(xué)試驗稱為中和試驗(ITV)。中和試驗極為特異和敏感，主要用于病毒感染的血清學(xué)診斷、病毒分離株的鑒定、不同病毒株的抗原關(guān)系研究、疫苗免疫原性的評價、兔疫血清的質(zhì)量評價和檢測動物血清中的抗體等。根據(jù)測定的方法不同，中和試驗可分為兩種。.第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)七、病毒中和試驗.96病毒中和試驗(二)操作1.終點法中和試驗本法是通過滴定使病毒感染力減少至50%的血清中和效價或中和指數(shù)。有固定病毒稀釋血清及固定血清稀釋病毒兩種滴定方法。(1)固定病毒稀釋血清法將己知的病毒量固定而血清作倍比稀釋，常用于測定抗血清的中和效價。①病毒毒價的滴定②正式試驗:.病毒中和試驗(二)操作.97病毒中和試驗(2)固定血清稀釋病毒法將病毒原液作10倍遞進稀釋，分裝兩列無菌試管。第一列加等量正常血清(對照組)，第二列加待檢血一清(中和組)，混合后37℃下放置1h，分別接種實驗動物(或雞胚、細胞培養(yǎng))，記錄每組死亡數(shù)、累積死亡數(shù)和累積存活數(shù)，用Reed-Muench法或Karber法計算LD50，然后計算中和指數(shù)。中和指數(shù)=中和組LD50/對照組LD50。通常待檢血清的中和指數(shù)>50者即為陽性，10~400為可疑，<10為陰性。.病毒中和試驗(2)固定血清稀釋病毒法.98病毒中和試驗2.空斑減少試驗空斑減少試驗系應(yīng)用空斑技術(shù)，以使空斑數(shù)減少so%的血清量作為中和滴度。試驗時，將己知空斑單位的病毒稀釋成每一接種劑量含100空斑單位(pFU)，加等量遞進稀釋的血清，37℃下放置1h。每一稀釋度接種3個已形成單層細胞的空斑瓶，每瓶0.25～0.5ml。37℃下放置1h，使病毒吸附，然后加入在44℃水浴預(yù)溫的營養(yǎng)瓊脂(在0.5%水解乳蛋白或Eagles液中，加2%小牛血清、1.5%瓊脂及0.1%中性紅3.3ml)10ml，平放1h后凝固，將細胞面向上37℃培養(yǎng)。同時用稀釋的病毒加等量Hanks液同樣處理，作為病毒對照。數(shù)大后分別計算空斑數(shù)，用Reel-Muench或Karber或內(nèi)插法計算血清的中和滴度。.病毒中和試驗2.空斑減少試驗.99Karber法計算TCID50公式為.Karber法計算TCID50公式為.100第二節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)八、其他檢測技術(shù)(一)免疫熒光杭體技術(shù)1.原理免疫熒光抗體(IF)技術(shù)是利用抗原抗體反應(yīng)的特異性與熒光顯微技術(shù)的精確性、敏感性相結(jié)合的免疫學(xué)標(biāo)記技術(shù)。其基本原理是，熒光色素(常用異硫氰