分子雜交與印跡技術(shù)

MolecularHybridization&Blotting

Technology自學(xué)內(nèi)容2分子雜交技術(shù)共39頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁(yè)!核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)在DNA復(fù)性過(guò)程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對(duì)關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜交雙鏈(heteroduplex)。一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理自學(xué)內(nèi)容2分子雜交技術(shù)共39頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁(yè)!復(fù)性RNADNA自學(xué)內(nèi)容2分子雜交技術(shù)共39頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁(yè)!（一）印漬技術(shù)

Blotting首先由EdwenSouthern在1975年提出。Blotting即“印漬”，指將存在于凝膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移（印漬）到固定化介質(zhì)上并加以檢測(cè)分析的技術(shù)，目前廣泛應(yīng)用于DNA、RNA、和蛋白質(zhì)的檢測(cè)。

自學(xué)內(nèi)容2分子雜交技術(shù)共39頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁(yè)!（一）DNA印跡技術(shù)

Southernblotting又稱為Southern雜交，即DNA-DNA雜交分析，是研究DNA圖譜的基本技術(shù)，主要用于基因組DNA的分析，如在基因組中特異基因的定位及檢測(cè)等，在遺傳診斷DNA圖譜分析及PCR產(chǎn)物分析等方面有重要價(jià)值。自學(xué)內(nèi)容2分子雜交技術(shù)共39頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁(yè)!PaperTowelsSouthernBlottingtissueSDS蛋白酶K酚/氯仿無(wú)水乙醇離心自學(xué)內(nèi)容2分子雜交技術(shù)共39頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁(yè)!（三）蛋白質(zhì)印漬技術(shù)

Westernblotting又稱為Western雜交，或免疫印漬技術(shù)，即利用抗原-抗體反應(yīng)，檢測(cè)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上的特異性蛋白質(zhì)。應(yīng)用：用于檢測(cè)樣品中特異性蛋白質(zhì)的存在、細(xì)胞中特異蛋白質(zhì)的半定量分析以及蛋白質(zhì)分子的相互作用研究等。

自學(xué)內(nèi)容2分子雜交技術(shù)共39頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁(yè)!（一）DNA印跡技術(shù)(Southernblotting)用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。（二）RNA印跡技術(shù)(Northernblotting)

用于RNA的定性定量分析。（三）蛋白質(zhì)的印跡分析(Westernblotting)

用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。自學(xué)內(nèi)容2分子雜交技術(shù)共39頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁(yè)!Northern印跡雜交(Northernbloting)檢測(cè)RNA（主要是mRNA）的方法與Southern雜交的不同靶核酸：RNARNA電泳轉(zhuǎn)膜：不需變性自學(xué)內(nèi)容2分子雜交技術(shù)共39頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁(yè)!斑點(diǎn)印跡

Dotblotting斑點(diǎn)雜交法是不經(jīng)過(guò)電泳，而將被檢標(biāo)本直接點(diǎn)到膜上，烘烤固定，用于雜交。這種方法耗時(shí)短，可做半定量分析，一張膜上可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品。自學(xué)內(nèi)容2分子雜交技術(shù)共39頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第10頁(yè)!原位雜交(insituhybridization)將標(biāo)記的核酸探針與細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交，稱為原位雜交。特點(diǎn)能在成分復(fù)雜的組織中進(jìn)行單一細(xì)胞的研究不需從組織或細(xì)胞中提取核酸，對(duì)含量極低的靶序列靈敏度高能準(zhǔn)確反映組織細(xì)胞的相互關(guān)系及功能狀態(tài)自學(xué)內(nèi)容2分子雜交技術(shù)共39頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第11頁(yè)!自學(xué)內(nèi)容2分子雜交技術(shù)共39頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第12頁(yè)!探針技術(shù)

probe將一小段已知序列的核酸片段用放射性同位素、生物素或熒光染料對(duì)它的末端或全鏈進(jìn)行進(jìn)行標(biāo)記，稱為“探針”然后用于分子雜交，雜交后通過(guò)放射自顯影、熒光檢測(cè)或顯色技術(shù)，使雜交區(qū)帶顯現(xiàn)出來(lái)自學(xué)內(nèi)容2分子雜交技術(shù)共39頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第13頁(yè)!探針標(biāo)記方法缺口平移法(nicktranslation)隨機(jī)引物法(randomprimer)：六核苷酸殘基的引物PCR標(biāo)記法末端標(biāo)記法探針的純化自學(xué)內(nèi)容2分子雜交技術(shù)共39頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第14頁(yè)!自學(xué)內(nèi)容2分子雜交技術(shù)共39頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第15頁(yè)!自學(xué)內(nèi)容2分子雜交技術(shù)共39頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第16頁(yè)!自學(xué)內(nèi)容2分子雜交技術(shù)共39頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第17頁(yè)!蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)

