專業(yè)資料整理分享病毒感染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)整體程及原目的基因能直接整合到大多數(shù)真核細(xì)胞，常用的手段是將目的基因包裝成凈孽來感染細(xì)胞，從而得到表達(dá)滿足實(shí)驗(yàn)需求。1、凈孽的種類病孽有很多種，常見的有慢病孽和腺病孽慢病孽原慢病毒（Lentivirus）是逆轉(zhuǎn)錄凈孽的一種。構(gòu)建的siRNA/miRNA慢凈孽載體，與化學(xué)合成的siRNA和基于瞬時(shí)表達(dá)載體構(gòu)建的普通siRNA載體相比，一方面可以擴(kuò)增替代瞬時(shí)表達(dá)載體使用，另一方面，Lentivirus-siRNA克經(jīng)過慢沖孽包裝系統(tǒng)包裝后，可用于感染依靠傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染試劑難于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系如原代細(xì)胞、懸浮細(xì)胞和處于非分狀態(tài)的細(xì)胞，并且在感染后可以整合到受感染細(xì)胞的基因組，進(jìn)長時(shí)間的穩(wěn)定表達(dá)。特點(diǎn)1）直接包裝成為假病孽顆，對分和非分細(xì)胞均有感染作用，適合RNAi研究和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中難于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞（比如經(jīng)元細(xì)胞、干細(xì)胞或其它原代細(xì)胞）。2）可以通過簡單方式，在短時(shí)間內(nèi)獲得穩(wěn)定表達(dá)特定基因的多種細(xì)胞株。完美WORD格式編輯專業(yè)資料整理分享3）可用于基因敲除、基因治療和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究。4）無需任何轉(zhuǎn)染試劑，操作簡。5）可以根據(jù)客戶需要制備多種標(biāo)記。慢病毒包裝簡要程：1）含有目的基因的慢病毒RNAi干擾載體的構(gòu)建和質(zhì)純化提取。2）慢病毒載體，包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染病毒包裝細(xì)胞293T等。3）培養(yǎng)48hrs-72hrs左右，收集含有病毒的上清培養(yǎng)液。4）病毒的純化和濃縮。5）分裝、-80℃保存。6）滴測定目的基因檢定，并出具檢測報(bào)告。、腺病毒原腺病毒（Adenovirus，Ad）是一種無包膜的線狀雙鏈DNA病毒，其復(fù)制依賴于宿主細(xì)胞的分。有近50個(gè)血清型，大多數(shù)Ad載體是基于血清型2和5，通過轉(zhuǎn)基因的方式取代E1和E3基因，低病毒的復(fù)制能。這些重組病毒僅在高水平表達(dá)E1和E3基因的細(xì)胞中復(fù)制，因此是一種適用于治療的高效控制系統(tǒng)。完美WORD格式編輯專業(yè)資料整理分享特點(diǎn)1）幾乎可以感染所有類型的細(xì)胞2）可以獲得復(fù)制缺陷型（E1和E3缺失）的腺病毒3）病毒滴高，產(chǎn)生病毒經(jīng)過濃縮后可以達(dá)到1012PFU/mL，能有效的進(jìn)增殖。4）腺病毒載體感染宿主的范圍比較廣，制備容，操作簡單.5）感染細(xì)胞時(shí)，整合到染色體中，存在激活致癌基因或插入突變等危險(xiǎn)，生物安全性高。腺病毒包裝簡要程構(gòu)建表達(dá)siRNA/miRNA的腺病毒載體2）采用PacI消'化純化的質(zhì)。3）消化好的腺病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，收獲細(xì)胞以制備病毒粗提液。4）將病毒粗提液感染293A細(xì)胞以擴(kuò)增病毒。5）分裝，-80℃保存。慢病毒和腺病毒的比較完美WORD格式編輯

