T/CSMAXXXX－2018三椏苦種子超低溫保存技術(shù)規(guī)程范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了三椏苦[Evodialepta]種子超低溫保存過程中的術(shù)語和定義、保存種子的選擇、種子前處理、種子保存量、種子冷凍方式、恢復(fù)培養(yǎng)等技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于三椏苦種子的超低溫長期貯藏。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T3543.6農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程水分測定GB/T3543.7農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程其他項目檢驗術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。三椏苦Evodialepta為蕓香科（Rutaceae）吳茱萸屬（EvodiaJ.R.etG.Forst.）喬木，其根、葉、果都可用作草藥。在我國及越南、老撾、柬埔寨等地均用作清熱解毒劑。XX“涼茶”制作中，多有此料，用其根、莖枝，作消暑清熱劑。收載于《XX省中藥材標(biāo)準(zhǔn)第一冊（2004）》、《XX自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)第一卷（2008）》和《XX省中藥材標(biāo)準(zhǔn)（2009）》。三椏苦果實Evodialeptafruits其分果瓣淡黃或茶褐色，散生肉眼可見的透明油點(diǎn)，每分果瓣有1顆種子。三椏苦種子Evodialeptaseeds三椏苦的播種材料為完整種子，貯藏特性判斷為頑拗性種子。種子藍(lán)黑色，長3~4mm，厚2~3mm，有XX。種子超低溫保存seedofcryopreservation指將經(jīng)過前處理的三椏苦種子置于液氮（-196℃）中保存。保存種子的選擇果實采收7月至10月，果皮呈紫黑色時，即可采收，去除種子果皮，取出種子。種子選擇挑選發(fā)育飽滿、均勻、健康的種子，置于10℃冰箱中保存?zhèn)溆茫ù娣艜r間不超過3個月）。種子前處理生活力檢測參照《植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)》中的溴麝香草酚藍(lán)（BTB）法測定三椏苦種子生活力。待測種子在30℃~35℃溫水中浸種2h，隨后取吸脹種子20粒，整齊地埋于備好的瓊脂凝膠中，注意要將含胚部分埋入凝膠中。將培養(yǎng)皿置于35℃溫箱中4h后觀察結(jié)果。生活力計算在光下用放大鏡對染色結(jié)果進(jìn)行觀察鑒定。凡種胚周圍出現(xiàn)黃色暈圈的種子為有活力的種子，否則為無活力的種子。計算：生活力=有活力的種子數(shù)/總的種子數(shù)×100%待保存的三椏苦種子生活力應(yīng)≥60%。含水量范圍用尼龍網(wǎng)袋包裹三椏苦種子，置于盛有變色硅膠的干燥器內(nèi)，硅膠與種子的體積比為38000:1，室溫條件下干燥處理0~1h，在干燥過程中定期測定種子含水量，將種子含水量由20%~25%降至16%~20%。參照GB/T3543.6中的高恒溫烘干法（130℃烘干1h）測定種子含水量（W0），W0=（鮮重-絕干重）/鮮重×100%。種子保存量三椏苦種子保存量不少于500粒，以便后期的活力檢測使用。種子冷凍方式三椏苦種子超低溫保存的冷凍方式為直接冷凍法，即將待保存的三椏苦種子放入2mL凍存管（每管50粒種子）中，迅速投入液氮中保存?；謴?fù)培養(yǎng)種子解凍處理液氮中至少凍存24h后，取出1個凍存管，立即放入40℃水浴中快速解凍2min。凍后種子生活力檢測取出25粒解凍后的種子，參照5.1~5.2生活力檢測方法，進(jìn)行超低溫保存后的初始生活力檢測。當(dāng)種子生活力≥50%時視為保存成功?；謴?fù)培養(yǎng)將25粒解凍后的三椏苦種子，播種到帶有無菌濾紙的發(fā)芽盒中，溫度25℃～30℃，濕度70%～85%條件下培養(yǎng)。三椏苦種子出芽周期大概10～40d。附錄BTB的配制和保存方法精密稱取BTB0.1g，溶解于煮沸過的100mL純水中，然后用濾紙去殘渣。濾液若呈黃色，可加數(shù)滴氫氧化鈉溶液，使之變?yōu)樗{(lán)色或藍(lán)綠色，此液長期貯存于棕色瓶中。1.5%BTB瓊脂凝膠：稱量0.1%BTB溶液40mL置于燒杯中，稱取0.5g瓊脂，將其剪碎后加入杯中，加熱并不斷攪拌使之完全溶解。待溶液稍稍冷卻即可趁熱倒入9cm培養(yǎng)皿中，使之成一均勻的薄層，完全冷卻后備用。參考文獻(xiàn)[1]中國植物志委員會.《中國植物志》第43（2）卷[M].科學(xué)出版社.2004（1997）：059[2]ZhangDianxiang.ThomasG.Hartley.DavidJ.Mabberley.Rutaceae[M]//FloraOfChinaBeijing:SciencePress/St.Louis:MissouriBotanicalGardenPress.2008.11:70-73.[3]XX省食品藥品監(jiān)督管理局.XX省中藥材標(biāo)準(zhǔn)[M].XX科學(xué)技術(shù)出版社，2009[4]傅家瑞，