人腺癌細(xì)胞株A549中HIF-1α對(duì)生存素的影響,腫瘤學(xué)論文缺氧是實(shí)體瘤生長(zhǎng)微環(huán)境的顯著特征。腫瘤細(xì)胞在缺氧環(huán)境下發(fā)生一系列適應(yīng)性變化，而缺氧誘導(dǎo)因子是缺氧條件下哺乳動(dòng)物對(duì)缺氧反響的主要調(diào)節(jié)因子。Semenza等于1992年在缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞核抽提物中發(fā)現(xiàn)了氧敏亞基〔HIF-1〕和表核亞基〔HIF-1〕，華而不實(shí)HIF-1是主要的活性單位。缺氧時(shí)，HIF-1表示出增加并移入核內(nèi)與HIF-1結(jié)合，構(gòu)成有活性的異二聚體HIF-1，與靶基因的啟動(dòng)子或加強(qiáng)子內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)缺氧反響元件〔hypoxiaresponseelement，HRE〕結(jié)合，促進(jìn)腫瘤血管系生成和腫瘤細(xì)胞的增殖。生存素是當(dāng)前公認(rèn)的癌基因，文獻(xiàn)報(bào)道缺氧時(shí)HRE與生存素啟動(dòng)子結(jié)合，導(dǎo)致生存素的表示出增加。研究發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)的生存素表示出依靠和非依靠HIF-1途徑。本研究前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)，非小細(xì)胞肺癌〔NSCLC〕組織中生存素蛋白和HIF-1蛋白高表示出且兩者表示出呈正相關(guān)，靶向HIF-1的短發(fā)夾RNA〔shorthairpinRNA，shRNA〕可明顯下調(diào)生存素表示出。本研究通過(guò)凝膠電泳遷移率實(shí)驗(yàn)〔EMSA〕驗(yàn)證人腺癌細(xì)胞株A549中HIF-1能否與生存素啟動(dòng)子上潛在位點(diǎn)相結(jié)合，證實(shí)HIF-1結(jié)合位點(diǎn)的存在；miRNA干擾技術(shù)沉默HIF-1的表示出，進(jìn)一步論證其對(duì)生存素的影響及對(duì)A549細(xì)胞株生物學(xué)特性的影響，為肺癌的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)根據(jù)。材料與方式方法1.主要試劑與材料：A549細(xì)胞購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)；EMSA試劑盒〔美國(guó)Promega公司，批號(hào)：237021〕；放射性P標(biāo)記的ATP〔-32P[ATP]〕購(gòu)自北京市福瑞生物工程公司；G25葡聚糖凝膠購(gòu)自上海醫(yī)藥工業(yè)研究院；核蛋白提取試劑盒〔美國(guó)Thermo公司，批號(hào)：78833〕；鼠抗人生存素抗體〔美國(guó)SantaCruz公司，批號(hào)：SC374616〕，兔抗人HIF-1抗體〔北京博奧森生物公司，批號(hào)：bs-0737R〕，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG〔北京中杉金橋生物公司，批號(hào)：83228〕﹑兔抗鼠IgG〔美國(guó)SantaCruz公司，批號(hào)：sc66931〕；總RNA提取試劑盒〔德國(guó)Qiagen公司，批號(hào)：74104〕；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒〔美國(guó)Promega公司，批號(hào)：253082〕，PCR擴(kuò)增試劑盒〔加拿大MBIFermentas公司，批號(hào)：K1621〕；生存素探針、所有的引物由上海生工合成；F-12培養(yǎng)基和胎牛血清〔美國(guó)Hyclone公司，批號(hào)F03039〕；六水氯化鈷〔CoCl2，上海國(guó)藥公司〕；Transwell小室〔美國(guó)Corning公司〕；Annexin-VAPC和PI〔美國(guó)eBioscience公司〕；CCK-8〔細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒〕〔碧云天生物技術(shù)研究所〕；殺稻瘟菌素〔blasticidin〕，含有pcDNA6.2-GW/EmGFP針對(duì)HIF-1〔基因號(hào)NM001530〕的miRNA4組干擾質(zhì)粒及陰性對(duì)照組、含有內(nèi)參的miRNA質(zhì)粒，Lipofectamine〔脂質(zhì)體〕TM2000轉(zhuǎn)染試劑盒〔美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)11668-019〕。2.細(xì)胞培養(yǎng)及乏氧的處理：A549細(xì)胞以含10%胎牛血清的F-12培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。將化學(xué)缺氧劑CoCl2150mol/ml參加培養(yǎng)液中，模擬腫瘤內(nèi)部的缺氧微環(huán)境。