專業(yè)資料整理分享慢病毒載體系統(tǒng)和腺演毒載體系統(tǒng)比較網(wǎng)毒表達(dá)系統(tǒng)慢病毒去達(dá)系筑VLentivirus）腺病毒表達(dá)系統(tǒng)tAdenoYirus）病毒基因組RNA病得雙鏈DNA病壽復(fù)制白主復(fù)制自主復(fù)制是否整合病毒基因蛆整合于宿主基因組.長時(shí)同,穩(wěn)定表達(dá)外游基因病旅某因組游離于宿主基因殂外，瞬時(shí)表達(dá)外源顯因感染細(xì)胞類型感染打裂和不分裂細(xì)胞，適用于難轉(zhuǎn)染的嘲（細(xì)胞（如沖經(jīng)細(xì)胞1及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)感染分裂和不分裂細(xì)胞表達(dá)風(fēng)度中水平表達(dá)高水平表達(dá) ：表達(dá)時(shí)間慢（1-3天）快（1-2天）滴度漪度最高叮達(dá)lirSpfLJ/ml滴度最高??「達(dá)1口*11pfU/nt]克隆容量可插入不超過8kb的外源片段r清度睡插入片段長度增加而降低可插入高達(dá)8匹的外源Ji,段，滴度隨插入片段長度增加而降低免疫原性低免疫原性高免疫原性2、構(gòu)建目的基因到載體構(gòu)建手段一般是根據(jù)原始質(zhì)信息確定克方案，有以下兩種手段。1）如果原始質(zhì)與載體有匹配酶位點(diǎn)，采用相應(yīng)的內(nèi)酶下相應(yīng)片段，回收并連接到坪體，酶，并測序鑒定完美WORD格式編輯

專業(yè)資料整理分享PCR擴(kuò)增，得到一并2PCR擴(kuò)增，得到一并目的片段，采用相應(yīng)的內(nèi)酶下相應(yīng)片段，回收并連接到穿梭載體，酶，測序鑒定質(zhì)載體概能夠進(jìn)自主復(fù)制的環(huán)狀 DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，包括其核生物的細(xì)胞器（主要布線體和葉綠體）中和細(xì)菌細(xì)胞擬林區(qū)以外的環(huán)狀脫氧核核酸（DNA）分子特征質(zhì)上常有抗生素的抗性基因，如，四環(huán)素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些質(zhì)稱為附加體（episome），這類質(zhì)能夠整合進(jìn)真菌的染色體，也能從整合位置上浮下來成為游離于染色體外的DNA分子。質(zhì)在宿主細(xì)胞體內(nèi)外可復(fù)制。通過個(gè)些特性，人們可以把一些目的DNA片斷構(gòu)建在質(zhì)中， 通過轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中，用選擇培養(yǎng)基來篩選從不斷的復(fù)制，來得到目的產(chǎn)物。3、質(zhì)DNA在大腸桿菌轉(zhuǎn)化連接上目的基因的質(zhì)轉(zhuǎn)化大腸桿菌是為讓目的基因在大腸桿菌擴(kuò)增， 然后提取質(zhì)，以下是質(zhì)DNA在大腸桿菌轉(zhuǎn)化的三步驟。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備完美WORD格式編輯專業(yè)資料整理分享1）從大腸桿菌平板上挑取一個(gè)單菌于 3mlLB培養(yǎng)基的試管中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。2）取0.4ml菌液轉(zhuǎn)接到40mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2?3h3）菌液轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，冰上放置10min4）4℃離心10min（4000r/min）5）倒出培養(yǎng)液，將管口倒置以培養(yǎng)液盡6）用冰浴的0.1mol/L氯化第10ml懸浮細(xì)胞沉淀，即冰浴 