本章內(nèi)容一、核酸的概念與重要性二、核酸的組成成分三、DNA的結(jié)構(gòu)五、RNA的結(jié)構(gòu)和功能六、核酸的性質(zhì)七、核酸的序列測定本章內(nèi)容一、核酸的概念與重要性1

核酸的性質(zhì)一般理化性質(zhì)核酸的紫外吸收性質(zhì)核酸結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性DNA的變性、復(fù)性與分子雜交核酸的性質(zhì)一般理化性質(zhì)2DNA有酸性磷酸基及堿性堿基，為兩性大分子，但偏于酸性。DNA為白色纖維狀固體，RNA為白色粉末；微溶于水，不溶于一般有機溶劑。DNA的粘度極高，RNA要小的多；RNA在室溫被稀堿水解成核苷酸而DNA（因其2，－位沒有－OH基）對堿穩(wěn)定。D－核糖（RNA組分）與濃鹽酸和苔黑酚共熱產(chǎn)生綠色；D－2－脫氧核糖（DNA組分）與酸和二苯胺共熱產(chǎn)生藍紫色，可區(qū)別二者及定量測定。一般理化性質(zhì)DNA有酸性磷酸基及堿性堿基，為兩性大分子，但偏于酸性。一般3核酸的紫外吸收性質(zhì)

★UV吸收：核酸分子中含有嘌呤堿和嘧啶堿，因而具有紫外吸收的的性質(zhì)，在260nm處核酸紫外吸收最強。核酸的紫外吸收是核酸定量測定的基礎(chǔ)?！锖怂岬墓馕毡绕涓骱塑账岢煞值墓馕罩抵鸵?0％－40％，這是雙螺旋中堿基緊密堆積在一起造成的。

核酸的紫外吸收性質(zhì)★UV吸收：4核酸結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性1、堿基對間的氫鍵在核酸雙螺旋區(qū)，堿基對間形成氫鍵；氫鍵是一種較弱的非共價鍵，但許多氫鍵的集合能量是很大的。2、堿基堆積力疏水性的堿基堆積在雙螺旋內(nèi)部，形成疏水核心；螺旋外圍的核糖和磷酸基上的親水基團，使環(huán)境中的水在螺旋外圍形成水殼，也有助于螺旋的穩(wěn)定。3、環(huán)境中的正離子環(huán)境中的正離子與核酸的帶負電荷的磷酸基團結(jié)合，消除靜電斥力，穩(wěn)定核酸結(jié)構(gòu)。核酸結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性1、堿基對間的氫鍵5

DNA的變性、復(fù)性與分子雜交

DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，不僅與其生物功能有密切關(guān)系，還能解釋DNA的重要特性變性與復(fù)性。（一）DNA變性

1、DNA變性的概念：指DNA分子中的雙螺旋結(jié)構(gòu)解鏈為無規(guī)則線性結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象。2、DNA變性的本質(zhì)：維持雙螺旋穩(wěn)定性的氫鍵斷裂，堿基間的堆積力遭到破壞，但不涉及到其一級結(jié)構(gòu)的改變。3、導(dǎo)致DNA變性的因素：凡能破壞雙螺旋穩(wěn)定性的因素，如加熱、極端的pH、有機試劑甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等，均可引起核酸分子變性DNA的變性、復(fù)性與分子雜交DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，64、變性后DNA其它理化性質(zhì)變化：紫外吸收增強（OD260增高）、粘度下降、浮力密度升高、生物活性部分或全部喪失★增色效應(yīng)：指DNA變性后其紫外吸收明顯增強的效應(yīng)。DNA分子中堿基間電子的相互作用使DNA分子具有吸收260nm波長紫外光的特性。在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中堿基藏入內(nèi)側(cè)，變性時DNA雙螺旋解開，于是堿基外露，堿基中電子的相互作用更有利于紫外吸收，故而產(chǎn)生增色效應(yīng)。4、變性后DNA其它理化性質(zhì)變化：★增色效應(yīng)：7DNA變性的本質(zhì)是氫鍵的斷裂DNA變性的本質(zhì)是氫鍵的斷裂8對雙鏈DNA進行加熱變性，當(dāng)溫度升高到一定高度時，DNA溶液在260nm處的吸光度突然明顯上升至最高值，隨后即使溫度繼續(xù)升高，吸光度也不再明顯變化。若以溫度對DNA溶液的紫外吸光率作圖，得到的典型DNA變性曲線呈S型。對雙鏈DNA進行加熱變性，當(dāng)溫度升高到一定高度時，DNA溶液95、熔解溫度(Tm）：由上圖可見，DNA變性是在一個很窄的溫度范圍內(nèi)發(fā)生的。通常將核酸加熱變性過程中，紫外光吸收值達到最大值的50%時的溫度稱為核酸的解鏈溫度，由于這一現(xiàn)象和結(jié)晶的熔解相類似，又稱熔解溫度（一般在80－100℃）

