枯草芽孢桿菌的分離純化枯草芽孢桿菌的分離純化1目錄菌種簡介分離步驟生理生化鑒定發(fā)酵條件的優(yōu)化脂肽類抗生素的提取——酸沉淀法脂肽類抗生素的HPLC定量檢測討論目錄菌種簡介2菌種簡介

無莢膜，周生鞭毛，革蘭氏陽性菌，有芽孢，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，需氧菌?？衫玫鞍踪|(zhì)、多種糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。廣泛分布在土壤及腐敗的有機物中。菌種簡介無莢膜，周生鞭毛，革蘭氏陽性菌，有芽孢3

枯草芽孢桿菌在自然生長和發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生的脂肽類抗生素具有很強的抗真菌、病毒、腫瘤、支原體活性，在防治植物病害上具有廣闊的應(yīng)用前景。枯草芽孢桿菌在自然生長和發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生的脂肽類4分離原理芽孢桿菌能產(chǎn)生芽孢，在沸水中加熱不會失去生理活性，但是不能產(chǎn)生芽孢的細菌會失去活性，因而得到芽孢菌屬，經(jīng)過進一步的分離及生理生化鑒定得到枯草芽孢桿菌。分離原理芽孢桿菌能產(chǎn)生芽孢，在沸水中加熱不會失5分離步驟（1）土樣的采集：取土壤表層5-10cm下的肥土100g左右，把采得的土壤放入紙袋帶回實驗室分離。分離步驟（1）土樣的采集：取土壤表層5-10cm下的肥土106（2）平板的制備：溶化三角瓶中的牛肉湯蛋白胨培養(yǎng)基，以每皿20ml左右倒6個平板。（2）平板的制備：溶化三角瓶中的牛肉湯蛋白胨培養(yǎng)基，以每皿27將純化的菌種轉(zhuǎn)接至LB平板上,37℃培養(yǎng)24h,用接種環(huán)取活化菌種,接種于100mlLB液體培養(yǎng)基,30℃、200r/min培養(yǎng)24h作為種子菌。無莢膜，周生鞭毛，革蘭氏陽性菌，有芽孢，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，需氧菌。將純化的菌種轉(zhuǎn)接至LB平板上,37℃培養(yǎng)24h,用接種環(huán)取活化菌種,接種于100mlLB液體培養(yǎng)基,30℃、200r/min培養(yǎng)24h作為種子菌。廣泛分布在土壤及腐敗的有機物中。5—1mg），充分振蕩，2—5min后如培養(yǎng)液呈紅色，即為試驗陽性。培養(yǎng)基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，NaCl5g，蒸餾水1000ml。無莢膜，周生鞭毛，革蘭氏陽性菌，有芽孢，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，需氧菌。取一載玻片，在上面加一滴3—10%的過氧化氫，挑取一環(huán)菌苔，在過氧化氫溶液中涂抹，若有氣泡（氧氣）出現(xiàn)為陽性，無氣泡者為陰性。將芽孢桿菌測試菌接種于上述培養(yǎng)液中，一般于30攝氏度培養(yǎng)4天，取培養(yǎng)液（約2ml）和等量的40%NAOH相混合，加少量肌酸（約0.（1）土樣的采集：取土壤表層5-10cm下的肥土100g左右，把采得的土壤放入紙袋帶回實驗室分離。06MPa（8lbf/in2）30min滅菌脂肽類抗生素的HPLC定量檢測脂肽類抗生素的提取——酸沉淀法脂肽類抗生素的提取——酸沉淀法取一載玻片，在上面加一滴3—10%的過氧化氫，挑取一環(huán)菌苔，在過氧化氫溶液中涂抹，若有氣泡（氧氣）出現(xiàn)為陽性，無氣泡者為陰性。（4）挑菌及純化：從上述分離的平板上分別挑取單菌落中部分菌體，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上劃線純化。（1）土樣的采集：取土壤表層5-10cm下的肥土100g左右，把采得的土壤放入紙袋帶回實驗室分離。芽孢桿菌能產(chǎn)生芽孢，在沸水中加熱不會失去生理活性，但是不能產(chǎn)生芽孢的細菌會失去活性，因而得到芽孢菌屬，經(jīng)過進一步的分離及生理生化鑒定得到枯草芽孢桿菌。2%的可溶性淀粉，分裝于三角瓶。原理：不同種類的芽孢桿菌對氧氣的需求性常有差異，因此本實驗可作為鑒定芽孢桿菌的一個較重要指標。將純化的菌種轉(zhuǎn)接至LB平板上,37℃培養(yǎng)24h,用接種環(huán)取活8（4）挑菌及純化：從上述分離的平板上分別挑取單菌落中部分菌體，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上劃線純化。