3.EMSA檢測(cè)生存素核心啟動(dòng)子區(qū)上的HIF-1位點(diǎn)：根據(jù)核蛋白提取試劑盒講明書(shū)提取A549細(xì)胞中核蛋白并定量。用-32P標(biāo)記探針合成雙鏈后純化，EMSA電泳，室溫下顯影、定影。實(shí)驗(yàn)分組如下：陰性對(duì)照反響〔只要標(biāo)記好的探針〕、結(jié)合反響〔含有核蛋白和標(biāo)記好的探針〕、探針冷競(jìng)爭(zhēng)反響〔含有核蛋白、未標(biāo)記的探針和標(biāo)記好的探針〕、突變探針的冷競(jìng)爭(zhēng)反響〔含有核蛋白、未標(biāo)記的突變探針和標(biāo)記好的探針〕和超遷移〔Super-shift〕反響〔含有核蛋白、目的蛋白特異抗體和標(biāo)記好的探針〕。各探針如下：探針1：生存素啟動(dòng)子〔－26～－9bp〕上鏈序列5-GAGGGCGTGCGCTCCCGA-3，下鏈序列3-CTCCCGCACGCGAGGGCT-5，探針2：生存素啟動(dòng)子〔－144～－127bp〕上鏈序列5-GTCGCTGGGTGCACCGCG-3，下鏈序列3-CAGCGACCCACGTGGCGC-5，探針1突變的序列：上鏈序列5-GAGGGCAGCGCTCCCGA-3，下鏈序列3-CTCCCGTCGCGAGGGCT-5，探針2突變的序列：上鏈序列5-GTCGCTGGAGCACCGCG-3，下鏈序列3-CAGCGACCTCGTGGCGC-5，HIF-1通用雙鏈寡聚核苷酸序列〔EMSA試劑盒提供〕：上鏈序列5-TCTGTACGTGACCACACTCACCTC-3，下鏈序列3-AGACATGCACTGGTGTGAGTGGAG-5。4.HIF-1穩(wěn)定沉默A549細(xì)胞的建立：轉(zhuǎn)染前1d取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞接種于6孔板中，每孔參加2ml含2105個(gè)細(xì)胞但不含抗生素的培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞的融合度到達(dá)90%～95%。實(shí)驗(yàn)分組：未處理組、miRNA1～4轉(zhuǎn)染組及miRNA陰性、-肌動(dòng)蛋白miRNA對(duì)照組。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)步驟根據(jù)Lipofectinamine〔脂質(zhì)體〕TM2000講明書(shū)進(jìn)行，質(zhì)?！瞘〕∶脂質(zhì)體〔l〕＝1∶1，經(jīng)blasticidin10g/ml，3～4周挑選后挑出單克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)。5.RT-PCR檢測(cè)HIF-1、生存素的mRNA表示出：轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞根據(jù)德國(guó)Qiagen公司RNA提取試劑盒講明書(shū)提取總RNA，然后按RT-PCR試劑盒講明將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板進(jìn)行PCR。RT-PCR引物序列、擴(kuò)增長(zhǎng)度及反響條件分別如下：HIF-1上游引物：5-AGCCAGACGATCATGCAGCTACTA3，下游：5-TGTGGTAATCCACTTTCATCCATTG-3，產(chǎn)物長(zhǎng)度167bp。PCR三步反響：94℃、30s，59.2℃、30s，72℃、30s，35個(gè)循環(huán)；生存素上游引物5-AGGTCATCTCGGCTGTTCCTG-3，下游引物5-TCATCCTCACTGCGGCTGTC-3，產(chǎn)物長(zhǎng)度147bp；94℃、30s，63.9℃、30s，72℃、30s；30個(gè)循環(huán)，內(nèi)參GAPDH上游引物：5-GGGAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3，下游引物：5-AGCAGAGGGGGCAGAGATGAT-3，長(zhǎng)度375bp；95℃、30s，63℃、45s，72℃、60s，30個(gè)循環(huán)。美國(guó)伯樂(lè)Bio-Rad凝膠成像儀下觀察結(jié)果并拍照分析。6.Westernblot檢測(cè)HIF-1和生存素蛋白的表示出：提取各組細(xì)胞的核蛋白，二喹啉甲酸〔Bicinchoninincacid，BCA〕法測(cè)定蛋白濃度，每組樣本各取蛋白60g，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜上，經(jīng)5%脫脂奶粉封閉1h〔室溫〕后，分別參加一抗兔抗人HIF-1〔1∶300〕、鼠抗人生存素抗體〔1∶200〕，4℃過(guò)夜，參加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗〔1∶10000〕室溫孵育1h，化學(xué)發(fā)光法顯色，以-肌動(dòng)蛋白〔工作濃度1∶500〕為內(nèi)參照。用QuantityOne軟件分析條帶的吸光度。7.