ResearchTechnologyofInteractionofProtein自學(xué)內(nèi)容2分子雜交技術(shù)共39頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第18頁(yè)!酵母雙雜交各種親和分析（親和色譜、免疫共沉淀等）熒光共振能量轉(zhuǎn)換效應(yīng)分析噬菌體顯示系統(tǒng)篩選等等常用蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)自學(xué)內(nèi)容2分子雜交技術(shù)共39頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第19頁(yè)!DNA遷移率變動(dòng)試驗(yàn)(DNAmobilityshiftassay)，又叫凝膠阻滯試驗(yàn)，是一種體外研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的特殊凝膠電泳技術(shù).基本原理為:在凝膠電泳中，由于電場(chǎng)的作用，小分子DNA片段比其結(jié)合了蛋白質(zhì)的DNA片段向陽(yáng)極移動(dòng)的速度快，因此，可標(biāo)記短的雙鏈DNA片段，將其與蛋白質(zhì)混合，對(duì)混合物進(jìn)行凝膠電泳。若目的DNA與特異性蛋白質(zhì)結(jié)合，其向陽(yáng)極移動(dòng)的速度受到阻滯，對(duì)凝膠進(jìn)行放射性自顯影，就可找到DNA結(jié)合蛋白.自學(xué)內(nèi)容2分子雜交技術(shù)共39頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第20頁(yè)!表達(dá)序列標(biāo)簽技術(shù)（EST，ExpressedSequenceTags）:此技術(shù)以大規(guī)模cDNA測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)，即提取生物體的mRNA，進(jìn)一步獲得cDNA文庫(kù)，挑選其中300—500bp的部分（即EST序列）進(jìn)行序列測(cè)定，然后通過(guò)生物信息學(xué)手段得到全長(zhǎng)的基因序列。通常EST序列位于一段cDNA的3’—端非翻譯區(qū)，也可以在該cDNA中隨機(jī)選取。利用EST技術(shù)克隆基因及功能分析，使克隆和定位新基因的策略發(fā)生了巨大變革。自學(xué)內(nèi)容2分子雜交技術(shù)共39頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第21頁(yè)!二、印漬技術(shù)的類(lèi)別及應(yīng)用DNA印跡技術(shù)SouthernblottingRNA印跡技術(shù)Northernblotting蛋白質(zhì)印跡技術(shù)Westernblotting斑點(diǎn)印跡Dotblotting原位雜交insituhybridizationDNA點(diǎn)陣DNAarrayDNA芯片技術(shù)DNAchip自學(xué)內(nèi)容2分子雜交技術(shù)共39頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第22頁(yè)!基本方法將DNA標(biāo)本用限制性內(nèi)切酶消化后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離各酶解片段；經(jīng)堿變性，Tris緩沖液中和，高鹽下通過(guò)電轉(zhuǎn)移將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素濾膜上，烘干固定，凝膠中DNA片段的相對(duì)位置在DNA片段轉(zhuǎn)移到濾膜的過(guò)程中繼續(xù)保持著。附著在濾膜上的DNA與32P標(biāo)記的探針雜交，利用放射自顯影術(shù)確定探針互補(bǔ)的每條DNA帶的位置，確定在眾多酶解產(chǎn)物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。自學(xué)內(nèi)容2分子雜交技術(shù)共39頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第23頁(yè)!（二）RNA印漬技術(shù)

Northernblotting又稱為Northern雜交，即RNA-DNA雜交分析。是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上的方法。主要用于檢測(cè)某一組織或細(xì)胞中已知的特異mRNA的表達(dá)水平以及比較不同組織和細(xì)胞的同一基因的表達(dá)情況。自學(xué)內(nèi)容2分子雜交技術(shù)共39頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第24頁(yè)!三種印跡技術(shù)的比較自學(xué)內(nèi)容2分子雜交技術(shù)共39頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第25頁(yè)!Southern雜交的主要步驟待測(cè)DNA樣品的制備、酶切待測(cè)DNA樣品的電泳分離：瓊脂糖凝膠電泳凝膠中DNA的變性：堿變性Southern轉(zhuǎn)膜：硝酸纖維素(NC)膜、尼龍膜毛細(xì)管虹吸印跡法、電轉(zhuǎn)印法、真空轉(zhuǎn)移法探針的制備Southern雜交雜交結(jié)果的檢測(cè)自學(xué)內(nèi)容2分子雜交技術(shù)共39頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第26頁(yè)!Western雜交印跡法(Westernbloting)檢測(cè)蛋白質(zhì)，即將電泳分離的非標(biāo)記蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體上，用特異的抗血清對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定及定量的方法主要步驟：蛋白質(zhì)樣品的制備聚丙烯酰胺凝膠蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移：尼龍膜靶蛋白的免疫學(xué)檢測(cè)靶蛋白于抗體（一抗）反應(yīng)與標(biāo)記的第二抗體（酶標(biāo)二抗）反應(yīng)顯色反應(yīng)：酶促反應(yīng)自學(xué)內(nèi)容2分子雜交技術(shù)共39頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第27頁(yè)!原位雜交

