SO2在衰老相關(guān)內(nèi)皮功能障礙中的作用,人體生理學(xué)論文摘要：目的討論二氧化硫(sulfurdioxide,SO2)對(duì)D-半乳糖(D-galactose,D-gal)誘導(dǎo)的衰老大鼠血管內(nèi)皮功能的影響及其機(jī)制。方式方法清潔級(jí)健康SD大鼠隨機(jī)分為D-半乳糖組,D-半乳糖+SO2組和對(duì)照組,連續(xù)3個(gè)月分別注射D-半乳糖、D-半乳糖和SO2供體、等量生理鹽水。然后檢測(cè)大鼠的收縮壓(systolicbloodpressure,SBP)、舒張壓(diastolicbloodpressure,DBP)和平均動(dòng)脈壓(meanarterialpressure,MAP)變化;檢測(cè)離體胸主動(dòng)脈環(huán)舒張功能變化;檢測(cè)血管組織中過(guò)氧化氫(hydrogenperoxide,H2O2)濃度、丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)的含量及活性。結(jié)果①連續(xù)注射3個(gè)月后,與對(duì)照組相比,D-半乳糖組大鼠的收縮壓、舒張壓及平均動(dòng)脈壓較高(P0.05);給予SO2處理的D-半乳糖+SO2組大鼠與D-半乳糖組相比,收縮壓、舒張壓和平均動(dòng)脈壓較低(P0.05);②與對(duì)照組相比,D-半乳糖組大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)乙酰膽堿(acetycholine,ACh)誘導(dǎo)的舒張反響受損,最大舒張率明顯降低(P0.05);給予SO2處理的D-半乳糖+SO2組大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)舒張功能與D-半乳糖組相比有了明顯改善,最大舒張率顯著升高(P0.05);③與對(duì)照組相比,D-半乳糖組大鼠胸主動(dòng)脈血管組織中H2O2與MDA的表示出均較高(P0.05),給予SO2處理后的D-半乳糖+SO2組大鼠胸主動(dòng)脈血管組織中H2O2,MDA的表示出與D-半乳糖組相比擬低(P0.05);④三組大鼠胸主動(dòng)脈血管組織中SOD含量無(wú)顯著性差異;與對(duì)照組相比,D-半乳糖組大鼠胸主動(dòng)脈血管組織中SOD活性明顯較低(P0.05),給予SO2處理后的D-半乳糖+SO2組大鼠胸主動(dòng)脈血管組織中SOD的活性與D-半乳糖組無(wú)顯著性差異。結(jié)論SO2能夠減輕衰老大鼠的血管內(nèi)皮功能障礙,其機(jī)制可能與減輕氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。本文關(guān)鍵詞語(yǔ)：衰老;二氧化硫;血管內(nèi)皮功能;氧化應(yīng)激損傷;Abstract：ObjectiveToinvestigatetheeffectofsulfurdioxide(SO2)onvascularendothelialfunctionofD-galactose(D-gal)inducedagingrats.MethodsSDratswererandomlydividedintoD-galgroup,D-gal+SO2groupandcontrolgroup,theninjectedwithD-gal,D-gal+SO2donor,equivalentsaline.Thesystolicbloodpressure(SBP),diastolicbloodpressure(DBP)andmeanarterialpressure(MAP)ofthesemiceweremeasured.Thediastolicfunctionofthoracicaortainducedbyacetycholine(ACh)weredetected.Theconcentrationofhydrogenperoxide(H2O2),malondialdehyde(MDA)andsuperoxidedismutase(SOD)invasculartissuesaswellastheactivityofSODweredetermined.Results①Comparedwiththecontrolgroup,SBP,DBPandMAPoftheD-galgroupwerehigher(P0.05).TheSBP,DBPandMAPoftheD-gal+SO2groupweresignificantlylowerthanthatoftheD-galgroup(P0.05).②Comparedwiththecontrolgroup,theACh-induceddiastolicresponseofthoracicaortainD-galgroupwasimpaired,withasignificantlyreducedinthemaximumdiastolicrate(P0.05).ThediastolicfunctionofthoracicaortiaintheD-gal+SO2groupwasimproved,withasignificantlyincreasedinthemaximumdiastolicrate(P0.05).