。在Tm時，核酸分子內(nèi)50%的雙螺旋結(jié)構(gòu)被破壞?！镉绊懸蛩兀海?）G＋C含量：特定核酸分子的Tm值與其G＋C所占總堿基數(shù)的百分比成正相關(guān)。（2）溶液的離子強度：離子強度較低的介質(zhì)中，Tm較低。（3）溶液的pH值：pH過高過低引起DNA變性。（4）變性劑的使用可使Tm降低：5、熔解溫度(Tm）：10(G+C)%=（Tm－69.3）×2.44(G+C)%=（Tm－69.3）×2.4411(二)DNA的熱變性與復(fù)性

指經(jīng)加熱變性的DNA在適當(dāng)條件下，二條互補鏈全部或部分恢復(fù)到天然雙螺旋結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象，它是變性的一種逆轉(zhuǎn)過程。熱變性DNA一般經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，此過程稱之為退火。一般認為比Tm低25℃左右的溫度是復(fù)性的最佳條件。這一術(shù)語也用以描述雜交核酸分子的形成(見后)?！镉绊懸蛩兀海?）單鏈片段濃度（2）單鏈片段大?。?）片段內(nèi)的重復(fù)序列（4）溶液的離子強度(二)DNA的熱變性與復(fù)性指經(jīng)加熱變性的DNA在適12*復(fù)性過程中的堿基配對：*復(fù)性過程中的堿基配對：13（三）分子雜交：

不同來源的核酸變性后，合并在一處進行復(fù)性，這時，只要這些核酸分子的核苷酸序列含有可以形成堿基互補配對的片段，復(fù)性也會發(fā)生于不同來源的核酸鏈之間，即形成所謂的雜化雙鏈，這個過程稱為雜交。雜交可以發(fā)生于DNA與DNA之間，也可以發(fā)生于RNA與RNA之間和DNA與RNA之間。核酸雜交技術(shù)是目前研究核酸結(jié)構(gòu)、功能常用手段之一，不僅可用來檢驗核酸的缺失、插入，還可用來考察不同生物種類在核酸分子中的共同序列和不同序列以確定它們在進化中的關(guān)系，其主要應(yīng)用如下圖所示：（三）分子雜交：不同來源的核酸變性后，合并在一處進行復(fù)性14

核酸雜交

核酸雜交15Ⅰ.變性、復(fù)性和雜交。粗細線分別代表不同DNA。A是雜化雙鏈Ⅱ.突變體的鑒別。B代表天然DNA；C是B的缺失突變體；虛線框內(nèi)是已缺失的部分；D是顯示從天然DNA鏈鼓出小泡Ⅲ.粗線代表探針，粗線上的X表示放射性標記Ⅰ.變性、復(fù)性和雜交。粗細線分別代表不同DNA。A是雜化雙鏈16核酸的性質(zhì)課件17核酸的性質(zhì)課件18Sanger雙脫氧鏈終止法(酶法測序）（1）以DNA的酶促合成原理為基礎(chǔ)：DNA的合成需要模板、引物、底物（dNTP）、聚合酶等條件。在引物的3′末端，依據(jù)堿基配對的原則，生成新的3′,5′－磷酸二酯鍵，進行延伸。（2）測序時，四組反應(yīng)平行進行，每組反應(yīng)均使用相同的模板、引物以及四種脫氧核苷酸；并在四組反應(yīng)中各加入適量的四種之一的雙脫氧核苷酸（ddNTP），使其隨機地接入DNA鏈中，使鏈合成終止，產(chǎn)生相應(yīng)的四組具有特定長度的、不同長短的DNA鏈。這四組DNA鏈再經(jīng)過聚丙烯酸胺凝膠電泳按鏈的長短分離開，經(jīng)過放射自顯影顯示區(qū)帶，就可以直接讀出被測DNA的核苷酸序列,如下圖所示：