30min7）4℃離心10min（4000r/min）8）倒出上清液，用冰浴的0.1mol/L氯化第2ml懸浮細(xì)胞（冰上放置）9）分裝細(xì)胞，200ul一份，4℃保存質(zhì)DNA的轉(zhuǎn)化取200ul新鮮制備的感受態(tài)細(xì)胞，加入質(zhì)DNA2ul混勻，冰浴30min2）離心管放到42℃保溫90s3）冰浴2min4）每管加800ulLB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)1h（150r/min）5）取適當(dāng)體積（100ul）的復(fù)蘇細(xì)胞，涂布在選擇性培養(yǎng)基上，正直30min完美word格式編輯專業(yè)資料整理分享6）倒置平皿37℃，12?16h，出現(xiàn)菌質(zhì)提取步驟1）取1?4ml在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜的菌液，12000轉(zhuǎn)離心1min，棄上清2）加250ul溶液1/RNaseA（溶液1為細(xì)胞懸浮液）混合液，漩渦劇振蕩直至菌體完全重新懸浮，室溫靜置1-2min。3）加入250ul：Q^n（細(xì)胞解液），輕柔的反復(fù)顛倒混勻 5-6次。室溫放置1-2min，使菌體充分解，直至形成澄清的解溶液。4）加入350譏溶液山（中和液），刻輕柔地反復(fù)顛倒混勻 5-6次，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。5）12000室溫離心10min，收集上清。6）將上清置于DNA純化柱中，靜置1-2min。7）12000轉(zhuǎn)離心1min，棄濾液。8）加入500ul溶液PB（洗滌液）12000轉(zhuǎn)離心1min，棄濾液，目的是將硅膠膜上吸附的蛋白、鹽等雜質(zhì)洗脫，以獲得高質(zhì)質(zhì)DNA。9）加入500ul溶液W（金鹽液），12000轉(zhuǎn)離心1min，棄濾液，重復(fù)一次。10）12000轉(zhuǎn)離心3min，以徹底去除純化柱中殘的液體。完美word格式編輯苗域隼璘ayoM美等。*戲3鄉(xiāng)貓1期區(qū)目修，期包噪?yún)^(qū)票全產(chǎn)a￡=幺蚌田理陀蛋庫匚恁，方好石長以包，電、【」久瀚上中產(chǎn)幺即區(qū)后洋：電幺久％」加。事攻苓考小品餐酒'?TM日桂母范舉E小悵袤用韶匚亳"J港'%'期區(qū)XT調(diào)丫5JT些工▼0MS范舉'石書”&區(qū)￡6%戶飛現(xiàn)區(qū)工￡6%11力戲麒小2I'f（荽學(xué)童妙比）童妙石《現(xiàn)區(qū)1€63悵袤才幺荽學(xué)用*4VNQi、廿岑強(qiáng)50%->酒。-匚艮口曲號(hào)幺￡部，艮兌華干皴一一5叫口裁袤000415叫理港，樂t?津酒”。卬譏口08?09入一產(chǎn)艮口裁I嗎」中驍y皴艮^牌部——utuii口裁袤00031艮口裁1%名埒艮^部——鱉一算星，裂挈拉，utuii口裁袤OOOZIZMJOJjnginOOg”——裂挈史5叫口堂袤000411從」。月叫1n003”——毅挈拉，UTUII口裁袤（WO"（1%）i兌華5<%匝皴袤裂也廠峭——UTUIQI"，裁000ZI袤夠l「4墓%」。月明1n0% 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70%"上第四天：.轉(zhuǎn)染后48和72h分別收獲含病毒的」清。2.3000rpm離心20min，0.45um濾膜過濾，去除細(xì)胞沉淀。3.12000轉(zhuǎn)離心濃縮細(xì)胞、分裝-80。貯存。完美WORD格式編輯專業(yè)資料整理分享4.滴測定目的基因檢定，并出具檢測報(bào)告。4.3病毒包裝的原質(zhì)DNA為能轉(zhuǎn)錄出慢病毒遺傳物質(zhì)（RNA），但能翻譯出慢病毒的外殼及蛋白成分的載體質(zhì)，其同時(shí)連有目的基因和報(bào)告基因，psPAX2為能表達(dá)慢病毒外殼的質(zhì)，其表達(dá)產(chǎn)物可通過粘附機(jī)制穿過細(xì)胞膜， pMD2.G為慢病毒的膜蛋白質(zhì)，通過 lipofectamine2000進(jìn)三質(zhì)共轉(zhuǎn)到靶細(xì)胞基因組中，宿主基因組在表達(dá)時(shí)，隨宿主基因轉(zhuǎn)錄出的目的基因RNA與psPAX2、pMD2.G基因翻譯出的蛋白組裝為慢病毒。在上述程序中提及的“第四天收集病毒。在第五天再用該病毒感染靶細(xì)胞，病毒進(jìn)入細(xì)胞后，其遺傳物質(zhì)RNA反轉(zhuǎn)錄出DNA，該基因再整合到春細(xì)胞的基因組中，完成轉(zhuǎn)染過程，因?yàn)橘|(zhì)DNA只能轉(zhuǎn)錄出病毒RNA和表達(dá)目的基因卻能表達(dá)出病毒的外殼和膜蛋白成分，因此其能像普通的病毒一樣在宿主細(xì)胞能反復(fù)增殖，故對宿主細(xì)胞是無害的并且高效的將目的基因轉(zhuǎn)然到靶細(xì)胞基因組中。