V免疫技術(shù)

——抗體作為工具

主要內(nèi)容

抗體作為研究和診斷的工具

抗原-抗體反應的特點

抗原-抗體反應的基本檢測方法免疫測定技術(shù)單克隆抗體和重組抗體12345V1抗體作為研究和診斷的工具

應用在哪些方面？⑴用已知抗原檢測未知抗體；⑵用已知抗體檢測未知抗原；⑶定性或定量測定體內(nèi)各種大分子物質(zhì)，用于相關(guān)疾病的診斷或治療；⑷用已知的抗體檢測一些藥物、激素和炎性介質(zhì)等半抗原物質(zhì)，用于檢測血清中的藥物濃度。抗原-抗體結(jié)合產(chǎn)生的效應抗原+抗體抗原顆粒+特異性抗體，導致顆粒凝集可溶抗原+特異性抗體，導致晶格形成及沉淀溶液中的或顆粒上的抗原+特異性抗體，導致補體活化細胞+抗細胞抗體+補體，導致細胞溶解抗原顆粒+抗體+補體，增強單核細胞、巨噬細胞、多核細胞的吞噬作用凝集沉淀補體激活細胞溶解調(diào)理作用中和作用毒素、病毒、酶等+特異性抗體，可導致它們失活二、抗原抗體反應的特點1抗原抗體結(jié)合的特異性和交叉性

抗原抗體的結(jié)合實質(zhì)上是抗原表位與抗體超變區(qū)中抗原結(jié)合點之間的結(jié)合。

如果兩種不同的抗原分子上有一個或多個相同（相似）的抗原表位，或抗原、抗體間構(gòu)型部分相同，皆可出現(xiàn)交叉反應。2抗原抗體結(jié)合的可逆性

抗原抗體結(jié)合除以空間構(gòu)型互補外，主要以氫鍵、靜電引力、范德華力和疏水鍵等分子表面的非共價方式結(jié)合，結(jié)合后形成的復合物在一定條件下可發(fā)生解離，回復抗原抗體的游離狀態(tài)。解離后的抗原和抗體仍保持原有的性質(zhì)。抗原抗體復合物解離度在很大程度上取決于特異性抗體超變區(qū)與相應抗原決定簇三維空間構(gòu)型的互補程度，互補程度越高，分子間距越小，作用力越大，兩者結(jié)合越牢固，不易解離；反之，則容易發(fā)生解離。此外與電解質(zhì)的pH強度和離子強度有關(guān)。

3抗原抗體結(jié)合的比例性與結(jié)合物的可見性

等價帶：抗原與抗體比例最適合，形成大而多的結(jié)合物，此時在反應體系中測不出或有極少游離的抗原或抗體?？贵w過剩帶（前帶）：細胞等顆粒性抗原，與抗體反應時出現(xiàn)的現(xiàn)象。抗原過剩帶（后帶）：小分子可溶性抗原因其表面積大而容易出現(xiàn)的現(xiàn)象。比例不合適4抗原抗體反應的階段性兩個階段抗原抗體的特異性結(jié)合幾秒到幾分鐘可見反應階段時間長，受各種因素影響3溫度

適當?shù)臏囟瓤稍黾涌乖c抗體分子碰撞的機會，加速結(jié)合物體積的增大，一般而言溫度越高，形成可見反應的速度越快，但過高則會使抗原或抗體變性失活，影響實驗結(jié)果。一般在37℃下進行實驗，但也有些抗原抗體在4℃下進行反應較好。4酸堿度

pH過高或過低都將直接影響抗原或抗體的理化性質(zhì)。例如，當pH降至3.0左右時，因接近細菌抗原的等電點，細菌表面蛋白或其他基團所帶的電荷消失，其相互間的排斥力喪失而導致非特異性酸凝集，影響實驗的可靠性。1單相瓊脂擴散

