血凝項目標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程1．一般注意事項樣品采集?靜脈抽血；?穿刺要一針見血，避免淤血，氣泡，溶血和組織液污染；?如果使用真空采集管，以第二或第三管樣品為佳；如果從導(dǎo)管取樣，則需用生理鹽水沖洗管道，前面5ml血不能使用；?采血后立即與抗凝劑充分混合，盡快送往實驗室；?采血量必須準(zhǔn)確，如果少于計劃量的 90%，則不能使用；?不能在靜脈穿刺部位或附近部位采樣。樣品處理?使用3.8%或3.2%（W/V）枸櫞酸鈉溶液作為抗凝劑；?血樣與抗凝劑的比例為9：1，如果血球壓積﹤20%或﹥55%，則需調(diào)整這個比例，方法是：0.00815X血液毫升數(shù)X（100-壓積）=抗凝劑毫升數(shù)；?血漿分離（如果不能立即測試，應(yīng)盡快分離血漿）；——采樣后60分鐘內(nèi)進行；——離心速度為1000g/10分鐘?盛血漿容器應(yīng)加塞，防止PH改變；?血漿應(yīng)保存在2-8℃；?血漿存放時間不能太久；度溫有效時間室≤溫2hr2-8℃≤4hr-≤20℃2weeks-≤70℃6months?低溫保存的樣品，要在37℃迅速解凍，減低凝血因子的消耗，并立即測試。?與樣品接觸的所有器材（注射劑，樣品管，檢測杯等）必須采用塑料袋或硅化玻璃材質(zhì)。?全部器材均不得含去污劑或清洗液。影響測定結(jié)果的幾種因素?抗凝劑：草酸鈉、EDTA、肝素不適于作抗凝劑；?黃疸，脂血，重度溶血和冰凍血漿影響測定結(jié)果不準(zhǔn)；?使用纖溶藥物，如雙香豆素，鏈激酶，尿酶等可使凝固時間延長；?超過治療試劑量的肝素使凝固時間延長；?FDP增加使凝固時間延長；?某些藥物，如口服避孕藥，雌激素，天門冬酰胺酶，鈉絡(luò)酮等影響測試結(jié)果；?樣本采集和處理不當(dāng)，都會使凝固時間縮短或延長；?妊娠和急性炎癥會影響某些測試結(jié)果。干粉試劑及血漿溶解?保證干粉完全溶解；?溶解時，輕輕轉(zhuǎn)動容器，避免劇烈震蕩；?確認(rèn)溶劑種類，一般溶解液包括：蒸餾水/生理鹽水/緩沖液/廠家特定溶解液，按說明書選擇；復(fù)溶后，室溫放置5-10分鐘后方可使用二．具體項目操作注意事項1.PT凝血酶原時間I.概述凝血酶原時間(ProthrombinTime)測定用來作為外科手術(shù)前對某一凝血因子的評價，以及用于監(jiān)視抗凝治療，當(dāng)進行凝血酶原時間測試時，對于正常結(jié)果需有2、3級所有因子。因此，該實驗對因子I、II、V、VII和X的量減少或不足是很靈敏的。除了因子IX，凝血酶原時間測試對于其它所有因子缺乏是靈敏的，它已被證明在監(jiān)視抗凝治療是有效手段。凝血酶原時間測定也用于因子II、V、VII和X的定量分析(因子分析)。II.試劑干粉試劑需復(fù)溶，液體試劑直接使用，使用前輕輕混合，可使用一些備件如攪拌。使用期間保持適當(dāng)?shù)膽腋∫籂顟B(tài)。如質(zhì)控結(jié)果在范圍之外，或試劑顏色發(fā)生變化，可能表明產(chǎn)品變質(zhì)。然而，差的性能、結(jié)果也可能是由于其他因素包括試驗系統(tǒng)引起的。警告：PT-DS試劑含有疊氮鈉，勿服、勿接觸皮膚和黏膜。III.樣本收集3.8%(0.109M)枸櫞鈉做為抗凝劑。避免溶血和其他組織液的污染。樣本體積不得少于所需體積的90%。在3000×g下離心10分鐘，如樣本在22—24℃下，須在2小時內(nèi)測定。有關(guān)樣本收集和儲存的詳細(xì)資料，請參見NCCLS文件。IV.