細(xì)胞增殖檢測(cè)：經(jīng)RT-PCR及Westernblot挑選出干擾效果最佳的HIF-1-miRNA細(xì)胞，將HIF-1miRNA、HIF-1陰性及未處理的A549各組細(xì)胞接種2103/孔于96孔板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，分別在5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)及參加CoCl2150mol/ml模擬缺氧培養(yǎng)24h、48h及72h，每孔參加10lCCK837℃孵育1h，在酶標(biāo)儀上450nm處測(cè)定各孔吸光度值。8.細(xì)胞凋亡檢測(cè)：各組細(xì)胞2105/ml接種于6孔板，在5%CO2培養(yǎng)箱中和參加CoCl2150mol/ml分別培養(yǎng)24h﹑48h及72h后收集細(xì)胞，1500r/min離心3min，離心半徑100mm，PBS洗滌2次，用1BindingBuffer〔結(jié)合緩沖液〕195l重懸細(xì)胞，參加Annexin-VAPC〔Ca2＋依靠性磷脂結(jié)合蛋白〕及碘化丙啶〔PI〕各5l，4℃避光室溫孵育15min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，CellQuest軟件分析。9.細(xì)胞的遷移力：取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的各組A549細(xì)胞消化、離心和計(jì)數(shù)，用無(wú)血清的F-12培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為5105/ml。在Transwell小室下層均參加500lF-12培養(yǎng)液〔含10%FBS〕，小室上層常氧組參加100l細(xì)胞懸液，缺氧組上層參加含CoCl2150mol/L的100l細(xì)胞懸液，每組細(xì)胞3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。放置在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后取出，用棉簽輕輕擦去膜上層的細(xì)胞，膜下層用甲醇固定30min，Giemsa〔吉姆薩〕染色10min，PBS沖洗2遍，倒置顯微鏡下選取10個(gè)視野〔400〕進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。10.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差〔xs〕表示，組間比擬采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)，兩兩比擬采用q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.EMSA驗(yàn)證HIF-1與生存素結(jié)合位點(diǎn)：生存素啟動(dòng)子序列－26～－9bp為探針與核蛋白作用，自顯影后出現(xiàn)DNA-核蛋白復(fù)合物滯后條帶，此條帶可被未標(biāo)記的探針競(jìng)爭(zhēng)消除；用含有HIF-1的通用辨別DNA片段為探針時(shí)，產(chǎn)生了與生存素啟動(dòng)子序列－26～－9bp為探針時(shí)相近的DNA-核蛋白復(fù)合物。表示清楚HIF-1與生存素啟動(dòng)子序列－26～－9bp結(jié)合，生存素啟動(dòng)子上－19～－16bp位點(diǎn)是HIF-1的結(jié)合位點(diǎn)〔圖1〕。2.穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的鑒定：A549細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染HIF-1miRNA1～4，miRNA-陰性、miRNA--肌動(dòng)蛋白對(duì)照質(zhì)粒，挑取細(xì)胞單克隆進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)后在熒光顯微鏡下可見(jiàn)綠色熒光〔GFP〕，表示清楚真核重組質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)成功。3.挑選HIF-1miRNA載體：轉(zhuǎn)染HIF-1miRNA3、4實(shí)驗(yàn)組〔0.3130.051，0.4150.051〕的A549細(xì)胞HIF-1mRNA的表示出低于未處理組〔1.0420.036〕和陰性對(duì)照組〔1.0300.004〕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔F＝436.433，P＜0.0.5〕，因而選擇轉(zhuǎn)染HIF-1miRNA-3的細(xì)胞株作為后續(xù)增殖、凋亡和遷移的實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)檢測(cè)干擾HIF-1后生存素mRNA的表示出，發(fā)現(xiàn)生存素mRNA也相應(yīng)降低，以miRNA3〔mRNA吸光度值為0.0600.008〕效果最佳，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔F＝0.002，P＜0.01〕〔圖2，3〕。