5、慢病毒感染細(xì)胞程圖完美WORD格式編輯專業(yè)資料整理分享LetiliviralEKpressjonSysEemi感染步驟1）單板：將對數(shù)生長期的細(xì)胞消化重懸后，按1米105/L密接種于 12孔板，生長過夜2）感染：將70-80%鋪滿12孔板中的培養(yǎng)液吸除，換新鮮的培養(yǎng)液，同時(shí)加入PBS濃梯稀釋的病毒液，混合均勻后即可放入孵箱培養(yǎng)。3）24h左右可換液，48小時(shí)即可看熒光，具體根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)來看。熒光顯微鏡的操作程打開熒光器（30min內(nèi)能關(guān)閉，否則影響顯微鏡壽命），細(xì)胞培養(yǎng)板置于載物臺(tái)，調(diào)節(jié)物鏡和光圈，先用自然光觀察視野內(nèi)細(xì)胞，再關(guān)閉光，開啟熒光通道，觀察熒光強(qiáng)，判定感染。 圖片取樣前可以調(diào)節(jié)曝光時(shí)間，增值和彩色使熒光照片最完美。（針對leica）注意事項(xiàng)內(nèi)容完美WORD格式編輯專業(yè)資料整理分享.病毒濃要適宜，太少的話細(xì)胞被感染的也少，但是病毒濃太大，對細(xì)胞有傷害。.感染病毒時(shí)培養(yǎng)基少，以保證病毒的濃，在培養(yǎng)10h左右可根據(jù)培養(yǎng)基第色加培養(yǎng)基。.在明確細(xì)胞感染復(fù)數(shù)情況下，可進(jìn)濃梯感染，計(jì)算細(xì)胞感染復(fù)數(shù)。.在加病毒后一般24h左右可換液，48小時(shí)即可看熒光，具體時(shí)間根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)來看。6、感染后的細(xì)胞檢測方法熒光初步檢測有熒光，則表示病毒感染成功，但并能確定目的基因是否整合到細(xì)胞中， 待進(jìn)一步檢測，熒光有強(qiáng)弱之分，與病毒加入的有關(guān)。RNA的提取及RT-PCR檢測原因?yàn)檎婧思?xì)胞DNA含有很多非編碼區(qū)，真核生物的DNA轉(zhuǎn)錄成為RNA之后，經(jīng)過剪和拼接，去掉這些非編碼區(qū)，才能形成真正的mRNA，，是否表達(dá)其核生物的基因并表達(dá)相應(yīng)的蛋白，只能通過提取其mRNA并RT-PCR這條途徑來測定RNA提取步驟完美WORD格式編輯專業(yè)資料整理分享加ImlTrizol，吹打后移至1.5ml無菌的離心管中；加100ul氯仿劇振蕩30s混勻，12000轉(zhuǎn)15min，可看到明顯分層；取上層透明液體至新的1.5ml離心管中，外等體積的異丙醇，混勻靜置10min，12000轉(zhuǎn)離心10min，棄上清，加1ml70%乙醇，12000轉(zhuǎn)，離心10min，棄上清，及干剩余液體，最后加DEPC-水溶解RNA，電泳，粗步判定RNA純。RT-PCR步驟：RT是一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄的過程，用前一天提取好的總RNA，在加入引物，模版和酶，并在PCR儀的溫設(shè)置下，RNA可逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR是cDNA在模版，引物，酶的作用下進(jìn)復(fù)制成雙鏈DNA。（具體步驟）蛋白提取及Western檢測western-Bloting:蛋白免疫印跡（Westernblotting或Immunoblotting）一般由凝膠電泳、樣品的印跡和免疫學(xué)檢測三個(gè)部分組成。第一步是做SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，使待測樣品中的蛋白質(zhì)按分子大小在凝膠中分成帶。第二步把凝膠中已分成條帶的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到一種