③Comparedwiththecontrolgroup,theexpressionofH2O2andMDAinthethoracicaortictissueoftheD-galgroupwashigher(P0.05),H2O2andMDAexpressioninD-gal+SO2groupwaslowerthanthatintheD-galgroup(P0.05).④TherewasnosignificantdifferenceinSODcontentamongthethreegroups.Comparedwiththecontrolgroup,SODactivitywaslowerinthethoracicaortictissueofD-galgrouprats(P0.05),buttheadministrationofSO2failedtochangetheSODactivity.ConclusionSO2canalleviatevascularendothelialdysfunctioninagingrats,anditsmechanismmayberelatedtothereductionofoxidativestressinjury.Keyword：Aging;Sulfurdioxide;Vascularendothelialfunction;Oxidativestressinjury;衰老是由多種因素引起的復(fù)雜的、不可避免的生理經(jīng)過(guò)。衰老作為心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與高血壓、冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1,2]。隨著年齡的增長(zhǎng)，血管內(nèi)皮、血管壁及血管外膜發(fā)生構(gòu)造性和功能性的改變，主要表現(xiàn)為內(nèi)皮功能障礙、血管壁增厚和細(xì)胞外基質(zhì)重塑等，進(jìn)而導(dǎo)致血管硬化和血管張力增加[3,4]。華而不實(shí)，內(nèi)皮功能障礙被廣泛以為是導(dǎo)致血管老化的關(guān)鍵因素[5,6]。與衰老相關(guān)的內(nèi)皮功能障礙存在多種機(jī)制，包括一氧化氮〔NitricOxide,NO〕濃度的降低、活性氧〔Reactiveoxygenspecies,ROS〕的增加、促炎性細(xì)胞因子的刺激及內(nèi)皮細(xì)胞的衰老等[7,8]。固然血管老化的分子機(jī)制已經(jīng)得到了廣泛研究，但有效的治療方式方法仍然非常缺乏，當(dāng)前的干涉還是僅限于改善生活習(xí)慣，如在飲食上注意限制熱量的攝入及在生活中進(jìn)行適度的運(yùn)動(dòng)等。隨著我們國(guó)家人口老齡化的不斷加重，對(duì)血管老化干涉的研究具有特別重要的臨床意義。二氧化硫〔sulfurdioxide,SO2〕是一種無(wú)色且具有刺激性臭味的有毒氣體，一開(kāi)場(chǎng)人們對(duì)SO2的認(rèn)識(shí)只停留在其毒性層面，近年來(lái)越多越多的研究表示清楚，SO2不但能夠內(nèi)源性的由機(jī)體內(nèi)含硫氨基酸氧化產(chǎn)生〔如在心血管系統(tǒng)，半胱氨酸和同型半胱氨酸能夠被天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶AAT催化生成SO2〕，而且其在調(diào)節(jié)心率、維持血管舒張等經(jīng)過(guò)中發(fā)揮著重要的生理作用[9,10]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，SO2介入了很多與血管疾病相關(guān)的病理生理經(jīng)過(guò)，如能夠減輕自發(fā)性高血壓大鼠和缺氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠模型中的血壓增加及血管重建[11]；能夠下調(diào)TGF-/Smad信號(hào)通路并減輕血管鈣化[12]，能夠減弱AngⅡ誘導(dǎo)的高血壓小鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖等[13]。盡管已經(jīng)有大量文獻(xiàn)報(bào)道了SO2對(duì)心血管的各種保衛(wèi)作用，但其對(duì)血管衰老的作用，尤其是對(duì)衰老相關(guān)內(nèi)皮功能障礙的作用及其機(jī)制，當(dāng)前還沒(méi)有得到充分研究。本研究通過(guò)在D-半乳糖構(gòu)建的衰老動(dòng)物模型上對(duì)血壓的變化、血管環(huán)舒張功能變化、氧化應(yīng)激損傷的改善情況等方面綜合探究SO2在衰老相關(guān)內(nèi)皮功能障礙中的作用。