用Westernblot法檢測(cè)A549細(xì)胞中的HIF-1和生存素蛋白水平變化，顯示HIF-1miRNA3組的HIF-1〔0.5590.051〕和生存素蛋白〔0.0510.003〕表示出明顯低于未處理組〔1.4520.146和0.1940.007〕和miRNA陰性組〔1.2490.012和0.1730.005〕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔F＝53.525，331.646，P＜0.05〕〔圖4〕。4.HIF-1miRNA在缺氧條件下的表示出：HIF-1沉默組HIF-1〔0.6040.040〕和生存素mRNA〔0.3940.018〕表示出明顯減低，各組和常氧條件下相比，HIF-1和生存素mRNA表示出明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔t值分別為7.809，－28.936，P＜0.01〕。QuantityOne定量分析HIF-1沉默組HIF-1和生存素蛋白表示出明顯低于常氧條件下，且各組的蛋白水平明顯高于常氧〔t值分別為13.523和－14.202〕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔P＜0.01〕〔圖5〕。5.HIF-1miRNA對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的影響：〔1〕常氧和缺氧條件下HIF-1miRNA對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響：HIF-1沉默組與未處理組、陰性對(duì)照組比擬，A549細(xì)胞生長(zhǎng)遭到抑制，但差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔F＝2.426，0.151，0.542，P＞0.05〕。缺氧24h后HIF-1沉默組與各組比擬，細(xì)胞生長(zhǎng)明顯遭到抑制，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔F＝8.048，5.699，34.087，P均＜0.05〕，而對(duì)照組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔表1，2〕?！?〕常氧和缺氧條件下HIF-1miRNA對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響：常氧條件下HIF-1沉默組平均凋亡率46.2%〔這是通過(guò)流式細(xì)胞儀軟件測(cè)每個(gè)門(mén)內(nèi)的比率，指的是細(xì)胞計(jì)數(shù)百分比〕與各對(duì)照組比擬〔未處理組44.6%，陰性組44.3%〕，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異〔F＝2.009，P＞0.05〕；模擬缺氧培養(yǎng)48h后實(shí)驗(yàn)組平均凋亡率為62.2%，與各對(duì)照組比擬凋亡明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔F＝26.359，P＜0.01〕，而未處理組平均凋亡率為51.4%，陰性組平均凋亡率為54.5%，兩兩比擬差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔t＝－0.077，P＞0.05〕?！?〕常氧和缺氧條件下HIF-1miRNA對(duì)A549細(xì)胞遷移力的變化：常氧和缺氧條件下干擾HIF-1后細(xì)胞遷移數(shù)明顯減少，分別為306〔F＝21.924，P＜0.05〕和754〔F＝170.827，P＜0.01〕，和對(duì)照組〔12117〕比擬差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且缺氧狀態(tài)下細(xì)胞的遷移數(shù)明顯多于常氧狀態(tài)下的細(xì)胞數(shù)〔t＝－2.988，P＜0.01〕。討論肺癌是當(dāng)今全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤，病死率居癌癥首位，70%～80%的肺癌患者確診時(shí)已屬于晚期，5年生存率僅有16%。因此說(shuō)明肺癌中高表示出且特異性強(qiáng)的異常基因的功能及相應(yīng)的調(diào)控機(jī)制，揭示肺癌發(fā)病機(jī)制，尋求新的治療措施成為腫瘤學(xué)家的共鳴。缺氧是實(shí)體瘤中普遍存在的現(xiàn)象，也是肺癌等實(shí)體瘤生長(zhǎng)微環(huán)境的顯著特征。在這種實(shí)體瘤適應(yīng)缺氧的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中，HIF-1起著重要作用，它通過(guò)調(diào)節(jié)一系列基因來(lái)維持氧和營(yíng)養(yǎng)的供應(yīng)，促進(jìn)腫瘤的生存和生長(zhǎng)。文獻(xiàn)報(bào)道，在乳腺癌和直腸癌細(xì)胞中HIF-1和生存素有很強(qiáng)的相關(guān)性，我們前期也證實(shí)在NSCLC中HIF-1對(duì)生存素表示出存在上調(diào)作用且具有腫瘤特異性。