（菌體應(yīng)呈桿狀，具芽孢，寬度一致；菌落顏色、形狀、質(zhì)地、透明度等均一致）（4）挑菌及純化：從上述分離的平板上分別挑取單菌落中部分菌體9生理生化鑒定一過氧化氫酶測定將測試菌種接種于肉湯瓊脂斜面上，培養(yǎng)1—2天。取一載玻片，在上面加一滴3—10%的過氧化氫，挑取一環(huán)菌苔，在過氧化氫溶液中涂抹，若有氣泡（氧氣）出現(xiàn)為陽性，無氣泡者為陰性。生理生化鑒定一過氧化氫酶測定10二需氧性試驗原理：不同種類的芽孢桿菌對氧氣的需求性常有差異，因此本實驗可作為鑒定芽孢桿菌的一個較重要指標。操作步驟：菌液穿刺接種到上述培養(yǎng)基中，一般于培養(yǎng)3—7天觀察結(jié)果。若芽孢桿菌在瓊脂柱表面生長為好氧菌，沿著穿刺線上生長者為厭氧菌或兼性厭氧菌二需氧性試驗11三、乙酰甲基甲醇實驗原理：有些芽孢桿菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸，并將產(chǎn)生的酸進一步轉(zhuǎn)化為中性化合物，如乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在堿性環(huán)境中可被氧氣成二乙酰，后者與蛋白胨中精氨酸所含的胍基起作用，生成紅色化合物，即表示試驗陽性。若在培養(yǎng)基中加入少量肌酸以補充胍基，可加速反應(yīng)。培養(yǎng)基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，NaCl5g，蒸餾水1000ml。調(diào)節(jié)PH6.5，每管分裝4—5ml，0.06MPa（8lbf/in2）30min滅菌步驟：將芽孢桿菌測試菌接種于上述培養(yǎng)液中，一般于30攝氏度培養(yǎng)4天，取培養(yǎng)液（約2ml）和等量的40%NAOH相混合，加少量肌酸（約0.5—1mg），充分振蕩，2—5min后如培養(yǎng)液呈紅色，即為試驗陽性。三、乙酰甲基甲醇實驗12四淀粉水解原理：許多芽孢桿菌產(chǎn)生淀粉酶，能將培養(yǎng)基中的淀粉水解，淀粉水解后，遇碘不再變藍色。培養(yǎng)基：在肉湯瓊脂中添加0.2%的可溶性淀粉，分裝于三角瓶。0.1MPa(15lbf/in2)20min滅菌備用。步驟：將培養(yǎng)基做成平板，凝固后取菌種點種于平板上（每皿點種2點），一般于30攝氏度培養(yǎng)2—4天，形成菌落后，在平板上滴加碘液，以鋪滿菌落為度，平板呈藍色，而菌落周圍如有無色透明圈出現(xiàn)，說明淀粉被水解，透明圈的大小，可表明水解能力的大小。四淀粉水解13經(jīng)生理生化鑒定，確定是芽孢桿菌屬純種后，從中選擇一株轉(zhuǎn)接于牛肉膏蛋白胨斜面上，置37℃培養(yǎng)1-2天后備用經(jīng)生理生化鑒定，確定是芽孢桿菌屬純種后，從中選14發(fā)酵條件的優(yōu)化將純化的菌種轉(zhuǎn)接至LB平板上,37℃培養(yǎng)24h,用接種環(huán)取活化菌種,接種于100mlLB液體培養(yǎng)基,30℃、200r/min培養(yǎng)24h作為種子菌。發(fā)酵條件的優(yōu)化將純化的菌種轉(zhuǎn)接至LB平板上,315發(fā)酵過程中采用單因素試驗方法,考察不同培養(yǎng)溫度(26、28、30、32、34、36℃)、培養(yǎng)時間(26、32、38、44、50、80h)、接種量(1%、2%、3%、5%、10%)、初始pH值(5、6、7、8、9)、培養(yǎng)基(Landy培養(yǎng)基、Landy修飾培養(yǎng)基Ⅰ、Landy修飾培養(yǎng)基Ⅱ、LB培養(yǎng)基、無機鹽培養(yǎng)基)對脂肽類抗生素產(chǎn)量的影響。發(fā)酵過程中采用單因素試驗方法,考察不同培養(yǎng)溫16結(jié)果表明,最佳培養(yǎng)條件為Landy培養(yǎng)基,初始pH7·0,接種量3%,發(fā)酵培養(yǎng)溫度30℃,發(fā)酵時間38h。結(jié)果表明,最佳培養(yǎng)條件為Landy培養(yǎng)基,初始17脂肽類抗生素的提取——酸沉淀法培養(yǎng)結(jié)束后,7000r/min離心10min,取上清，加HCl調(diào)節(jié)pH為5·0、4·5、4·0、3·5、3·0、2·5、2·0,7000r/min離心10min,收集沉淀。將沉淀在60℃的烘箱中干燥18h,稱重即為脂肽類抗生素粗提物的干重。比較不同pH條件下沉淀的干重,以確定完全沉淀脂肽類抗生素所需的最佳pH值。脂肽類抗生素的提取——酸沉淀法培養(yǎng)結(jié)束后,7018（1）土樣的采集：取土壤表層5-10cm下的肥土100g左右，把采得的土壤放入紙袋帶回實驗室分離。