1、材料與方式方法1.1、動(dòng)物模型的建立及分組8周大的健康雄性清潔級(jí)SD大鼠購(gòu)于維通利華，在恒定的環(huán)境條件下飼養(yǎng)〔12h光照/黑暗節(jié)律〕，環(huán)境溫度〔221〕℃，自由攝取食物和水。待大鼠適應(yīng)環(huán)境后將24只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組〔Control組〕、D-半乳糖組〔D-gal組〕、D-半乳糖+SO2組〔D-gal+SO2組〕，各8只。D-半乳糖、D-半乳糖+SO2組大鼠連續(xù)3個(gè)月皮下注射D-半乳糖〔150mg/kg〕，對(duì)照組大鼠給予等量生理鹽水。D-半乳糖+SO2組以亞硫酸鈉〔Na2SO3〕和亞硫酸氫鈉〔NaHSO3〕作為SO2供體〔調(diào)整Na2SO3和NaHSO3的摩爾比為3∶1,pH7.4〕，連續(xù)3個(gè)月腹腔注射85mg/kg劑量，對(duì)照組和D-半乳糖組大鼠在同一時(shí)間點(diǎn)腹腔注射等量生理鹽水。1.2、血壓的測(cè)量3個(gè)月后,靜止?fàn)顟B(tài)下,采用尾袖法用BP-100A全自動(dòng)無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量?jī)x(成都泰盟)測(cè)量大鼠的收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)和平均動(dòng)脈壓(MAP)。各血壓的取值方式方法為去除離群值和過(guò)量噪音或動(dòng)物活動(dòng)后的讀數(shù)之后至少3次測(cè)量值的平均值。1.3、大鼠主動(dòng)脈環(huán)的制備及等長(zhǎng)張力實(shí)驗(yàn)3個(gè)月后，CO2窒息法處死大鼠，解剖分離出胸主動(dòng)脈，去除結(jié)締組織后將主動(dòng)脈切成3mm的血管環(huán)。然后根據(jù)通用的方式方法在這些分離出的胸主動(dòng)脈環(huán)上評(píng)估血管舒張功能。即首先給予血管環(huán)一個(gè)2g前負(fù)荷的靜息張力，經(jīng)過(guò)60min平衡后，對(duì)動(dòng)脈環(huán)進(jìn)行苯腎上腺素〔1mol/L〕預(yù)處理，待到達(dá)穩(wěn)定收縮后，以累加的方式添加乙酰膽堿〔ACh,10-8～10-4mol/L〕，記錄內(nèi)皮依靠性舒張反響曲線。舒張反響結(jié)果以占苯腎上腺素收縮值的百分比表示〔%〕。1.4、活性氧及抗氧化酶活性的測(cè)定胸主動(dòng)脈組織在液氮中研磨后，在50mmol/L磷酸鉀緩沖液中均質(zhì)，然后10000g離心5min，根據(jù)試劑講明書(shū)，用相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒〔建成生物〕測(cè)定上清液中過(guò)氧化氫〔H2O2〕、丙二醛〔MDA〕濃度及超氧化物歧化酶〔SOD〕活性，均通過(guò)蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)化，使用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定。1.5、WesternBlot檢測(cè)將胸主動(dòng)脈蛋白抽提后用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，而后進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn)，上樣量為60g,10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1h。而后一抗4℃孵育過(guò)夜：SOD1(1∶1000,Abcam〕。洗膜液洗3次后，2抗室溫孵育1h，顯影，利用ImageJ軟件對(duì)條帶灰度進(jìn)行量化。1.6、統(tǒng)計(jì)學(xué)方式方法運(yùn)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。兩組間比擬采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，用表示，三組間比擬采用單因素方差分析，P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2、結(jié)果2.1、SO2對(duì)衰老大鼠血壓的影響連續(xù)注射3個(gè)月后，與對(duì)照組相比，D-半乳糖組大鼠的收縮壓、舒張壓和平均動(dòng)脈壓較高〔P0.05〕；給予SO2處理的D-半乳糖+SO2組衰老大鼠與D-半乳糖組大鼠相比，收縮壓、舒張壓和平均動(dòng)脈壓較低〔P0.05〕，見(jiàn)表1。