《酶學(xué)與酶工程》課程復(fù)習(xí)生工班專屬，最好不要傳到外面，這是第一版，課程還有一兩講的內(nèi)容以及其他的實際例子補充待優(yōu)化，標(biāo)紅的概念都是老師上課說必考的部分，大家認(rèn)真看下，截圖部分的內(nèi)容都比較重要，生化已經(jīng)講過的部分大家可以少看，估計不考，考試快到啦，大家加油考高分！第一講：酶學(xué)與酶工程概論酶（enzyme）是一類由活細(xì)胞產(chǎn)生的，具有催化活性和高度專一性的特殊蛋白質(zhì)，是一類生物催化劑。（人體和哺乳動物體內(nèi)含有5000種酶）溶解于細(xì)胞質(zhì)中，或是與各種膜結(jié)構(gòu)結(jié)合在一起，或是位于細(xì)胞內(nèi)其他結(jié)構(gòu)的特定位置上(是細(xì)胞的一種產(chǎn)物），只有在被需要時才被激活，這些酶統(tǒng)稱胞內(nèi)酶。在細(xì)胞內(nèi)合成后再分泌至細(xì)胞外的酶──胞外酶酶催化作用實質(zhì)：降低化學(xué)反應(yīng)活化能酶特點：強大的催化能力，沒有副反應(yīng)，高度的專一性，可調(diào)節(jié)性，易變性應(yīng)用受限制的原因：脫離其生理環(huán)境后不穩(wěn)定，酶的分離純化工藝復(fù)雜，酶制劑成本較高酶工程主要指天然酶制劑在工業(yè)上的大規(guī)模應(yīng)用，由四部分組成，生產(chǎn)，分離純化，固定化，生物反應(yīng)器化學(xué)酶工程（天然酶，化學(xué)修飾酶，固定化酶，化學(xué)人工合成酶）生物酶工程（抗體酶，雜合酶，進化酶，核酸酶）命名：系統(tǒng)命名和4個數(shù)字分類的酶編號E.C代表按國際酶學(xué)委員會規(guī)定的命名第1個數(shù)字(2)代表酶的分類名稱(轉(zhuǎn)移酶類)第2個數(shù)字(7)代表亞類(磷酸轉(zhuǎn)移酶類)第3個數(shù)字(1)代表亞亞類(以羥基作為受體的磷酸轉(zhuǎn)移酶類)第4個數(shù)字(1)代表該酶在亞-亞類中的排號(D葡萄糖作為磷酸基的受體）單體酶、寡聚酶：僅有一個活性中心的多肽鏈構(gòu)成的酶由一條多肽鏈組成，如牛胰島素、胰核糖核酸酶溶菌酶等，稱為單體酶由多條多肽鏈組成，如胰凝乳蛋白酶，由三條肽鏈組成，鏈間由二硫鍵相連構(gòu)成一個共價整體，這類含幾條肽鏈的單體酶往往是由一條前體肽鏈經(jīng)活化斷裂而生成，稱為寡聚酶。多酶復(fù)合物：體內(nèi)有些酶彼此聚合在一起，組成一個物理的結(jié)合體多功能酶：酶分子中存在多種催化活性部位的酶酶的調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)對象：關(guān)鍵酶一般位于代謝途徑的起始或分支處；催化單向不可逆反應(yīng)；活性較低，活性最低者又稱為限速酶；是可調(diào)節(jié)酶。調(diào)節(jié)方式：酶活性的調(diào)節(jié)（快速調(diào)節(jié)）：水解激活；別構(gòu)調(diào)節(jié)；共價修飾，調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合和解離以及單體的聚合和解離。酶含量的調(diào)節(jié)（緩慢調(diào)節(jié)）：同工酶（指催化相同的反應(yīng)但性質(zhì)不同（Vmax和/或Km不同）的酶）一講后附注：核酸酶指所有可以水解核酸的酶，本質(zhì)為蛋白質(zhì)。在細(xì)胞內(nèi)催化核酸的降解。可分為DNA酶和RNA酶；外切酶和內(nèi)切酶；其中一部分具有嚴(yán)格的序列依賴性，稱為限制性內(nèi)切酶（）。