06MPa（8lbf/in2）30min滅菌經(jīng)生理生化鑒定，確定是芽孢桿菌屬純種后，從中選擇一株轉(zhuǎn)接于牛肉膏蛋白胨斜面上，置37℃培養(yǎng)1-2天后備用枯草芽孢桿菌在自然生長和發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生的脂肽類抗生素具有很強的抗真菌、病毒、腫瘤、支原體活性，在防治植物病害上具有廣闊的應(yīng)用前景。（1）土樣的采集：取土壤表層5-10cm下的肥土100g左右，把采得的土壤放入紙袋帶回實驗室分離?？莶菅挎邨U菌的分離純化將純化的菌種轉(zhuǎn)接至LB平板上,37℃培養(yǎng)24h,用接種環(huán)取活化菌種,接種于100mlLB液體培養(yǎng)基,30℃、200r/min培養(yǎng)24h作為種子菌。脂肽類抗生素的提取——酸沉淀法廣泛分布在土壤及腐敗的有機物中。2%的可溶性淀粉，分裝于三角瓶。無莢膜，周生鞭毛，革蘭氏陽性菌，有芽孢，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，需氧菌。培養(yǎng)基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，NaCl5g，蒸餾水1000ml。將測試菌種接種于肉湯瓊脂斜面上，培養(yǎng)1—2天。芽孢桿菌能產(chǎn)生芽孢，在沸水中加熱不會失去生理活性，但是不能產(chǎn)生芽孢的細菌會失去活性，因而得到芽孢菌屬，經(jīng)過進一步的分離及生理生化鑒定得到枯草芽孢桿菌。（1）土樣的采集：取土壤表層5-10cm下的肥土100g左右，把采得的土壤放入紙袋帶回實驗室分離。若在培養(yǎng)基中加入少量肌酸以補充胍基，可加速反應(yīng)。廣泛分布在土壤及腐敗的有機物中。菌落顏色、形狀、質(zhì)地、透明度等均一致）培養(yǎng)基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，NaCl5g，蒸餾水1000ml。枯草芽孢桿菌的分離純化5，每管分裝4—5ml，0.脂肽類抗生素的HPLC定量檢測將脂肽類抗生素粗提物過SephadexLH-20層析柱，每管收集液分別經(jīng)真空干燥后,加入0·2ml乙醇溶解。對每管乙醇溶液進行平板抑菌試驗,試驗真菌為油菜菌核病菌,將具有抑菌活性的收集液合并在一起,用離心濃縮儀濃縮至完全干燥,即為脂肽類抗生素的干重。（1）土樣的采集：取土壤表層5-10cm下的肥土100g左右19原理：許多芽孢桿菌產(chǎn)生淀粉酶，能將培養(yǎng)基中的淀粉水解，淀粉水解后，遇碘不再變藍色。5，每管分裝4—5ml，0.（菌體應(yīng)呈桿狀，具芽孢，寬度一致；（1）土樣的采集：取土壤表層5-10cm下的肥土100g左右，把采得的土壤放入紙袋帶回實驗室分離。取一載玻片，在上面加一滴3—10%的過氧化氫，挑取一環(huán)菌苔，在過氧化氫溶液中涂抹，若有氣泡（氧氣）出現(xiàn)為陽性，無氣泡者為陰性。比較不同pH條件下沉淀的干重,以確定完全沉淀脂肽類抗生素所需的最佳pH值。乙酰甲基甲醇在堿性環(huán)境中可被氧氣成二乙酰，后者與蛋白胨中精氨酸所含的胍基起作用，生成紅色化合物，即表示試驗陽性。脂肽類抗生素的提取——酸沉淀法脂肽類抗生素的提取——酸沉淀法脂肽類抗生素的HPLC定量檢測取一載玻片，在上面加一滴3—10%的過氧化氫，挑取一環(huán)菌苔，在過氧化氫溶液中涂抹，若有氣泡（氧氣）出現(xiàn)為陽性，無氣泡者為陰性。5，每管分裝4—5ml，0.廣泛分布在土壤及腐敗的有機物中。將純化的菌種轉(zhuǎn)接至LB平板上,37℃培養(yǎng)24h,用接種環(huán)取活化菌種,接種于100mlLB液體培養(yǎng)基,30℃、200r/min培養(yǎng)24h作為種子菌。取一載玻片，在上面加一滴3—10%的過氧化氫，挑取一環(huán)菌苔，在過氧化氫溶液中涂抹，若有氣泡（氧氣）出現(xiàn)為陽性，無氣泡者為陰性。廣泛分布在土壤及腐敗的有機物中。原理：許多芽孢桿菌產(chǎn)生淀粉酶，能將培養(yǎng)基中的淀粉水解，淀粉水解后，遇碘不再變藍色。脂肽類抗生素的提取——酸沉淀法培養(yǎng)基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，NaCl5g，蒸餾水1000ml。廣泛分布在土壤及腐敗的有機物中。