insituhybridization即組織原位雜交，指組織切片或細(xì)胞涂片直接用于雜交分析。先經(jīng)適當(dāng)處理，使細(xì)胞通透性增加，讓探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA或RNA雜交。因此原位雜交可以確定探針的互補(bǔ)序列在胞內(nèi)的空間位置，這一點(diǎn)具有重要生物學(xué)和病理學(xué)意義。自學(xué)內(nèi)容2分子雜交技術(shù)共39頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第28頁(yè)!核酸原位雜交的基本步驟細(xì)胞或組織的固定：載玻片組織細(xì)胞雜交前的預(yù)處理用去垢劑或蛋白酶除去核酸表面蛋白質(zhì)探針的選擇和標(biāo)記雜交雜交結(jié)果檢測(cè)自學(xué)內(nèi)容2分子雜交技術(shù)共39頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第29頁(yè)!FISH（fluorescenceinsituhybridization）技術(shù)是一種重要的非放射性原位雜交技術(shù)。它的基本原理是:如果被檢測(cè)的染色體或靶DNA與所用的核酸探針是同源互補(bǔ)的，二者經(jīng)變性-退火-復(fù)性，即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。將核酸探針的某一種核苷酸標(biāo)記上報(bào)告分子如生物素、地高辛，可利用該報(bào)告分子與熒光素標(biāo)記的特異親和素之間的免疫化學(xué)反應(yīng)，經(jīng)熒光檢測(cè)體系在鏡下對(duì)待測(cè)DNA進(jìn)行定性、定量或相對(duì)定位分析。自學(xué)內(nèi)容2分子雜交技術(shù)共39頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第30頁(yè)!探針的標(biāo)記探針的種類(lèi)cDNA探針、基因組DNA探針、寡核苷酸探針、RNA探針標(biāo)記物核素標(biāo)記物（同位素標(biāo)記）：32P、35S、3H等非核素標(biāo)記物（非同位素標(biāo)記）：生物素、地高辛、熒光素等自學(xué)內(nèi)容2分子雜交技術(shù)共39頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第31頁(yè)!自學(xué)內(nèi)容2分子雜交技術(shù)共39頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第32頁(yè)!自學(xué)內(nèi)容2分子雜交技術(shù)共39頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第33頁(yè)!自學(xué)內(nèi)容2分子雜交技術(shù)共39頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第34頁(yè)!自學(xué)內(nèi)容2分子雜交技術(shù)共39頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第35頁(yè)!蛋白質(zhì)之間相互作用以及通過(guò)相互作用而形成的蛋白復(fù)合物是細(xì)胞各種基本功能的主要完成者。幾乎所有的重要生命活動(dòng)，包括DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)的合成與分泌、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝等等，都離不開(kāi)蛋白質(zhì)之間的相互作用。蛋白質(zhì)之間相互作用研究的重要性自學(xué)內(nèi)容2分子雜交技術(shù)共39頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第36頁(yè)!常用DNA和蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù):DNA凝膠阻滯試驗(yàn)DNaseⅠ足跡試驗(yàn)自學(xué)內(nèi)容2分子雜交技術(shù)共39頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第37頁(yè)!DNaseⅠ足跡試驗(yàn):足跡試驗(yàn)不僅能找到與特異性DNA結(jié)合的目標(biāo)蛋白，而且能告知目標(biāo)蛋白結(jié)合在哪些堿基部位，基本原理是蛋白結(jié)合在DNA片段上，保護(hù)結(jié)合部位不被DNase破壞，這樣，蛋白質(zhì)在DNA片段上留下了“足跡”，在電泳凝膠的放射性自顯影圖片上，相應(yīng)于蛋白質(zhì)結(jié)合的部位沒(méi)有放射性標(biāo)記條帶.自學(xué)內(nèi)容2分子雜交技術(shù)共39頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第38頁(yè)!基因打靶技術(shù)是一種定向改變生物活體遺傳信息的實(shí)驗(yàn)手段，它的產(chǎn)生和發(fā)展建立在胚胎干細(xì)胞技術(shù)(ES)和同源