核酶和脫氧核酶是具有高效、特異催化作用的核糖核酸和脫氧核糖核酸，主要作用于核酸。第二講：酶促反應(yīng)動力學(xué)特點：具有極高的效率（降低活化能）；高度特異性（絕對特異性，相對特異性，立體結(jié)構(gòu)特異性）；催化條件溫和米氏方程式：反應(yīng)速度逐漸趨近的恒定值稱為最大反應(yīng)速度Vmax。對于給定酶量的可以定義為處于飽和底物濃度的起始反應(yīng)速度。Km稱為米氏常數(shù)。Km值等于酶促反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時的底物濃度，單位是mol/L。Km是酶的特征性常數(shù)之一：經(jīng)常表示酶與底物的親和力。Km值越大，親和力越小。反應(yīng)影響因素底物濃度：反應(yīng)速度與底物濃度成正比；反應(yīng)為一級反應(yīng)。反應(yīng)速度不再成正比例加速；反應(yīng)為混合級反應(yīng)。反應(yīng)速度不再增加，達最大速度；反應(yīng)為零級反應(yīng)酶濃度：溫度：雙重影響，最適溫度PH值：激活劑：使酶由無活性變?yōu)橛谢钚曰蚴姑富钚栽黾拥奈镔|(zhì)。無機離子（鎂離子）；有機小分子（還原劑，Vc，EDTA）抑制劑：凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白變性的物質(zhì)統(tǒng)稱為酶的抑制劑。酶的活性單位：在規(guī)定條件下，酶促反應(yīng)在單位時間（s、min或h）內(nèi)生成一定量（mg等）的產(chǎn)物或消耗一定數(shù)量的底物所需的酶量。國際單位(IU)：在特定的條件下，每分鐘催化1mol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量為一個國際單位活力測定方法：分光光度法（spectrophotometry）熒光法（fluorometry）同位素法（isotopemethod）電化學(xué)方法（electrochemicalmethod）其他方法：如旋光法、量氣法、量熱法和層析法等終止反應(yīng)：沸水煮沸；酶變性劑；加入酸或者堿；置于冰堆。第三講：基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)1.2.限制性核酸內(nèi)切酶：是一組可以特異性地識別DNA上的某一特定序列，并將之水解的核酸酶。同位酶：識別相同序列切點不同。同裂酶：識別位點相同，酶的來源不同。同尾酶：識別位點不同，切出片段有相同末端序列。（同尾酶的粘性末端結(jié)合形成的新位點不能再被原來的酶識別）影響限制性內(nèi)切酶活性因素酶純度：酶加入量不超過總體積的十分之一DNA樣品濃度DNA的甲基化程度：甲基化作用直接影響限制性內(nèi)切核酸酶的活性酶切反應(yīng)的溫度和時間：大多溫度是37℃DNA分子的結(jié)構(gòu)：核酸內(nèi)切酶切割超螺旋的質(zhì)粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化線性DNA高出許多倍。識別序列兩端必須有一定數(shù)量的核苷酸，否則限制酶將難以發(fā)揮切割活性。限制性內(nèi)切核酸酶的反應(yīng)緩沖液：Tris-Cl：最佳PH=7.4MgCl2：保持酶活性的正常發(fā)揮NaCl或KCl：同上β-巰基乙醇：防止限制酶的氧化，保持酶的穩(wěn)定性牛血清白蛋白（BSA）：中性蛋白，可防止酶在低濃度蛋白質(zhì)溶液中變性鹽濃度：對鹽濃度要求相同的酶，原則上可同時酶切星號活性：限制性內(nèi)切核酸酶的識別位點是在特定的消化條件下測定的，當(dāng)條件改變時，有些酶的識別位點也隨之改變，可能切割一些與特異識別序列相類似的序列酶切產(chǎn)物檢測：瓊脂糖凝膠電泳法；SouthernBlot法基因克隆表達過程：目的基因的獲取，DNA導(dǎo)入受體菌，外源基因與載體的連接，克隆載體的選擇和構(gòu)建，重組體的篩選，克隆基因的表達目的基因獲取方法：化學(xué)合成法；基因組DNA文庫（存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合）；cDNA文庫；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)基因載體：克隆載體，表達載體，質(zhì)粒，粘性質(zhì)粒（可以利用噬菌體將重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞，不產(chǎn)生子代噬菌體，以質(zhì)粒DNA形式存在），λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)（λgt系列（插入型，適用cDNA克?。?