發(fā)酵過程中采用單因素試驗方法,考察不同培養(yǎng)溫度(26、28、30、32、34、36℃)、培養(yǎng)時間(26、32、38、44、50、80h)、接種量(1%、2%、3%、5%、10%)、初始pH值(5、6、7、8、9)、培養(yǎng)基(Landy培養(yǎng)基、Landy修飾培養(yǎng)基Ⅰ、Landy修飾培養(yǎng)基Ⅱ、LB培養(yǎng)基、無機鹽培養(yǎng)基)對脂肽類抗生素產(chǎn)量的影響。脂肽類抗生素的提取——酸沉淀法（4）挑菌及純化：從上述分離的平板上分別挑取單菌落中部分菌體，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上劃線純化。將沉淀在60℃的烘箱中干燥18h,稱重即為脂肽類抗生素粗提物的干重。原理：許多芽孢桿菌產(chǎn)生淀粉酶，能將培養(yǎng)基中的淀粉水解，淀粉水解后，遇碘不再變藍色。廣泛分布在土壤及腐敗的有機物中。（菌體應(yīng)呈桿狀，具芽孢，寬度一致；將測試菌種接種于肉湯瓊脂斜面上，培養(yǎng)1—2天。廣泛分布在土壤及腐敗的有機物中。脂肽類抗生素的提取——酸沉淀法原理：不同種類的芽孢桿菌對氧氣的需求性常有差異，因此本實驗可作為鑒定芽孢桿菌的一個較重要指標。（1）土樣的采集：取土壤表層5-10cm下的肥土100g左右，把采得的土壤放入紙袋帶回實驗室分離。培養(yǎng)基：在肉湯瓊脂中添加0.若芽孢桿菌在瓊脂柱表面生長為好氧菌，沿著穿刺線上生長者為厭氧菌或兼性厭氧菌06MPa（8lbf/in2）30min滅菌06MPa（8lbf/in2）30min滅菌（1）土樣的采集：取土壤表層5-10cm下的肥土100g左右，把采得的土壤放入紙袋帶回實驗室分離。1MPa(15lbf/in2)20min滅菌備用。06MPa（8lbf/in2）30min滅菌脂肽類抗生素的HPLC定量檢測原理：不同種類的芽孢桿菌對氧氣的需求性常有差異，因此本實驗可作為鑒定芽孢桿菌的一個較重要指標。脂肽類抗生素的提取——酸沉淀法廣泛分布在土壤及腐敗的有機物中。將純化的菌種轉(zhuǎn)接至LB平板上,37℃培養(yǎng)24h,用接種環(huán)取活化菌種,接種于100mlLB液體培養(yǎng)基,30℃、200r/min培養(yǎng)24h作為種子菌。發(fā)酵過程中采用單因素試驗方法,考察不同培養(yǎng)溫度(26、28、30、32、34、36℃)、培養(yǎng)時間(26、32、38、44、50、80h)、接種量(1%、2%、3%、5%、10%)、初始pH值(5、6、7、8、9)、培養(yǎng)基(Landy培養(yǎng)基、Landy修飾培養(yǎng)基Ⅰ、Landy修飾培養(yǎng)基Ⅱ、LB培養(yǎng)基、無機鹽培養(yǎng)基)對脂肽類抗生素產(chǎn)量的影響。取一載玻片，在上面加一滴3—10%的過氧化氫，挑取一環(huán)菌苔，在過氧化氫溶液中涂抹，若有氣泡（氧氣）出現(xiàn)為陽性，無氣泡者為陰性。培養(yǎng)結(jié)束后,7000r/min離心10min,取上清，加HCl調(diào)節(jié)pH為5·0、4·5、4·0、3·5、3·0、2·5、2·0,7000r/min離心10min,收集沉淀。原理：許多芽孢桿菌產(chǎn)生淀粉酶，能將培養(yǎng)基中的淀粉水解，淀粉水解后，遇碘不再變藍色。將沉淀在60℃的烘箱中干燥18h,稱重即為脂肽類抗生素粗提物的干重。培養(yǎng)基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，NaCl5g，蒸餾水1000ml。脂肽類抗生素的提取——酸沉淀法比較不同pH條件下沉淀的干重,以確定完全沉淀脂肽類抗生素所需的最佳pH值。5，每管分裝4—5ml，0.將測試菌種接種于肉湯瓊脂斜面上，培養(yǎng)1—2天。對每管乙醇溶液進行平板抑菌試驗,試驗真菌為油菜菌核病菌,將具有抑菌活性的收集液合并在一起,用離心濃縮儀濃縮至完全干燥,即為脂肽類抗生素的干重。將測試菌種接種于肉湯瓊脂斜面上，培養(yǎng)1—2天。脂肽類抗生素的提取——酸沉淀法將純化的菌種轉(zhuǎn)接至LB平板上,37℃培養(yǎng)24h,用接種環(huán)取活化菌種,接種于100mlLB液體培養(yǎng)基,30℃、200r/min培養(yǎng)24h作為種子菌。可利用蛋白質(zhì)、多種糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。廣泛分布在土壤及腐敗的有機物中。將測試菌種接種于肉湯瓊脂斜面上，培養(yǎng)1—2天。將測試菌種接種于肉湯瓊脂斜面上，培養(yǎng)1—2天。2%的可溶性淀粉，分裝于三角瓶。廣泛分布在土壤及腐敗的有機物中。（1）土樣的采集：取土壤表層5-10cm下的肥土100g左右，把采得的土壤放入紙袋帶回實驗室分離。（1）土樣的采集：取土壤表層5-10cm下的肥土100g左右，把采得的土壤放入紙袋帶回實驗室分離。