步驟提供材料PT試劑另需材料：純化水合適的計時器精密移液管：0.1ml和0.2ml正常和異常質(zhì)控物，(凝血質(zhì)控血漿三個水平)PT適合于手工、儀器、光度計和其它凝固的測定方法。手工方法A：在37℃預(yù)熱PT試劑；B：加0.1ml血漿到比色杯中，在37℃下預(yù)熱；C:用力加0.2ml預(yù)熱的PT試劑到血漿中凝結(jié)形成，并記錄時間建議至少使用一正常和一異常對照血漿，每40份病人樣品至少一次輪換，逐日測定對照血漿，建議每個實驗室應(yīng)做好室內(nèi)質(zhì)控范圍。V.結(jié)果用最近的0.1秒報告每個血漿的凝固時間，所得PT時間結(jié)果與正常參考范圍值一起列入報告。（勿報告相對于商業(yè)質(zhì)控血漿凝結(jié)時間的病人比值。質(zhì)控僅僅是為了保證試驗系統(tǒng)的準(zhǔn)確性。）VI.局限性血凝生物化學(xué)包含一系列受許多預(yù)試驗條件影響的反應(yīng)。這些變異性必須被控制，以獲得好的結(jié)果：樣本收集勿延遲血液與抗凝劑的混合；避免樣本產(chǎn)生泡沫；用塑料或硅硼酸鹽玻璃容器；混濁、溶血、脂血或黃疸的樣本，可能會引起錯誤結(jié)果；冷凍和解凍包含殘留細(xì)胞血漿，會裂解細(xì)胞膜而影響結(jié)果；急性炎癥反應(yīng)由于纖維蛋白原的升高，會縮短PT結(jié)果；紅細(xì)胞壓積在20—55%范圍以外，所加抗凝劑需調(diào)整比例。技術(shù)：如果血漿暴露到空氣中pH將升高；PT工作要求37℃±0.5℃。經(jīng)常檢查加熱部分的溫度。在4—8℃保持的血漿可能會引起冷激活而導(dǎo)致PT縮短；所有的實驗器皿必須清潔，沒有臟物痕跡；按照儀器供應(yīng)商的要求，保養(yǎng)儀器。影響物質(zhì)：草酸鈉，EDTA和肝素不適合做抗凝劑；口服避孕藥物、天門冬氨酰胺酶、皮質(zhì)酮、EDTA、紅霉素、酒精、四環(huán)素和抗凝劑如肝素和華法令可能引起PT延長?？菇M織胺藥、布塔巴比妥、咖啡因、口服避孕藥、苯巴比妥、維生素K.可能引起PT縮短。VII.期望值PT對正常人評估可獲得以下結(jié)果平均 ±2SD范圍儀器11.9 11.0—15.0可見光度計 12.5 10.7—14.3這些值僅作為一個指導(dǎo)，每個實驗室應(yīng)建立自己的正常參考范圍。試劑、儀器操作、血樣收集技術(shù)或抗凝劑的改變，都應(yīng)重新建立新的正常參考范圍。有關(guān)性能特征、因子分析精密度等詳見英文說明書。2.APTT測定試劑I.概述APTT(ActivatedpartialThromboplastintime)測試廣泛應(yīng)用已有數(shù)年，用作外科手術(shù)對某些凝結(jié)因子的評價，以及監(jiān)視肝素治療。當(dāng)測定APTT時，所有內(nèi)途徑因子對于正常結(jié)果是必需的。然而它主要地用于檢測2級因子的不足，即因子VIII、IX、XI和XII，以及Fletcher因子(4)。APTT測試也用于監(jiān)視肝素治療，測定結(jié)果顯示延長0.1單位以上(5)。此試驗也用在因子VIII、IX、XII和Fletcher因子的定量測度(因子分析)。II.摘要與原理APTT的延長直接與肝素量的增加成正比。APTT時間測定就是加入APTT試劑混合物在此37℃孵育3分鐘“激活”，再加CACl2計數(shù)凝塊形成時間。III.試劑試劑在2—8℃保存，勿冷凍，開瓶后在2—8℃可穩(wěn)定30天。長時間儲存后，可能會出現(xiàn)黃色沉淀。在使用前輕輕混合。不穩(wěn)定值、超出質(zhì)控范圍之外的值或產(chǎn)品顏色變化，可能表明試劑變質(zhì)。