將特異性抗體與融化的瓊脂混合均勻，使抗體均勻分布于瓊脂，然后澆制成瓊脂板，再按一定要求打孔并加入抗原，使抗原向孔周圍自由擴散，與板中的抗體形成沉淀圈。本法為定量試驗，沉淀圈的直徑與抗原濃度成正比。常用于血清中各類免疫球蛋白、AFP等的定量測定。

2火箭電泳

建立在單相瓊脂擴散的基礎(chǔ)上，將瓊脂板至于電場中，使抗原由負極向正極作定向擴散，與板中的抗體結(jié)合形成錐形沉淀峰，峰的高度與抗原濃度成正比。在電場作用下，此方法時間短，可快速測定抗原含量。如在標本中加入同位素標記的抗原，可做放射免疫自顯影。3雙向瓊脂擴散

先制備瓊脂板，再按要求打孔并分別加入抗原和抗體，使兩者同時在瓊脂板上擴散，若兩者對應且比例合適，則在抗原和抗體兩孔之間形成白色沉淀線。一對相應的抗原抗體只形成一條沉淀線，因此可根據(jù)沉淀線的數(shù)目推斷待測抗原液中有多少種抗原成分；根據(jù)沉淀線的吻合、相切或交叉形狀，可鑒定兩種抗原是完全相同、部分相同還是完全不同。4對流免疫電泳

建立在雙向瓊脂擴散的基礎(chǔ)上，抗原孔在負極，抗體孔在正極，在運動過程中形成對流，并在比例適宜處形成白色沉淀線。

此外還有免疫電泳、交叉電泳、免疫選擇電泳、免疫固定電泳，最近建立的散射比濁、速率散射比濁等各種方法。V4免疫測定技術(shù)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)放射免疫測定(RIA)免疫熒光技術(shù)(Immunofluorescence)流式細胞術(shù)(FlowCytometry)免疫印跡(Immunoblotting)親和色譜（AffinityChromatography)2間接法間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標記的抗體以檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。二、放射免疫測定1放射免疫測定

以放射性核素標記的抗原和檢品中未標記抗原與固定量特異性抗體競爭結(jié)合，或進行競爭性抑制反應。

是以放射性核素作為示蹤劑的標記免疫測定方法，其特點是將核素分析的靈敏度與抗原—抗體反應的特異性相結(jié)合。2免疫放射測定是將待測抗原與過量標記抗體直接反應，然后加入固相的抗原免疫吸附劑與游離的標記抗體結(jié)合。經(jīng)離心去除沉淀物，測定上清液放射性強度，從而推算出檢品中待測抗原含量。三、免疫熒光技術(shù)

其實質(zhì)是熒光素標記的抗體（抗原）與抗原（抗體）的反應，用于檢測各類病原體。應用特異性熒光抗體直接檢查標本中的相應抗原。以特異性抗體（或待測抗體）為第一抗體，以熒光素標記的抗球蛋白抗體（標記的抗體）為第二抗體，用于檢測抗體或抗原。此法是在間接法的第一步抗原—抗體反應加入補體，使之與抗原—抗體復合物結(jié)合；再用熒光素標記的抗補體抗體進行示蹤。

工作原理：首先樣品經(jīng)過與多種熒光素標記的抗體反應，因熒光素發(fā)射光譜的波長不同，信號能同時被接收，故能同時接收細胞表面多個膜分子表達及其水平。此外，借助光電效應，微滴通過電場是出現(xiàn)不同的偏向，可分類收集所需細胞。

五、免疫印跡

免疫印跡又稱蛋白質(zhì)印跡，是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測復雜樣品中的某種蛋白的方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術(shù)。由于免疫印跡具有SDS的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù)。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白，并能對蛋白進行定性和半定量分析。