若在培養(yǎng)基中加入少量肌酸以補充胍基，可加速反應(yīng)。2%的可溶性淀粉，分裝于三角瓶。培養(yǎng)基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，NaCl5g，蒸餾水1000ml。取一載玻片，在上面加一滴3—10%的過氧化氫，挑取一環(huán)菌苔，在過氧化氫溶液中涂抹，若有氣泡（氧氣）出現(xiàn)為陽性，無氣泡者為陰性。廣泛分布在土壤及腐敗的有機物中。脂肽類抗生素的提取——酸沉淀法5，每管分裝4—5ml，0.枯草芽孢桿菌的分離純化培養(yǎng)基：在肉湯瓊脂中添加0.將測試菌種接種于肉湯瓊脂斜面上，培養(yǎng)1—2天。將純化的菌種轉(zhuǎn)接至LB平板上,37℃培養(yǎng)24h,用接種環(huán)取活化菌種,接種于100mlLB液體培養(yǎng)基,30℃、200r/min培養(yǎng)24h作為種子菌。2%的可溶性淀粉，分裝于三角瓶。脂肽類抗生素的提取——酸沉淀法1MPa(15lbf/in2)20min滅菌備用。將脂肽類抗生素粗提物過SephadexLH-20層析柱，每管收集液分別經(jīng)真空干燥后,加入0·2ml乙醇溶解。取一載玻片，在上面加一滴3—10%的過氧化氫，挑取一環(huán)菌苔，在過氧化氫溶液中涂抹，若有氣泡（氧氣）出現(xiàn)為陽性，無氣泡者為陰性。經(jīng)生理生化鑒定，確定是芽孢桿菌屬純種后，從中選擇一株轉(zhuǎn)接于牛肉膏蛋白胨斜面上，置37℃培養(yǎng)1-2天后備用脂肽類抗生素的HPLC定量檢測比較不同pH條件下沉淀的干重,以確定完全沉淀脂肽類抗生素所需的最佳pH值。討論

枯草芽孢桿菌脂肽類抗生素在防治植物病害上具有廣闊的應(yīng)用前景,但由于其產(chǎn)量不高使其應(yīng)用受到限制，通過研究枯草芽孢桿菌的發(fā)酵技術(shù)和對其進行遺傳改造可以提高脂肽類抗生素產(chǎn)量。原理：許多芽孢桿菌產(chǎn)生淀粉酶，能將培養(yǎng)基中的淀粉水解，淀粉水20枯草芽孢桿菌的分離純化枯草芽孢桿菌的分離純化21目錄菌種簡介分離步驟生理生化鑒定發(fā)酵條件的優(yōu)化脂肽類抗生素的提取——酸沉淀法脂肽類抗生素的HPLC定量檢測討論目錄菌種簡介22菌種簡介

無莢膜，周生鞭毛，革蘭氏陽性菌，有芽孢，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，需氧菌?？衫玫鞍踪|(zhì)、多種糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。廣泛分布在土壤及腐敗的有機物中。菌種簡介無莢膜，周生鞭毛，革蘭氏陽性菌，有芽孢23

枯草芽孢桿菌在自然生長和發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生的脂肽類抗生素具有很強的抗真菌、病毒、腫瘤、支原體活性，在防治植物病害上具有廣闊的應(yīng)用前景。枯草芽孢桿菌在自然生長和發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生的脂肽類24分離原理芽孢桿菌能產(chǎn)生芽孢，在沸水中加熱不會失去生理活性，但是不能產(chǎn)生芽孢的細菌會失去活性，因而得到芽孢菌屬，經(jīng)過進一步的分離及生理生化鑒定得到枯草芽孢桿菌。分離原理芽孢桿菌能產(chǎn)生芽孢，在沸水中加熱不會失25分離步驟（1）土樣的采集：取土壤表層5-10cm下的肥土100g左右，把采得的土壤放入紙袋帶回實驗室分離。分離步驟（1）土樣的采集：取土壤表層5-10cm下的肥土1026（2）平板的制備：溶化三角瓶中的牛肉湯蛋白胨培養(yǎng)基，以每皿20ml左右倒6個平板。（2）平板的制備：溶化三角瓶中的牛肉湯蛋白胨培養(yǎng)基，以每皿227將純化的菌種轉(zhuǎn)接至LB平板上,37℃培養(yǎng)24h,用接種環(huán)取活化菌種,接種于100mlLB液體培養(yǎng)基,30℃、200r/min培養(yǎng)24h作為種子菌。無莢膜，周生鞭毛，革蘭氏陽性菌，有芽孢，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，需氧菌。將純化的菌種轉(zhuǎn)接至LB平板上,37℃培養(yǎng)24h,用接種環(huán)取活化菌種,接種于100mlLB液體培養(yǎng)基,30℃、200r/min培養(yǎng)24h作為種子菌。廣泛分布在土壤及腐敗的有機物中。5—1mg），充分振蕩，2—5min后如培養(yǎng)液呈紅色，即為試驗陽性。