表1三組大鼠血壓的比擬注:與對(duì)照組比擬,*P0.05;與D-半乳糖組比擬,△P0.052.2、SO2對(duì)衰老大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)舒張功能的影響血管環(huán)張力實(shí)驗(yàn)表示清楚，D-半乳糖組大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)ACh誘導(dǎo)的舒張功能與對(duì)照組相比明顯受損，最大舒張率顯著下降[〔65.908.90〕%與〔91.526.64〕%，P0.05]；給予SO2處理的D-半乳糖+SO2組大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)舒張功能與D-半乳糖組相比有了明顯改善，最大舒張率明顯升高[〔84.967.79〕%與〔65.908.90〕%，P0.05]，見(jiàn)圖1。圖1三組大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)的血管內(nèi)皮依靠性舒張功能變化注:與對(duì)照組比擬,*P0.05;與D-半乳糖組比擬,#P0.052.3、SO2拮抗D-半乳糖組衰老大鼠的氧化應(yīng)激損傷與對(duì)照組相比，D-半乳糖組衰老大鼠胸主動(dòng)脈血管組織中的H2O2水平明顯較高〔P0.05〕；給予SO2處理的D-半乳糖+SO2組與D-半乳糖組相比，衰老大鼠胸主動(dòng)脈血管組織中的H2O2水平較明顯降低〔P0.05〕，見(jiàn)表2。與對(duì)照組相比，D-半乳糖組衰老大鼠胸主動(dòng)脈血管組織中的MDA水平明顯較高〔P0.05〕；給予SO2處理能夠明顯降低D-半乳糖+SO2組衰老大鼠胸主動(dòng)脈血管組織中的MDA水平〔P0.05〕，見(jiàn)表2。表2三組大鼠離體胸主動(dòng)脈中H2O2及MDA含量比擬〔nmol/mg蛋白〕注:與對(duì)照組比擬,*P0.05;與D-半乳糖組比擬,#P0.052.4、SO2對(duì)衰老大鼠胸主動(dòng)脈血管組織中抗氧化酶SOD的含量及活性的影響D-半乳糖組大鼠胸主動(dòng)脈血管組織中抗氧化酶SOD1的含量與對(duì)照組相比沒(méi)有明顯變化，SO2注射也不能改變組織中SOD1的含量，見(jiàn)圖2。圖2三組大鼠離體胸主動(dòng)脈組織中SOD1蛋白表示出的比擬隨著H2O2和MDA水平的升高，D-半乳糖組大鼠主動(dòng)脈胸血管組織中抗氧化酶SOD的活性與對(duì)照組相比擬低[〔19.446.14)U/mg蛋白與〔29.645.30)U/mg蛋白，P0.05]，但與D-半乳糖組相比，SO2注射并不能提高D-半乳糖+SO2組大鼠胸主動(dòng)脈血管組織中抗氧化酶SOD的活性[〔23.694.89)U/mg蛋白與〔19.446.14)U/mg蛋白，P0.05]。3、討論衰老是一個(gè)復(fù)雜且不可逆的經(jīng)過(guò)，由衰老導(dǎo)致的血管構(gòu)造和功能性改變是心血管疾病的主要危險(xiǎn)因素。隨著人口老齡化的不斷加劇，研究對(duì)抗血管老化的干涉措施不僅能夠改善老年人的健康情況，而且能夠通過(guò)延緩心血管疾病的相關(guān)死亡而延長(zhǎng)老年人的壽命。D-半乳糖是人體內(nèi)正常存在的復(fù)原糖，可被半乳糖氧化酶氧化構(gòu)成H2O2，導(dǎo)致高水平的氧化應(yīng)激、炎癥和凋亡。D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老模型是當(dāng)前存在的多種衰老模型中最常見(jiàn)的，大量研究表示清楚D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老嚙齒動(dòng)物表現(xiàn)出的特征與自然衰老的嚙齒動(dòng)物非常類似[14]。因而，長(zhǎng)期注射D-半乳糖已被以為是研究衰老相關(guān)疾病〔尤其是血管老化〕機(jī)制的理想模型。在本實(shí)驗(yàn)中，連續(xù)3個(gè)月的D-半乳糖誘導(dǎo)使衰老大鼠產(chǎn)生血管內(nèi)皮依靠性的舒張損傷，伴隨著血壓升高，這與之前關(guān)于血管老化的研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果表示清楚SO2處理使得衰老大鼠的收縮壓、舒張壓和平均動(dòng)脈壓都有了明顯降低、胸主動(dòng)脈環(huán)最大舒張率也有了明顯提高，提示SO2能夠減輕D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老引起的血管內(nèi)皮功能障礙。氧源性自由基增加引起的氧化應(yīng)激被廣泛以為是與衰老相關(guān)的重要因素，過(guò)量的超氧化物能夠損害內(nèi)皮細(xì)胞功能并導(dǎo)致血管老化[15]。在這里我們研究了SO2在D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老大鼠模型中的抗氧化作用，結(jié)果表示清楚，D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老大鼠模型中脂質(zhì)氧化的兩種最終產(chǎn)物MDA和H2O2的水平均明顯增高，而SO2處理則能夠降低MDA和H2O2的水平，減輕D-半乳糖引起的氧化應(yīng)激損傷。