核酸的序列測定Sanger雙脫氧鏈終止法(酶法測序）（1）以DNA的酶促合19核酸的性質(zhì)課件20核酸的性質(zhì)課件21核酸的性質(zhì)課件22本章內(nèi)容一、核酸的概念與重要性二、核酸的組成成分三、DNA的結(jié)構(gòu)五、RNA的結(jié)構(gòu)和功能六、核酸的性質(zhì)七、核酸的序列測定本章內(nèi)容一、核酸的概念與重要性23

核酸的性質(zhì)一般理化性質(zhì)核酸的紫外吸收性質(zhì)核酸結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性DNA的變性、復(fù)性與分子雜交核酸的性質(zhì)一般理化性質(zhì)24DNA有酸性磷酸基及堿性堿基，為兩性大分子，但偏于酸性。DNA為白色纖維狀固體，RNA為白色粉末；微溶于水，不溶于一般有機溶劑。DNA的粘度極高，RNA要小的多；RNA在室溫被稀堿水解成核苷酸而DNA（因其2，－位沒有－OH基）對堿穩(wěn)定。D－核糖（RNA組分）與濃鹽酸和苔黑酚共熱產(chǎn)生綠色；D－2－脫氧核糖（DNA組分）與酸和二苯胺共熱產(chǎn)生藍紫色，可區(qū)別二者及定量測定。一般理化性質(zhì)DNA有酸性磷酸基及堿性堿基，為兩性大分子，但偏于酸性。一般25核酸的紫外吸收性質(zhì)

★UV吸收：核酸分子中含有嘌呤堿和嘧啶堿，因而具有紫外吸收的的性質(zhì)，在260nm處核酸紫外吸收最強。核酸的紫外吸收是核酸定量測定的基礎(chǔ)?！锖怂岬墓馕毡绕涓骱塑账岢煞值墓馕罩抵鸵?0％－40％，這是雙螺旋中堿基緊密堆積在一起造成的。

核酸的紫外吸收性質(zhì)★UV吸收：26核酸結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性1、堿基對間的氫鍵在核酸雙螺旋區(qū)，堿基對間形成氫鍵；氫鍵是一種較弱的非共價鍵，但許多氫鍵的集合能量是很大的。2、堿基堆積力疏水性的堿基堆積在雙螺旋內(nèi)部，形成疏水核心；螺旋外圍的核糖和磷酸基上的親水基團，使環(huán)境中的水在螺旋外圍形成水殼，也有助于螺旋的穩(wěn)定。3、環(huán)境中的正離子環(huán)境中的正離子與核酸的帶負電荷的磷酸基團結(jié)合，消除靜電斥力，穩(wěn)定核酸結(jié)構(gòu)。核酸結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性1、堿基對間的氫鍵27

DNA的變性、復(fù)性與分子雜交

DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，不僅與其生物功能有密切關(guān)系，還能解釋DNA的重要特性變性與復(fù)性。（一）DNA變性

