氧化應(yīng)激與糖尿病視網(wǎng)膜病變凌靜，欒潔中國江蘇省南京市，東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院眼科【摘要】糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabeticretinopathy,DR)是糖尿病最常見和最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，目前發(fā)病機(jī)制尚未明確。氧化應(yīng)激與多種代謝異常、細(xì)胞因子活化以及細(xì)胞凋亡等關(guān)系密切并相互作用，在DR的發(fā)生、發(fā)展過程中可能發(fā)揮了關(guān)鍵性作用?？寡趸瘎┳铚﨑R的作用在動物實(shí)驗(yàn)中得以證實(shí)，但臨床試驗(yàn)結(jié)果卻不確定。目前有大量關(guān)于氧化應(yīng)激與DR的研究，并且也有眾多學(xué)者致力于抗氧化劑在DR治療作用方面的研究，本文就相關(guān)研究進(jìn)展做一綜述?！娟P(guān)鍵詞】氧化應(yīng)激；糖尿病視網(wǎng)膜病變；抗氧化劑糖尿病患者因糖代謝障礙導(dǎo)致全身各組織器官的微血管發(fā)生病變，其中糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabeticretinopathy，DR)是其最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一［1］，也是目前發(fā)達(dá)國家成人致盲的主要原因［2］。目前。日的發(fā)生機(jī)制尚未明確，Brownlee［3］提出的糖尿病慢性并發(fā)癥的統(tǒng)一機(jī)制學(xué)說認(rèn)為：引起糖尿病各并發(fā)癥的四條經(jīng)典通路，即多元醇通路激活、晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)增加、蛋白激酶C(PKC)激活、氨基己糖途徑，實(shí)質(zhì)上都是高糖誘導(dǎo)過氧化物過表達(dá)的結(jié)果，氧化應(yīng)激是糖尿病并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展的重要因素［4］。1氧化應(yīng)激在生理狀況下，呼吸鏈電子傳遞過程中可以產(chǎn)生超氧離子(02-)(占耗02的1%?4%)，體內(nèi)其他物質(zhì)(如黃嘌吟)氧化時也可產(chǎn)生02-。02-可進(jìn)一步生成H202和羥自由基(?0H)等，統(tǒng)稱為活性氧(reactiveoxygenspecies，R0S)。細(xì)胞在維持其正常功能的過程中均在不停地制造R0S，而正常的氧化代謝中產(chǎn)生的R0S都能被體內(nèi)有效的清除系統(tǒng)清除。若R0S產(chǎn)生和清除之間的失衡，就會導(dǎo)致R0S水平升高，引起組織損傷，即發(fā)生氧化應(yīng)激°R0S化學(xué)性質(zhì)活潑，很快就會與周圍物質(zhì)反應(yīng)，故難以直接檢測。而DNA、蛋白質(zhì)和脂類受到氧化損傷后生成的氧化產(chǎn)物可以作為反映氧化應(yīng)激的標(biāo)志物。8羥基脫氧鳥苷酸(80HdG)，在體內(nèi)較為穩(wěn)定、易于檢測，被視為DNA氧化損傷的生物標(biāo)志物。蛋白質(zhì)氧化損傷的一個重要標(biāo)志物是硝基酪氨酸(NT)。脂質(zhì)的過氧化產(chǎn)物大部分源于不飽和脂肪酸，易于分解為一些化合物，其中包括異前列腺素類分子、正構(gòu)醛、丙二醛、丙烯醛等。2糖尿病中的氧化應(yīng)激目前已經(jīng)有很多研究都證實(shí)了糖尿病時，02和上述氧化應(yīng)激間接標(biāo)志物的表達(dá)都是增加的。動物研究表明糖尿病新西蘭家兔血漿中的O2-和F2異前列腺素（一種異前列腺素類分子）水平較對照組升高［3］。Nishikawa等［6］研究發(fā)現(xiàn)，高糖可以作為一個獨(dú)立因素而引起2型糖尿病患者血漿和尿中的8OHdG水平增高。針對1型糖尿病患者的研究發(fā)現(xiàn)，血漿NT水平升高［7］，尿中的F2異前列腺素水平明顯升高，使用胰島素控制血糖后F2異前列腺素明顯下降，但仍高于正常對照組［8］。這些都直接或間接證實(shí)了糖尿病時氧化應(yīng)激的存在。糖尿病的氧化應(yīng)激可能源自于葡萄糖自氧化作用、氧化還原反應(yīng)平衡的偏移、組織中抗氧化劑［例如還原型谷胱甘肽（GSH），維生素E］的減少以及抗氧化防御系統(tǒng)相關(guān)酶［例如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）］的活性下降［9］。3氧化應(yīng)激與糖尿病視網(wǎng)膜病變視網(wǎng)膜有大量的多不飽和脂肪酸，而且攝氧量和葡萄糖氧化作用均高于其他組織，這使得視網(wǎng)膜對于氧化應(yīng)激更加敏感。