培養(yǎng)基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，NaCl5g，蒸餾水1000ml。無莢膜，周生鞭毛，革蘭氏陽性菌，有芽孢，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，需氧菌。取一載玻片，在上面加一滴3—10%的過氧化氫，挑取一環(huán)菌苔，在過氧化氫溶液中涂抹，若有氣泡（氧氣）出現(xiàn)為陽性，無氣泡者為陰性。將芽孢桿菌測試菌接種于上述培養(yǎng)液中，一般于30攝氏度培養(yǎng)4天，取培養(yǎng)液（約2ml）和等量的40%NAOH相混合，加少量肌酸（約0.（1）土樣的采集：取土壤表層5-10cm下的肥土100g左右，把采得的土壤放入紙袋帶回實驗室分離。06MPa（8lbf/in2）30min滅菌脂肽類抗生素的HPLC定量檢測脂肽類抗生素的提取——酸沉淀法脂肽類抗生素的提取——酸沉淀法取一載玻片，在上面加一滴3—10%的過氧化氫，挑取一環(huán)菌苔，在過氧化氫溶液中涂抹，若有氣泡（氧氣）出現(xiàn)為陽性，無氣泡者為陰性。（4）挑菌及純化：從上述分離的平板上分別挑取單菌落中部分菌體，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上劃線純化。（1）土樣的采集：取土壤表層5-10cm下的肥土100g左右，把采得的土壤放入紙袋帶回實驗室分離。芽孢桿菌能產(chǎn)生芽孢，在沸水中加熱不會失去生理活性，但是不能產(chǎn)生芽孢的細菌會失去活性，因而得到芽孢菌屬，經(jīng)過進一步的分離及生理生化鑒定得到枯草芽孢桿菌。2%的可溶性淀粉，分裝于三角瓶。原理：不同種類的芽孢桿菌對氧氣的需求性常有差異，因此本實驗可作為鑒定芽孢桿菌的一個較重要指標。將純化的菌種轉(zhuǎn)接至LB平板上,37℃培養(yǎng)24h,用接種環(huán)取活28（4）挑菌及純化：從上述分離的平板上分別挑取單菌落中部分菌體，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上劃線純化。（菌體應(yīng)呈桿狀，具芽孢，寬度一致；菌落顏色、形狀、質(zhì)地、透明度等均一致）（4）挑菌及純化：從上述分離的平板上分別挑取單菌落中部分菌體29生理生化鑒定一過氧化氫酶測定將測試菌種接種于肉湯瓊脂斜面上，培養(yǎng)1—2天。取一載玻片，在上面加一滴3—10%的過氧化氫，挑取一環(huán)菌苔，在過氧化氫溶液中涂抹，若有氣泡（氧氣）出現(xiàn)為陽性，無氣泡者為陰性。生理生化鑒定一過氧化氫酶測定30二需氧性試驗原理：不同種類的芽孢桿菌對氧氣的需求性常有差異，因此本實驗可作為鑒定芽孢桿菌的一個較重要指標。操作步驟：菌液穿刺接種到上述培養(yǎng)基中，一般于培養(yǎng)3—7天觀察結(jié)果。若芽孢桿菌在瓊脂柱表面生長為好氧菌，沿著穿刺線上生長者為厭氧菌或兼性厭氧菌二需氧性試驗31三、乙酰甲基甲醇實驗原理：有些芽孢桿菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸，并將產(chǎn)生的酸進一步轉(zhuǎn)化為中性化合物，如乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在堿性環(huán)境中可被氧氣成二乙酰，后者與蛋白胨中精氨酸所含的胍基起作用，生成紅色化合物，即表示試驗陽性。若在培養(yǎng)基中加入少量肌酸以補充胍基，可加速反應(yīng)。培養(yǎng)基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，NaCl5g，蒸餾水1000ml。調(diào)節(jié)PH6.5，每管分裝4—5ml，0.06MPa（8lbf/in2）30min滅菌步驟：將芽孢桿菌測試菌接種于上述培養(yǎng)液中，一般于30攝氏度培養(yǎng)4天，取培養(yǎng)液（約2ml）和等量的40%NAOH相混合，加少量肌酸（約0.5—1mg），充分振蕩，2—5min后如培養(yǎng)液呈紅色，即為試驗陽性。三、乙酰甲基甲醇實驗32四淀粉水解原理：許多芽孢桿菌產(chǎn)生淀粉酶，能將培養(yǎng)基中的淀粉水解，淀粉水解后，遇碘不再變藍色。培養(yǎng)基：在肉湯瓊脂中添加0.2%的可溶性淀粉，分裝于三角瓶。0.1MPa(15lbf/in2)20min滅菌備用。步驟：將培養(yǎng)基做成平板，凝固后取菌種點種于平板上（每皿點種2點），一般于30攝氏度培養(yǎng)2—4天，形成菌落后，在平板上滴加碘液，以鋪滿菌落為度，平板呈藍色，而菌落周圍如有無色透明圈出現(xiàn)，說明淀粉被水解，透明圈的大小，可表明水解能力的大小。