，EMBL系列（置換型，適用基因組克?。?，M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因），酵母人工染色體，細(xì)菌人工染色體，動物病毒DNA改造的載體。外源基因與載體的連接：粘性末端連接：(1)同一限制酶切位點連接(2)不同限制酶切位點連接配伍末端連接非配伍末端連接平端連接：適用于限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端或者粘端補齊或切平形成的平端缺點：載體自連或者目的基因自連同聚物加尾連接：在末端轉(zhuǎn)移酶的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接。人工接頭連接：由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進行粘端連接。重組DNA導(dǎo)入受體菌：轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)染，感染重組體的篩選：直接選擇：抗藥性標(biāo)記選擇標(biāo)志補救分子雜交法（原位雜交，southern印記）免疫學(xué)方法：平板篩選：插入失活：當(dāng)外源DNA序列插入質(zhì)粒中某一抗藥基因內(nèi)，使該基因失活，轉(zhuǎn)化細(xì)胞就不能生長在含相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)平板上。藍白斑篩選：限制酶切圖譜篩選PCR篩選重組體原位雜交技術(shù)第四講：ZFN,TALEN,CRISPR基因打靶：將精心設(shè)計的外源同源基因載體導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞（ESC），外源DNA與ESC基因組之間便可發(fā)生同源重組，使靶基因發(fā)生定向整合、修飾而失活或置換基因敲除：通過同源重組失活或剔除某個基因基因敲入：通過同源重組使突變基因被置換基因敲除技術(shù)：同源重組：插入突變：利用某些能隨機插入基因序列的病毒，細(xì)菌或其他基因載體，在目標(biāo)細(xì)胞基因組中進行隨機插入突變，建立一個攜帶隨機插入突變的細(xì)胞庫，然后通過相應(yīng)的標(biāo)記進行篩選獲得相應(yīng)的基因敲除細(xì)胞RNAi：ZFN-鋅指核酸酶鋅指蛋白是真核生物中普遍存在的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,在細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育等方面起重要作用。鋅指結(jié)構(gòu)域是轉(zhuǎn)錄因子用于識別靶DNA的蛋白結(jié)構(gòu)域,因為這種蛋白結(jié)構(gòu)域絡(luò)合了一個鋅離子,所以稱之為鋅指結(jié)構(gòu)域FokI核酸內(nèi)切酶鋅指核酸酶是鋅指蛋白和FokI核酸內(nèi)切酶的剪切結(jié)構(gòu)域組成的嵌合融合蛋白,其鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)識別靶位點,依賴FokI的作用打斷DNA雙鏈,從而造成雙鏈斷裂(doublestrandbreak,DSB)，斷開的雙鏈DNA在修復(fù)過程中會發(fā)生堿基的缺失、插入、同源交換等突變（鋅指蛋白：識別區(qū)域；Fokl：酶切區(qū)域）缺點：不是任意三連堿基組合都有對應(yīng)模塊——靶點選擇受限?！吧舷挛男?yīng)”（contexteffect）：模塊單元對3連堿基的識別特異性受相鄰模塊影響。Off-targeting現(xiàn)象嚴(yán)重。ZFNs的合成組裝技術(shù)難度大，一般實驗室難以實施，而且ZFNs易于對基因組進行非特異性切割，或?qū)Π悬cDNA切割效率低，一直限制其進入實際應(yīng)用。TALEN-TALE蛋白：由12個或以上特異性識別DNA的串聯(lián)“蛋白模塊”和兩側(cè)的N-末端及C-末端序列組成。