Du等［10］研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜和高糖培養(yǎng)的傳代視網(wǎng)膜Muller細(xì)胞、牛視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中，02的水平都是升高的。Kowluru等［11］研究表明即使糖尿病大鼠血糖控制良好，視網(wǎng)膜中增多的氧化應(yīng)激標(biāo)志物仍不會明顯下降，這說明氧化應(yīng)激不僅參與7DR的發(fā)病過程，還與代謝記憶現(xiàn)象（血糖控制良好后DR仍不可逆）相關(guān)。糖尿病時，視網(wǎng)膜中的抗氧化防御酶（包括SOD、CAT、谷胱甘肽還原酶、谷胱甘肽過氧化物酶）均減少［9］。另外，在高糖誘發(fā)的氧化應(yīng)激中，非酶類的抗氧化劑（例如維生素C、維生素E、胡蘿卜素等）在人體血液中的濃度也明顯下降［12］。所以目前認(rèn)為氧化應(yīng)激是DR發(fā)病機(jī)制中的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。3.1氧化應(yīng)激與多條代謝通路的關(guān)系氧化應(yīng)激除了損傷生物大分子外，還和與DR密切相關(guān)的代謝通路有著錯綜復(fù)雜的關(guān)系，這其中包括多元醇途徑、晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）途徑、蛋白激酶C（PKC）途徑、氨基己糖途徑等。3.1.1多元醇途徑多元醇途徑是葡萄糖代謝途徑之一，涉及葡萄糖向山梨醇的轉(zhuǎn)變過程，此反應(yīng)中醛糖還原酶是限速酶。糖尿病中增加的多元醇途徑之所以會增強(qiáng)氧化應(yīng)激，是因?yàn)槿┨沁€原酶需要NADPH，而多元醇途徑活性增強(qiáng)通過和谷胱甘肽還原酶競爭NADPH而導(dǎo)致NADPH相對不足，這樣胞內(nèi)的抗氧化劑GSH的再生受到限制［13］。而醛糖還原酶抑制劑可以對抗糖尿病患者視網(wǎng)膜中蛋白質(zhì)和DNA的氧化損傷［14］。3.1.2AGEs途徑AGEs是葡萄糖及其自身氧化后的酮糖和蛋白質(zhì)副鏈通過非酶促反應(yīng)形成的，并隨著葡萄糖的增加而增加。在視網(wǎng)膜病變的晚期，AGEs不可逆轉(zhuǎn)地存在并且在視網(wǎng)膜毛細(xì)血管細(xì)胞內(nèi)堆積，AGEs途徑被認(rèn)為是通過激活核轉(zhuǎn)錄因子NFkB繼而導(dǎo)致進(jìn)一步的細(xì)胞損傷來產(chǎn)生過量的RQS［15］oAGEs增加視網(wǎng)膜血管細(xì)胞的蛋白質(zhì)氧化損傷并促發(fā)一系列通過激活NFkB和caspase3而導(dǎo)致視網(wǎng)膜毛細(xì)血管細(xì)胞凋亡的事件［16］。3.1.3PKC途徑高糖增加RQS的產(chǎn)生以及甘油二酯的合成，進(jìn)而增強(qiáng)PKC的活性。激活的PKC會引起一系列DR特征性的改變，包括血管滲出增多，血流量增加，激素水平和生長因子受體再循環(huán)的改變，刺激新生血管形成，內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡，以及一系列因子例如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、胰島素樣生長因子1(IGF1)和轉(zhuǎn)化生長因子(TGFB)活動的調(diào)節(jié)。Wu等［17］研究發(fā)現(xiàn)PKCB特異性抑制劑(LY333531)可以通過抑制PKC活性來預(yù)防糖尿病引發(fā)的氧化應(yīng)激。此外，動物研究表明缺乏PKCB類似物的大鼠不出現(xiàn)糖尿病引發(fā)的氧化應(yīng)激［18］。這些資料都表明PKC與氧化應(yīng)激確有聯(lián)系，支持PKC在RQS介導(dǎo)的糖尿病并發(fā)癥中發(fā)揮作用。3.1.4氨基己糖途徑RQS抑制3磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)，導(dǎo)致所有糖酵解的產(chǎn)物轉(zhuǎn)向氨基己糖途徑，產(chǎn)生二磷酸尿嘌吟N乙酰葡萄糖胺(UDPGlcNAc)，而UDPGlcNAc是包括轉(zhuǎn)錄因子在內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)因子轉(zhuǎn)錄后修飾的底物。激活的氨基己糖途徑產(chǎn)生的氨基葡萄糖可增加H202水平，而抗氧化治療可以阻滯氨基己糖途徑所致的糖基化作用和其他有害作用［19］。但是目前關(guān)于氨基己糖途徑在DR發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮的作用的研究仍然較少。