1、DNA變性的概念：指DNA分子中的雙螺旋結(jié)構(gòu)解鏈為無規(guī)則線性結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象。2、DNA變性的本質(zhì)：維持雙螺旋穩(wěn)定性的氫鍵斷裂，堿基間的堆積力遭到破壞，但不涉及到其一級結(jié)構(gòu)的改變。3、導(dǎo)致DNA變性的因素：凡能破壞雙螺旋穩(wěn)定性的因素，如加熱、極端的pH、有機試劑甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等，均可引起核酸分子變性DNA的變性、復(fù)性與分子雜交DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，284、變性后DNA其它理化性質(zhì)變化：紫外吸收增強（OD260增高）、粘度下降、浮力密度升高、生物活性部分或全部喪失★增色效應(yīng)：指DNA變性后其紫外吸收明顯增強的效應(yīng)。DNA分子中堿基間電子的相互作用使DNA分子具有吸收260nm波長紫外光的特性。在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中堿基藏入內(nèi)側(cè)，變性時DNA雙螺旋解開，于是堿基外露，堿基中電子的相互作用更有利于紫外吸收，故而產(chǎn)生增色效應(yīng)。4、變性后DNA其它理化性質(zhì)變化：★增色效應(yīng)：29DNA變性的本質(zhì)是氫鍵的斷裂DNA變性的本質(zhì)是氫鍵的斷裂30對雙鏈DNA進行加熱變性，當(dāng)溫度升高到一定高度時，DNA溶液在260nm處的吸光度突然明顯上升至最高值，隨后即使溫度繼續(xù)升高，吸光度也不再明顯變化。若以溫度對DNA溶液的紫外吸光率作圖，得到的典型DNA變性曲線呈S型。對雙鏈DNA進行加熱變性，當(dāng)溫度升高到一定高度時，DNA溶液315、熔解溫度(Tm）：由上圖可見，DNA變性是在一個很窄的溫度范圍內(nèi)發(fā)生的。通常將核酸加熱變性過程中，紫外光吸收值達到最大值的50%時的溫度稱為核酸的解鏈溫度，由于這一現(xiàn)象和結(jié)晶的熔解相類似，又稱熔解溫度（一般在80－100℃）

。在Tm時，核酸分子內(nèi)50%的雙螺旋結(jié)構(gòu)被破壞。★影響因素：（1）G＋C含量：特定核酸分子的Tm值與其G＋C所占總堿基數(shù)的百分比成正相關(guān)。（2）溶液的離子強度：離子強度較低的介質(zhì)中，Tm較低。（3）溶液的pH值：pH過高過低引起DNA變性。（4）變性劑的使用可使Tm降低：5、熔解溫度(Tm）：32(G+C)%=（Tm－69.3）×2.44(G+C)%=（Tm－69.3）×2.4433(二)DNA的熱變性與復(fù)性

指經(jīng)加熱變性的DNA在適當(dāng)條件下，二條互補鏈全部或部分恢復(fù)到天然雙螺旋結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象，它是變性的一種逆轉(zhuǎn)過程。熱變性DNA一般經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，此過程稱之為退火。一般認為比Tm低25℃左右的溫度是復(fù)性的最佳條件。這一術(shù)語也用以描述雜交核酸分子的形成(見后)?！镉绊懸蛩兀海?）單鏈片段濃度（2）單鏈片段大小（3）片段內(nèi)的重復(fù)序列（4）溶液的離子強度(二)DNA的熱變性與復(fù)性指經(jīng)加熱變性的DNA在適34*復(fù)性過程中的堿基配對：*復(fù)性過程中的堿基配對：35（三）分子雜交：

不同來源的核酸變性后，合并在一處進行復(fù)性，這時，只要這些核酸分子的核苷酸序列含有可以形成堿基互補配對的片段，復(fù)性也會發(fā)生于不同來源的核酸鏈之間，即形成所謂的雜化雙鏈，這個過程稱為雜交。雜交可以發(fā)生于DNA與DNA之間，也可以發(fā)生于RNA與RNA之間和DNA與RNA之間。核酸雜交技術(shù)是目前研究核酸結(jié)構(gòu)、功能常用手段之一，不僅可用來檢驗核酸的缺失、插入，還可用來考察不同生物種類在核酸分子中的共同序列和不同序列以確定它們在進化中的關(guān)系，其主要應(yīng)用如下圖所示：（三）分子雜交：不同來