來源于黃單胞菌屬Fokl核酸內(nèi)切酶：TALENs和ZFNs使用相同的Fokl酶TALE核酸酶的結(jié)構(gòu)：DNA識別區(qū)（TALE蛋白）：TALE蛋白是由植物病原體黃單胞菌屬分泌的一種蛋白,能特異性的識別并結(jié)合DNA序列剪切結(jié)構(gòu)域（Fokl）：Fokl則可通過二聚化產(chǎn)生核酸內(nèi)切酶活性,在該序列附近造成DNA的雙鏈斷裂。TALENs靶向基因修飾的原理：基因敲除步驟：靶點識別模塊構(gòu)建；表達質(zhì)粒構(gòu)建；質(zhì)粒對共轉(zhuǎn)入細(xì)胞；目標(biāo)基因敲除突變體篩選優(yōu)勢：TALE的核酸識別單元與A、G、C、T有恒定的對應(yīng)關(guān)系。靶序列識別模塊不受上下游影響，特異識別并打斷基因組中的任意靶序列。無基因序列、細(xì)胞、物種限制。毒性低、脫靶情況少。成對的TALE識別模塊保證了基因敲除靶點的準(zhǔn)確性。已經(jīng)成功應(yīng)用到了植物、細(xì)胞、酵母、斑馬魚及大、小鼠等各類研究對象。CRISPR-CasCRISPR-Cas：一種來源是細(xì)菌獲得性免疫的由RNA指導(dǎo)Cas蛋白對靶向基因進行修飾的技術(shù)。CRISPR-Cas前景：CRISPRs比TALENs更容易操作，因為每一對TALENs都需要重新合成，而用于CRISPR的gRNA只需要替換20個核苷酸就行。CRISPR-Cas系統(tǒng)的技術(shù)優(yōu)勢：只需合成一個sgRNA就能實現(xiàn)對基因的特異性修飾，Cas蛋白不具特異性。編碼sgRNA的序列不超過100bp，因此比構(gòu)建TALENs和ZFNs更簡單方便。較短的sgRNA序列也避免了超長、高度重復(fù)的TALENs編碼載體帶來的并發(fā)癥。降低細(xì)胞毒性，降低脫靶幾率。廉價，可操作性強。相對ZFN,TALEN更容易調(diào)節(jié)。存在的問題：如果目標(biāo)序列不存在PAM,則不可用。僅需十余個堿基的精確配對，降低切割特異性。是一種原核系統(tǒng)，針對真核細(xì)胞中染色體的各種修飾結(jié)構(gòu)是否能夠無差別的進行高效的切割還需要進一步探究。和ZFN及TALEN一樣，存在雙鏈斷裂之后非同源末端連接修復(fù)可能隨機產(chǎn)生細(xì)胞毒性的問題。第五講：酶的發(fā)酵生產(chǎn)酶生物合成的模式：同步合成型（生長耦聯(lián)型）：酶的生物合成和細(xì)胞生長同步進行。酶的合成可以誘導(dǎo)，但不受分解代謝物阻遏和反應(yīng)產(chǎn)物阻遏。mRNA很不穩(wěn)定大部分組成酶，部分誘導(dǎo)酶延續(xù)合成型：酶的生物合成在細(xì)胞的生長階段開始，在細(xì)胞進入平衡器后還繼續(xù)合成。酶的合成可受誘導(dǎo)但不受分解代謝物阻遏和產(chǎn)物阻遏mRNA相當(dāng)穩(wěn)定組成酶，誘導(dǎo)酶中期合成型：酶在細(xì)胞生長一段時間后才開始合成，進步平衡期后，酶的生長停止。受到反饋阻遏mRNA是不穩(wěn)定的枯草桿菌堿性磷酸酶滯后合成型（非生長耦聯(lián)型）：細(xì)胞生長一段時候后或進入平衡期后，酶才開始合成。受到培養(yǎng)基中存在的阻遏物的阻遏作用酶所對應(yīng)的mRNA穩(wěn)定性相當(dāng)好許多水解酶理想合成模式：延續(xù)合成型改進方法：提高mRNA穩(wěn)定性，降低培養(yǎng)基中阻遏物的濃度酶的發(fā)酵生產(chǎn)枯草芽孢桿菌：應(yīng)用最廣泛的產(chǎn)酶微生物之一，細(xì)胞成桿狀，G+大腸桿菌：細(xì)胞呈桿狀，G-黑曲霉：糖化酶，酸性蛋白酶，α-淀粉酶米曲霉：生產(chǎn)糖化酶和蛋白酶青霉：木霉：生產(chǎn)纖維素酶啤酒酵母發(fā)酵方式：固體發(fā)酵法（麩曲培養(yǎng)法）液體發(fā)酵法保藏：性能優(yōu)良的產(chǎn)酶細(xì)胞選育出來后，必須盡可能保持其生長和產(chǎn)酶特性不變異，不死亡，不被雜菌污染等。細(xì)胞活化：保藏細(xì)胞在使用前必須接種于新鮮的斜面培養(yǎng)基上，在一定的條件下進行培養(yǎng)，以恢復(fù)細(xì)胞的生命活動能力擴大培養(yǎng)：為了保證發(fā)酵時有足夠數(shù)量的優(yōu)質(zhì)細(xì)胞，活化了的細(xì)胞要經(jīng)過一級至數(shù)級的擴大培養(yǎng)。