四淀粉水解33經(jīng)生理生化鑒定，確定是芽孢桿菌屬純種后，從中選擇一株轉(zhuǎn)接于牛肉膏蛋白胨斜面上，置37℃培養(yǎng)1-2天后備用經(jīng)生理生化鑒定，確定是芽孢桿菌屬純種后，從中選34發(fā)酵條件的優(yōu)化將純化的菌種轉(zhuǎn)接至LB平板上,37℃培養(yǎng)24h,用接種環(huán)取活化菌種,接種于100mlLB液體培養(yǎng)基,30℃、200r/min培養(yǎng)24h作為種子菌。發(fā)酵條件的優(yōu)化將純化的菌種轉(zhuǎn)接至LB平板上,335發(fā)酵過程中采用單因素試驗方法,考察不同培養(yǎng)溫度(26、28、30、32、34、36℃)、培養(yǎng)時間(26、32、38、44、50、80h)、接種量(1%、2%、3%、5%、10%)、初始pH值(5、6、7、8、9)、培養(yǎng)基(Landy培養(yǎng)基、Landy修飾培養(yǎng)基Ⅰ、Landy修飾培養(yǎng)基Ⅱ、LB培養(yǎng)基、無機鹽培養(yǎng)基)對脂肽類抗生素產(chǎn)量的影響。發(fā)酵過程中采用單因素試驗方法,考察不同培養(yǎng)溫36結(jié)果表明,最佳培養(yǎng)條件為Landy培養(yǎng)基,初始pH7·0,接種量3%,發(fā)酵培養(yǎng)溫度30℃,發(fā)酵時間38h。結(jié)果表明,最佳培養(yǎng)條件為Landy培養(yǎng)基,初始37脂肽類抗生素的提取——酸沉淀法培養(yǎng)結(jié)束后,7000r/min離心10min,取上清，加HCl調(diào)節(jié)pH為5·0、4·5、4·0、3·5、3·0、2·5、2·0,7000r/min離心10min,收集沉淀。將沉淀在60℃的烘箱中干燥18h,稱重即為脂肽類抗生素粗提物的干重。比較不同pH條件下沉淀的干重,以確定完全沉淀脂肽類抗生素所需的最佳pH值。脂肽類抗生素的提取——酸沉淀法培養(yǎng)結(jié)束后,7038（1）土樣的采集：取土壤表層5-10cm下的肥土100g左右，把采得的土壤放入紙袋帶回實驗室分離。06MPa（8lbf/in2）30min滅菌經(jīng)生理生化鑒定，確定是芽孢桿菌屬純種后，從中選擇一株轉(zhuǎn)接于牛肉膏蛋白胨斜面上，置37℃培養(yǎng)1-2天后備用枯草芽孢桿菌在自然生長和發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生的脂肽類抗生素具有很強的抗真菌、病毒、腫瘤、支原體活性，在防治植物病害上具有廣闊的應(yīng)用前景。（1）土樣的采集：取土壤表層5-10cm下的肥土100g左右，把采得的土壤放入紙袋帶回實驗室分離。枯草芽孢桿菌的分離純化將純化的菌種轉(zhuǎn)接至LB平板上,37℃培養(yǎng)24h,用接種環(huán)取活化菌種,接種于100mlLB液體培養(yǎng)基,30℃、200r/min培養(yǎng)24h作為種子菌。脂肽類抗生素的提取——酸沉淀法廣泛分布在土壤及腐敗的有機物中。2%的可溶性淀粉，分裝于三角瓶。無莢膜，周生鞭毛，革蘭氏陽性菌，有芽孢，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，需氧菌。培養(yǎng)基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，NaCl5g，蒸餾水1000ml。將測試菌種接種于肉湯瓊脂斜面上，培養(yǎng)1—2天。芽孢桿菌能產(chǎn)生芽孢，在沸水中加熱不會失去生理活性，但是不能產(chǎn)生芽孢的細菌會失去活性，因而得到芽孢菌屬，經(jīng)過進一步的分離及生理生化鑒定得到枯草芽孢桿菌。（1）土樣的采集：取土壤表層5-10cm下的肥土100g左右，把采得的土壤放入紙袋帶回實驗室分離。若在培養(yǎng)基中加入少量肌酸以補充胍基，可加速反應(yīng)。廣泛分布在土壤及腐敗的有機物中。菌落顏色、形狀、質(zhì)地、透明度等均一致）培養(yǎng)基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，NaCl5g，蒸餾水1000ml?？莶菅挎邨U菌的分離純化5，每管分裝4—5ml，0.脂肽類抗生素的HPLC定量檢測將脂肽類抗生素粗提物過SephadexLH-20層析柱，每管收集液分別經(jīng)真空干燥后,加入0·2ml乙醇溶解。對每管乙醇溶液進行平板抑菌試驗,試驗真菌為油菜菌核病菌,將具有抑菌活性的收集液合并在一起,用離心濃縮儀濃縮至完全干燥,即為脂肽類抗生素的干重。