3.2氧化應(yīng)激與細(xì)胞因子的關(guān)系DR的發(fā)生發(fā)展受到多種細(xì)胞因子的影響，而氧化應(yīng)激與這些細(xì)胞因子之間也有著密切的關(guān)系。3.2.1血管內(nèi)皮生長因子血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)是一種血管生成誘導(dǎo)劑，對于視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞有促有絲分裂作用，還可以增加血管通透性［20］。不論是非增殖性DR還是增殖性DR，它都在其中發(fā)揮著介質(zhì)和起始因子的作用，臨床及動物實(shí)驗(yàn)均已證實(shí)DR個體眼內(nèi)特別是視網(wǎng)膜局部存在高水平的VEGF［21］。在糖尿病微血管并發(fā)癥中，氧化應(yīng)激在高糖引發(fā)的VEGF病理學(xué)作用過程中發(fā)揮了一定的作用。RQS可以導(dǎo)致大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層以及色素上皮細(xì)胞(RPE)層以及體外的人的RPE、牛血管平滑肌細(xì)胞中VEGFmRNA和蛋白的表達(dá)上調(diào)，而使用抗氧化劑可以抑制這種上調(diào)［22］。3.2.2色素上皮衍生因子色素上皮衍生因子(pigmentepitheliumderivedfactor,PEDF)被認(rèn)為是最有效的天然的血管抑制因子，也被證明與主要的血管刺激因子VEGF之間存在一種互逆的調(diào)節(jié)［23］。近年來的研究一致認(rèn)為在DR中PEDF是一個保護(hù)性因子，且很多研究認(rèn)為它的保護(hù)作用是通過抗氧化的特性來實(shí)現(xiàn)的［21］。Amano等［24］進(jìn)行的細(xì)胞培養(yǎng)研究表明，PEDF可以保護(hù)周細(xì)胞免受AGEs的損傷；AGEs或RQS可抑制視網(wǎng)膜周細(xì)胞內(nèi)PEDFmRNA的表達(dá)，造成PEDF水平下降，而PEDF水平的下降又可以進(jìn)一步加劇氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的周細(xì)胞凋亡及功能障礙，繼而促進(jìn)DR的發(fā)展［25］。3.2.3胰島素樣生長因子1胰島素樣生長因子Kinsulinlikegrowthfactor1,IGF1)是一種具有胰島素樣作用的多肽類因子，對于內(nèi)皮細(xì)胞有直接促有絲分裂作用，包括促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化以及新生血管形成，還可以通過激活PKC刺激葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)至視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，并可以調(diào)節(jié)VEGF活性的表達(dá)［26］。盡管IGF1在DR發(fā)病機(jī)制中的確切作用尚不明朗，但是氧化應(yīng)激可能通過PKC途徑調(diào)控IGF1。3.3氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡在疾病的特征性組織病理學(xué)改變出現(xiàn)之前，細(xì)胞往往就已經(jīng)出現(xiàn)凋亡加快，DR也是如此。暴露在高糖環(huán)境的周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞或者糖尿病動物都發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激增加，caspase3活性增加以及其他轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)增加，這些都會導(dǎo)致毛細(xì)血管細(xì)胞死亡［27,28］。在糖尿病小鼠視網(wǎng)膜微血管中觀察到dUDP切口末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記物(TUNEL)陽性細(xì)胞［29］。一些生物化學(xué)研究也證明了糖尿病視網(wǎng)膜中Bax(一種促凋亡蛋白)表達(dá)的增加，這是凋亡在組織學(xué)上的證據(jù)［30］。盡管DR的確切信號步驟還不明確，但是已發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡與氧化應(yīng)激活化caspase家族和NFkB是相關(guān)的，糖尿病時抑制過氧化物的堆積可以阻滯視網(wǎng)膜毛細(xì)血管細(xì)胞的凋亡［31］。