用于細(xì)胞擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基稱為種子培養(yǎng)基（氮源豐富，碳源相對少）。培養(yǎng)基配置：碳源氮源無機鹽：調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的PH值，氧化還原電位，滲透壓生長因子：氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素發(fā)酵條件及控制PH值：細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的最適pH值與生長最適pH值往往不同。產(chǎn)酶的最適pH值接近于該酶催化反應(yīng)的最適pH值。溫度控制：有些細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的最適溫度低于生長最適溫度?原因：低的溫度可以提高酶所對應(yīng)的mRNA的穩(wěn)定性，增加酶生物合成的延續(xù)時間，從而提高酶的產(chǎn)量。溶解氧的控制：調(diào)節(jié)通氣量；調(diào)節(jié)氧的分壓；調(diào)節(jié)氣液接觸時間；調(diào)節(jié)氣液接觸面積改變培養(yǎng)液的性質(zhì)提高酶產(chǎn)量的措施添加誘導(dǎo)物：誘導(dǎo)物分為，酶的作用底物；酶的催化反應(yīng)產(chǎn)物；作用底物的類似物控制阻遏物的濃度：（1）產(chǎn)物阻遏作用：由酶催化作用的產(chǎn)物或者代謝途徑的末端產(chǎn)物引起。（2）分解代謝物阻遏作用：由分解代謝物引起?？刂谱瓒粑锏臐舛仁墙獬瓒簟⑻岣呙府a(chǎn)量的有效措施。添加表面活性劑：增加細(xì)胞的透過性，利于胞外酶的分泌。添加產(chǎn)酶促進劑：可以促進產(chǎn)酶、但是作用機理未闡明的物質(zhì)。第六章酶的分離純化1.發(fā)酵液預(yù)處理發(fā)酵液相對純化發(fā)酵液固液分離2.細(xì)胞破碎細(xì)胞壁組成：細(xì)胞破碎：細(xì)胞破碎的確認(rèn)：直接測定破碎前后的細(xì)胞數(shù)；測定導(dǎo)電率；測定釋放的蛋白質(zhì)量或酶活力3.酶的提取4.酶的分離方法沉淀分離離心分離過濾與膜分離層析分離電泳分離紙電泳醋酸纖維素薄膜電泳瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳：1）化學(xué)催化系統(tǒng)：AP-TEMED催化劑：過硫酸銨（ammoniumpersulfate，AP）加速劑：TEMED（N，N，N’，N’-四甲基乙二胺）2）光催化系統(tǒng)：核黃素－光－（TEMED）催化劑:核黃素（維生素B2）引發(fā)劑:光TEMED的存在，可加速聚合。5.酶的濃縮蒸發(fā)濃縮超濾濃縮吸水劑：膠過濾濃縮聚乙二醇（PEG）濃縮反復(fù)凍融濃縮沉淀法酶的干燥酶的結(jié)晶常用方法：透析平衡結(jié)晶法酶活力測定？初速度的測定是關(guān)鍵，為什么？反應(yīng)速度只能在最初一段時間內(nèi)保持恒定，隨著時間的延長，反應(yīng)時間逐漸下降，原因有：底物濃度的降低、產(chǎn)物的增加造成的逆反應(yīng)的加快；產(chǎn)物的抑制作用；酶本身逐漸失活。測定常見方法：化學(xué)分析法（比色法）分光分度法量氣法滴定法（PH值測定法）終止反應(yīng)方法：改變反應(yīng)最適條件：加酸、堿、加熱加酶變性劑：5%三氯乙酸 比活力越大，表示酶越純第七講酶的修飾酶的化學(xué)修飾金屬離子置換修飾：把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的修飾方法一般是二價金屬離子步驟：酶的分離純化；除去原有的金屬離子；加入置換離子作用：闡明金屬離子對酶催化作用的影響；提高酶的催化效率；增強酶的穩(wěn)定性；改變酶的動力學(xué)特性大分子結(jié)合修飾：應(yīng)用最廣利用水溶性大分子與酶的側(cè)鏈基團結(jié)合，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的改變，從而改變酶的特性與功能的方