（1）土樣的采集：取土壤表層5-10cm下的肥土100g左右39原理：許多芽孢桿菌產(chǎn)生淀粉酶，能將培養(yǎng)基中的淀粉水解，淀粉水解后，遇碘不再變藍色。5，每管分裝4—5ml，0.（菌體應(yīng)呈桿狀，具芽孢，寬度一致；（1）土樣的采集：取土壤表層5-10cm下的肥土100g左右，把采得的土壤放入紙袋帶回實驗室分離。取一載玻片，在上面加一滴3—10%的過氧化氫，挑取一環(huán)菌苔，在過氧化氫溶液中涂抹，若有氣泡（氧氣）出現(xiàn)為陽性，無氣泡者為陰性。比較不同pH條件下沉淀的干重,以確定完全沉淀脂肽類抗生素所需的最佳pH值。乙酰甲基甲醇在堿性環(huán)境中可被氧氣成二乙酰，后者與蛋白胨中精氨酸所含的胍基起作用，生成紅色化合物，即表示試驗陽性。脂肽類抗生素的提取——酸沉淀法脂肽類抗生素的提取——酸沉淀法脂肽類抗生素的HPLC定量檢測取一載玻片，在上面加一滴3—10%的過氧化氫，挑取一環(huán)菌苔，在過氧化氫溶液中涂抹，若有氣泡（氧氣）出現(xiàn)為陽性，無氣泡者為陰性。5，每管分裝4—5ml，0.廣泛分布在土壤及腐敗的有機物中。將純化的菌種轉(zhuǎn)接至LB平板上,37℃培養(yǎng)24h,用接種環(huán)取活化菌種,接種于100mlLB液體培養(yǎng)基,30℃、200r/min培養(yǎng)24h作為種子菌。取一載玻片，在上面加一滴3—10%的過氧化氫，挑取一環(huán)菌苔，在過氧化氫溶液中涂抹，若有氣泡（氧氣）出現(xiàn)為陽性，無氣泡者為陰性。廣泛分布在土壤及腐敗的有機物中。原理：許多芽孢桿菌產(chǎn)生淀粉酶，能將培養(yǎng)基中的淀粉水解，淀粉水解后，遇碘不再變藍色。脂肽類抗生素的提取——酸沉淀法培養(yǎng)基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，NaCl5g，蒸餾水1000ml。廣泛分布在土壤及腐敗的有機物中。發(fā)酵過程中采用單因素試驗方法,考察不同培養(yǎng)溫度(26、28、30、32、34、36℃)、培養(yǎng)時間(26、32、38、44、50、80h)、接種量(1%、2%、3%、5%、10%)、初始pH值(5、6、7、8、9)、培養(yǎng)基(Landy培養(yǎng)基、Landy修飾培養(yǎng)基Ⅰ、Landy修飾培養(yǎng)基Ⅱ、LB培養(yǎng)基、無機鹽培養(yǎng)基)對脂肽類抗生素產(chǎn)量的影響。脂肽類抗生素的提取——酸沉淀法（4）挑菌及純化：從上述分離的平板上分別挑取單菌落中部分菌體，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上劃線純化。將沉淀在60℃的烘箱中干燥18h,稱重即為脂肽類抗生素粗提物的干重。原理：許多芽孢桿菌產(chǎn)生淀粉酶，能將培養(yǎng)基中的淀粉水解，淀粉水解后，遇碘不再變藍色。廣泛分布在土壤及腐敗的有機物中。（菌體應(yīng)呈桿狀，具芽孢，寬度一致；將測試菌種接種于肉湯瓊脂斜面上，培養(yǎng)1—2天。廣泛分布在土壤及腐敗的有機物中。脂肽類抗生素的提取——酸沉淀法原理：不同種類的芽孢桿菌對氧氣的需求性常有差異，因此本實驗可作為鑒定芽孢桿菌的一個較重要指標。（1）土樣的采集：取土壤表層5-10cm下的肥土100g左右，把采得的土壤放入紙袋帶回實驗室分離。培養(yǎng)基：在肉湯瓊脂中添加0.若芽孢桿菌在瓊脂柱表面生長為好氧菌，沿著穿刺線上生長者為厭氧菌或兼性厭氧菌06MPa（8lbf/in2）30min滅菌06MPa（8lbf/in2）30min滅菌（1）土樣的采集：取土壤表層5-10cm下的肥土100g左右，把采得的土壤放入紙袋帶回實驗室分離。1MPa(15lbf/in2)20min滅菌備用。06MPa（8lbf/in2）30min滅菌脂肽類抗生素的HPLC定量檢測原理：不同種類的芽孢桿菌對氧氣的需求性常有差異，因此本實驗可作為鑒定芽孢桿菌的一個較重要指標。脂肽類抗生素的提取——酸沉淀法廣泛分布在土壤及腐敗的有機物中。將純化的菌種轉(zhuǎn)接至LB平板上,37℃培養(yǎng)24h,用接種環(huán)取活化菌種,接種于100mlLB液體培養(yǎng)基,30℃、200r/min培養(yǎng)24h作為種子菌。發(fā)酵過程中采用單因素試驗方法,考察不同培養(yǎng)溫度(26、28、30、32、34、36℃)、培養(yǎng)時間(26、32、38、44、50、80h)、接種量(1%、2%、3%、5%、10%)、初始pH值(5、6、7、8、9)、培養(yǎng)基(Landy培養(yǎng)基、Landy修飾培養(yǎng)基Ⅰ、Landy修飾培養(yǎng)基Ⅱ、LB培養(yǎng)基、無機鹽培養(yǎng)基)對脂肽類抗生素產(chǎn)量的影響。取一載玻片，