氧化應(yīng)激導(dǎo)致凋亡增加的機(jī)制很復(fù)雜，可能與膜脂質(zhì)過氧化作用、細(xì)胞生存所需大分子的損傷、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)的改變相關(guān)。ROS可以通過改變細(xì)胞氧化還原電位、消耗GSH和降低ATP水平來導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。ROS的釋放增加視網(wǎng)膜細(xì)胞線粒體的通透性，觸發(fā)細(xì)胞色素C從線粒體中釋放，Bax移位至線粒體，繼而通過激活caspase家族而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，在糖尿病視網(wǎng)膜以及視網(wǎng)膜毛細(xì)血管細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)中細(xì)胞色素C和線粒體中Bax的表達(dá)增加［32］。Caspase家族是一組介導(dǎo)細(xì)胞凋亡必需的半胱氨酸蛋白酶，目前認(rèn)為它們對于氧化應(yīng)激非常敏感。ROS導(dǎo)致的線粒體功能障礙，使得細(xì)胞色素C由線粒體釋放至細(xì)胞質(zhì)，激活caspase9，進(jìn)而引發(fā)一系列激活caspase3的級聯(lián)效應(yīng)，而caspase3發(fā)揮的是裂解DNA的作用。糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中caspase3是被激活的，而給予抗氧化劑的治療也抑制7caspase3的活性［28］，這表明氧化應(yīng)激增強(qiáng)可以通過caspase3途徑促進(jìn)視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡。另一種細(xì)胞凋亡介導(dǎo)物是對于氧化還原反應(yīng)敏感的NFkB。盡管NFkB是發(fā)揮阻滯還是促進(jìn)凋亡的作用取決于細(xì)胞類型和疾病狀態(tài)，多數(shù)研究認(rèn)為糖尿病導(dǎo)致的視網(wǎng)膜以及視網(wǎng)膜毛細(xì)血管細(xì)胞中NFkB激活是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的。有研究［27］發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞凋亡或者發(fā)現(xiàn)組織病理學(xué)改變之前，高糖培養(yǎng)的視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞或者糖尿病動物視網(wǎng)膜中NFkB即已被激活，在病理組織學(xué)進(jìn)展的同時NFkB的激活一直在持續(xù)，而給予抗氧化劑治療可以在不改善血糖的情況下抑制NFkB的激活，表明NFkB的激活是DR的一項(xiàng)早期征象，抗氧化劑的治療潛能也可能包含了抑制NFkB以及其下游路徑的激活。4抗氧化劑治療糖尿病視網(wǎng)膜病變大量研究都提示，氧化應(yīng)激是DR發(fā)生發(fā)展過程中的重要因素，而抗氧化劑可以抑制ROS的生成、清除自由基、增強(qiáng)抗氧化防御系統(tǒng)的功能，所以恰當(dāng)?shù)厥褂每寡趸瘎┰谥委烡R方面具有很大的潛能。a-硫辛酸是一種對于巰基二硫鍵轉(zhuǎn)換起作用的抗氧化劑。它可以清除ROS，還原谷胱甘肽來維持一個健康的細(xì)胞氧化還原狀態(tài)。它分布到線粒體內(nèi)，充當(dāng)線粒體酶復(fù)合體中一個關(guān)鍵的輔助因子，而且可以通過糖酵解途徑再生。對于糖尿病大鼠的研究提示，a硫辛酸可以抑制大鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管細(xì)胞凋亡，減少無細(xì)胞性毛細(xì)血管的數(shù)量，抑制DNA氧化修飾，降低8OHdG水平，降低VEGF和氧化修飾蛋白水平，并完全阻滯糖尿病誘導(dǎo)的NT增高和NFkB的激活。表明長期給予a-硫辛酸可以抑制視網(wǎng)膜病變的發(fā)展［33］。除了能減少微血管損害以外，復(fù)合抗氧化劑（包括維生素C、a維生素E、Trolox、N乙酰半胱氨酸、5胡蘿卜素和硒）還可以消除糖尿病誘發(fā)的視網(wǎng)膜PKC和NO的增加［9］,抑制NFkB［27］和caspase3［28］的表達(dá)。基因研究表明在小鼠中增加線粒體SOD的表達(dá)可以填補(bǔ)糖尿病誘導(dǎo)視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激中減少的部分，并且可以防止線粒體功能障礙［25］,這項(xiàng)研究在藥理學(xué)方面提升了MnSOD類似物用于阻滯DR的可能性。目前研究的還有綠茶多酚、鋅、尼卡那汀等，大量