然而其它因素包括試驗系統(tǒng)也可能引起這些誤差。IV.樣本收集3.2%(0.105M)或3.8%(0.109M)檸檬酸作抗凝劑，避免溶血和其它組織液體污染。樣本體積不得少于所需體積的90%。在3000×g離心10分鐘，如樣本放在22—24℃下，需在2小時內(nèi)測定。有關(guān)樣本收集和儲存的詳細(xì)資料，請參見NCCLS文件。V.步驟提供材料：APTT試劑。另需材料：美創(chuàng)公司提供的CaCl2(0.025M)，高純度、高質(zhì)量；適當(dāng)?shù)挠嫊r器(秒表和時間表)；精密移液管：0.1ml；正常和異常質(zhì)控，(凝血質(zhì)控血漿，1、2、3、三個水平)APTT是適用于手工、儀器、光度計和其它凝結(jié)測定的方法。手工方法：A：在37℃預(yù)熱CACL2(0.025M)；B：加0.1ml測定血漿到比色杯中，在37℃預(yù)熱；C：加0.1ml預(yù)溫過的APTT試劑入測定血漿中，混合；D：在37℃下孵育血漿試劑混合物3分鐘。(激活時間)，為了試驗的一致性，用同樣的激活時間，測定所有血漿；E：用力加0.1ml預(yù)熱的CACL2，凝結(jié)形成，注意凝塊形成時間。用正常、異常質(zhì)控血漿(如美創(chuàng)公司的質(zhì)控三個水平1、2、3)與病人血漿結(jié)合起來測定。建議至少用一個正常和一個不正常血漿，至少每測20份病人樣本輪換一次。VI.結(jié)果用最近的0.1秒報告每個血漿的凝結(jié)時間，所得APTT時間結(jié)果與正常參考范圍值一起列入報告。（勿報告相對于商業(yè)質(zhì)控血漿凝結(jié)時間的病人的值。質(zhì)控僅僅是為了保證試驗系統(tǒng)的準(zhǔn)確性。）VII.局限性血凝生物化學(xué)包含一系列受許多預(yù)試驗條件影響的反應(yīng)。這些變異性必須被控制，以獲得好的結(jié)果。樣本收集：勿延遲血液與抗凝劑的混合；避免樣本產(chǎn)生泡沫；用塑料或硅硼酸鹽玻璃容器；混濁的溶血、脂血或黃疸的樣本，可能引起錯誤結(jié)果；反復(fù)冷凍和解凍血漿，會損傷細(xì)胞膜，會影響結(jié)果；血胞壓積在22—25%范圍之外，所加抗凝劑需調(diào)整比例；技術(shù)：如果血漿暴露到空氣中pH值將升高；APTT工作要求37℃±0.5℃，經(jīng)常檢查所有加熱部分的溫度；所有的試驗器皿必須被清潔，沒有贓物痕跡；按照儀器供應(yīng)商的要求，保養(yǎng)儀器。影響物質(zhì)：草酸鈉，EDTA和肝素不適合作抗凝劑；口服避孕藥物，雌激素，懷孕，氧雜萘鄰?fù)惖乃幬?，肝素，天門冬氨酰胺酶和naloxone已有報道報告會影響APTT結(jié)果。VIII.期望值A(chǔ)PTT-LS正常人可獲得下面結(jié)果：平均 ±2SD范圍儀器 28.6 24-38可見光度計26.0 23.4—28.6這些值僅作為一個指導(dǎo)，每個試驗室應(yīng)建立自己的正常參考范圍。試劑、儀器操作、血樣收集技術(shù)或抗凝劑的改變，都應(yīng)重新建立新的正常參考范圍。3.纖維蛋白原采用clauss法，即在待檢稀釋血漿中加入高濃度的凝血酶，血漿凝固時間與血漿纖維蛋白原濃度成反比。二、試劑及材料準(zhǔn)備凍干牛凝血酶（100NIHUnit/ml）干粉或液體纖維蛋白原參比血漿1.0ml/瓶，3瓶/盒該制劑系人枸櫞酸鈉抗凝血漿，加入穩(wěn)定劑和緩沖液后凍干而成。使用前用蒸餾水溶解，輕輕搖動至完全溶解。2—8℃存放可以穩(wěn)定一周，也可-20℃凍存，避免反復(fù)凍溶。