六、親和色譜

在生物分子中有些分子的特定結(jié)構(gòu)部位能夠同其他分子相互識別并結(jié)合，如酶與底物的識別結(jié)合、受體與配體的識別結(jié)合、抗體與抗原的識別結(jié)合，這種結(jié)合既是特異的，又是可逆的，改變條件可以使這種結(jié)合解除。生物分子間的這種結(jié)合能力稱為親和力。親和層析就是根據(jù)這樣的原理設(shè)計的蛋白質(zhì)分離純化方法。由于抗原—抗體的結(jié)合部形成共價鍵，與不溶性基質(zhì)偶聯(lián)的抗體可特異性的結(jié)合期抗原，把它從其它分子的混合物中移出。洗滌后，去掉所有未結(jié)合的分子，在打破保持抗原對抗體的可逆鍵的低pH或高離子強度下，將抗原洗脫下來。由于通常使用這一方法不會破壞抗原或抗體，所以有可能一步就獲得比較純的抗原。同理，抗原也是如此。三個要素：介質(zhì)：具有活化基團間隔臂—連接介質(zhì)與配體的分子配體：具有識別能力反配體或分離物：與配體進行可逆結(jié)合V5單克隆抗體與重組抗體一、單克隆抗體

是由一個克隆B細胞產(chǎn)生的、只作用于單一抗原表位的高度特異性抗體。單抗的特點：1高度的均質(zhì)性：始于一個B細胞的克隆系2高度的特異性：針對單個抗原決定簇3來源穩(wěn)定，產(chǎn)量大主要步驟抗原的制備免疫動物免疫細胞、骨髓瘤細胞的制備細胞融合（核心步驟）雜交瘤細胞的選擇培養(yǎng)雜交瘤細胞的篩選雜交瘤細胞的克隆單克隆抗體的鑒定單克隆抗體的大量制備應用：A作為工具B診斷：單克隆抗體具有高度的特異性與靈敏性，可以廣泛地由于臨床醫(yī)學的疾病診斷，以提高疾病診斷的準確性。C預防：利用單克隆抗體技術(shù)可以生產(chǎn)各種免疫疫苗，這不僅能大大降低生產(chǎn)成本，同時也增加了疫苗的安全性。D治療：單克隆抗體還有可能用于某些腫瘤的治療。二、多克隆抗體

用一種包含多種抗原決定簇的抗原免疫動物，可刺激機體多個B細胞克隆產(chǎn)生針對多種抗原表位的不同抗體。所獲得免疫血清實際上是含有多種抗體的混合物，即多克隆抗體。產(chǎn)生示意圖多克隆抗體的特點多克隆抗體優(yōu)勢：作用全面來源廣泛制備容易缺點：特異性不高易出現(xiàn)交叉反應應用受限三、mAb的人源化和嵌合體

1人源化鼠的抗體

鼠的抗體可被修飾成遺傳上更接近人的抗體。特別是鼠的IgG重鏈和鼠的輕鏈的恒定區(qū)在DNA水平上可以用人IgG1重鏈和輕鏈的恒定區(qū)所取代，以創(chuàng)建一個只有可變區(qū)（V）來源于鼠類的嵌合抗體。這明顯地降低但并沒有消除此抗體的免疫原性。另一種方法包括測定小鼠抗體重鏈和輕鏈的V區(qū)序列，然后將這些鏈的高變區(qū)的DNA序列插入人的IgG重鏈和輕鏈基因中。這樣產(chǎn)生的抗體95％是人的，僅結(jié)合區(qū)是源于鼠的。嵌合抗體人源化抗體2直接制備人的mAb

通過人的B細胞和骨髓瘤細胞融合，已經(jīng)制成了人的抗體，雖然這曾是十分困難的，并且通常在融合前需要用EB病毒感染以無限增殖B細胞。這種方法由于使用病毒而不理想，產(chǎn)生的mAb的特異性是有限的，抗體的產(chǎn)量也很少。最近，通過用人免疫球蛋白基因取代小鼠免疫球蛋白基因創(chuàng)建了產(chǎn)生人抗體的小鼠。因此，當小鼠被免疫時，它直接制造出對該抗原的人的抗體，并且產(chǎn)生這些抗體的B細胞可與骨髓瘤細