生存素是凋亡抑制蛋白〔inhibitorofapoptosisproteins〕家族的成員之一，除了抑制凋亡和保衛(wèi)細(xì)胞的存活外，亦介入血管構(gòu)成，甚至對(duì)腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和耐藥也有作用。很多癌癥患者體內(nèi)生存素水平升高決定了其對(duì)放化療反響的不敏感及預(yù)后不良，都與缺氧有關(guān)。缺氧下腫瘤特異性的生存素表示出增加，和生存素啟動(dòng)子的缺氧反響原件〔HREs〕結(jié)合導(dǎo)致生存素進(jìn)一步增加。Peng等報(bào)道乳腺癌中survivin通過(guò)HIF-1上調(diào)EGF處理的癌細(xì)胞而過(guò)表示出；轉(zhuǎn)染HIF-1小干擾RNA〔siRNA〕至直腸癌LS174T細(xì)胞后，抑制HIF-1后導(dǎo)致生存素的表示出下降，顯示HIF-1對(duì)生存素表示出可能有調(diào)節(jié)作用。本研究通過(guò)EMSA證實(shí)生存素啟動(dòng)子－19～－16bp區(qū)存在HIF-1結(jié)合位點(diǎn)，并證實(shí)HIF-1對(duì)生存素啟動(dòng)子具有正向調(diào)控作用。miRNA不僅具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增生、分化和活性的功能，還介入生命經(jīng)過(guò)中一系列重要進(jìn)程。相對(duì)于siRNA而言，miRNA在轉(zhuǎn)錄后沉默基因的表示出更強(qiáng)。為進(jìn)一步探明HIF-1對(duì)生存素的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，用miRNA抑制HIF-1的表示出，觀察對(duì)生存素轉(zhuǎn)錄和翻譯的影響。結(jié)果顯示，在常氧和缺氧條件下，生存素的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的表示出均明顯減低，進(jìn)一步證實(shí)HIF-1在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控生存素，生存素可能是HIF-1下游的靶基因。抑制HIF-1表示出，細(xì)胞在CoCl2〔氯化鈷〕模擬缺氧處理后，生長(zhǎng)遭到抑制，且出現(xiàn)凋亡；而在常氧下未出現(xiàn)這種現(xiàn)象。盡管在抑制HIF-1的乳腺癌細(xì)胞小鼠移植瘤模型中，移植瘤生長(zhǎng)明顯減慢；本研究結(jié)果顯示，僅在缺氧條件下沉默HIF-1才能抑制細(xì)胞增殖，促使細(xì)胞凋亡，可能是體外和體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境不同。在遷移實(shí)驗(yàn)中，用miRNA沉默HIF-1后，無(wú)論在常氧還是缺氧條件下，腫瘤細(xì)胞的遷移明顯遭到抑制，這與增殖和凋亡結(jié)果不同，且在缺氧狀態(tài)下遷移細(xì)胞數(shù)更多。在乳腺癌中上調(diào)HIF-1信號(hào)通路伴隨著微轉(zhuǎn)移灶的分子信號(hào)上調(diào)，Krishanlnachary等利用HIF-1特異的siRNA抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞相關(guān)基因表示出，降低由于缺氧和HIF-1過(guò)表示出導(dǎo)致的腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。近期報(bào)道HIF-1可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移，牡荊黃素〔一種HIF-1抑制劑〕能夠顯著抑制大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞的遷移。我們的結(jié)果與這些相關(guān)報(bào)道相吻合，表示清楚HIF-1在腫瘤細(xì)胞的遷移中起著核心作用，它過(guò)表示出促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，與其加強(qiáng)腫瘤細(xì)胞游走能力有關(guān)，但與缺氧關(guān)聯(lián)不大。揣測(cè)活化細(xì)胞遷移的相關(guān)基因是通過(guò)依靠HIF-1的機(jī)制。這一切能否與生存素關(guān)聯(lián)，并與肺癌易于早期出現(xiàn)局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，尚待進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)[1]SemenzaGL,WangGL.Anuclearfactorinducedbyhypoxiaviadenovoproteinsynthesisbindstothehumanerythropoietingeneenhanceratasi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