咪唑緩沖鹽水（pH7.4±0.2）135ml/瓶，1瓶/盒該緩沖液以疊氮鈉為防腐劑，疊氮鈉如遇酸將產(chǎn)生有毒化合物，因此，含有該劑的容器、試管及丟棄的試劑均應(yīng)用大量流水沖洗。此外，亦應(yīng)避免該試劑在金屬管道內(nèi)沉積。塑料試管（自備）移液器100μl、200μl（自備）正常及異常質(zhì)控血漿（自備）雙對數(shù)坐標(biāo)紙三、方法（一）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備稀釋的纖維蛋白原參比血漿的制備將已知濃度的纖維蛋白原參比保存漿用咪唑緩沖鹽水稀釋成 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶40，5個濃度。每稀釋度各取0.2ml、37℃預(yù)熱5分鐘，然后加入室溫的凝血酶，記錄各稀釋度的血漿凝固時間。每稀釋度重復(fù)2—3次測定，取平均值。以各稀釋度纖維蛋白原的濃度為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的血漿凝固時間的平均值為橫坐標(biāo)，在雙對數(shù)坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，每條標(biāo)準(zhǔn)曲線至少應(yīng)包括所做的5個稀釋度中的連續(xù)3個以上的點。否則結(jié)果不予接受，應(yīng)重新繪制。（二）標(biāo)本的測定1.標(biāo)本采集：3.2%或3.8%的枸櫞酸鈉1∶9抗凝全血，以RCF3000×g離心10分鐘，分離血漿待檢。在室溫條件下，標(biāo)本存放不應(yīng)超過2小時，2小時不能完成檢測，應(yīng)凍存。2.測定步驟待檢標(biāo)本用咪唑鹽水1∶10稀釋。取1∶10稀釋的血漿0.2ml、37℃預(yù)熱5分鐘，然后加入0.1mL已預(yù)熱的凝血酶試劑，記錄血漿凝固時間。根據(jù)血漿凝固時間在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得標(biāo)本的纖維蛋白原濃度。若血漿凝固時間超出標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍，若過長將標(biāo)本作 1∶5稀釋,過短改作1∶20稀釋，重新測定凝固時間，如標(biāo)本作1∶5稀釋，將從曲線上查得結(jié)果除2，如標(biāo)本作1∶20稀釋，將從曲線上查得結(jié)果乘2，得到最終結(jié)果。四、參考范圍2.0g～4.0g/l(200～400mg/dl)五、注意事項1.分離的血漿中不應(yīng)含有細(xì)胞成分；2.纖維蛋白原含量低于1.5g/l，而血漿FDP含量明顯增高時，可致標(biāo)本的測定結(jié)果較實際結(jié)果低；4.TT測定一、樣本收集抗凝細(xì)胞壓積劑：3.2%枸櫞酸鈉血樣與枸櫞酸鹽的比例為9∶1。然而，對于個別病人血細(xì)胞壓積低于20%或高于55%，須調(diào)整這個比例以保證獲得結(jié)果。下面公式用來計算調(diào)整抗凝劑的量。0.00185×血液（ml）×（100-血細(xì)胞壓積）=抗凝劑（ml）樣本收集：血樣可用針刺或其它方法取得。針刺是非損傷性的，避免溶血或其它組織液的污染。樣本處理：血液收集后立即用抗凝劑輕輕混合，用RCF3000×g離心10分鐘，過多血小板污染的血漿可能會引起一些因子水平假性升高，包括纖維蛋白原（因子1），分離血漿勿使紅細(xì)胞混入，或立即做實驗。蓋好樣品以