線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及NADPH氧化酶系統(tǒng)是細(xì)胞呼吸、代謝和吞噬作用產(chǎn)生ROS的主要部位，NADPH氧化酶生成的O2-能夠經(jīng)SOD轉(zhuǎn)化為H2O2,H2O2再經(jīng)過(guò)過(guò)氧化氫酶轉(zhuǎn)化為H2O或在Fe2+存在的情況下轉(zhuǎn)化為羥基自由基[16]。除此之外，過(guò)氧化氫可以以被抗氧化劑如谷胱甘肽過(guò)氧化物酶降低。有報(bào)道，SO2預(yù)處理能夠增加心肌缺血再灌注損傷大鼠血漿SOD水平和心肌SOD1蛋白表示出[17]。在這里，我們也檢測(cè)了衰老大鼠胸主動(dòng)脈組織中SOD蛋白的活性及SOD1蛋白的表示出情況，試圖驗(yàn)證SO2能否是通過(guò)上調(diào)SOD1的表示出或增加其活性來(lái)增加了衰老大鼠主動(dòng)脈的抗氧化能力。本研究結(jié)果表示清楚，SO2處理不影響SOD1的蛋白表示出及其活性，這意味著SO2對(duì)活性氧的抑制可能是通過(guò)其他途徑進(jìn)行的，有待進(jìn)一步研究。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)SO2能夠減輕衰老大鼠的血管內(nèi)皮功能障礙，這可能與抑制氧化應(yīng)激、減輕氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。這些結(jié)果為SO2可能成為一種潛在的治療老年患者血管內(nèi)皮功能紊亂的藥物提供了實(shí)驗(yàn)根據(jù)，講明SO2具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。當(dāng)然，本實(shí)驗(yàn)也存在著一些局限性，如SO2抑制活性氧確實(shí)切機(jī)制還未找到，還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。除此之外，假如將SO2應(yīng)用于臨床，還要充分考慮其在超生理水平上的毒性作用。以下為參考文獻(xiàn)[1]NorthBJ,SinclairDA.Theintersectionbetweenagingandcardiovasculardisease[J].CircRes,2020,110(8):1097-1098[2]KoldasZL.Whatisagingandcardiovascularaging?[J].TurkKardiyolDernArs,2021,45(Suppl5):1-4[3]SunZ.Aging,arterialstiffness,andhypertension[J].Hypertension,2021,65(2):252-256[4]FacontiL,BrunoRM,GhiadoniL,etal.Ventricularandvascularstiffeninginagingandhypertension[J].CurrHypertensRev,2021,11(2):100-109[5]GhebreYT,YakubovE,WongWT,etal.VascularAging:ImplicationsforCardiovascularDiseaseandTherapy[J].TranslMed(Sunnyvale),2021,6(4):136[6]HarveyA,MontezanoAC,TouyzRM.VascularbiologyofageingImplicationsinhypertension[J].JMolCellCardiol,2021,83:112-121[7]SiragusaM,FlemingI.TheeNOSsignalosomeanditslinktoendothelialdysfunction[J].PflugersArch,2021,468(7):1125-1137[8]IsmaeelA,BrumbergRS,KirkJS,etal.OxidativeStressandArterialDysfunctioninPeripheralArteryDisease[J].Antioxidants(Basel),2021,7(10):145[9]WangW,WangB.SO2DonorsandProdrugs,andTheirPossibleApplications:AReview[J].FrontChem,2021,6:559[10]WangXB,DuJB,CuiH.Sulfurdioxide,adouble-facedmoleculeinmammals[J].LifeSci,2020,98(2):63-67[11]ZhaoX,JinHF,TangCS,etal.Ef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