臨床PCR技術(shù)臨床PCR技術(shù)KaryB.Mullis

USA,forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method1930年提出了兩種核酸DNA和RNA的概念1953年Watson和Crick提出了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)及其半保留復制模型。一、PCR概述KaryB.Mullis

USA,forhisin一、PCR概述（一）PCR概念PCR（polymerasechainreaction)是一種在體外通過重復DNA合成，以擴增特定核苷酸序列的方法。特點高靈敏度高特異性體外進行快捷一、PCR概述（一）PCR概念PCR的概念核心技術(shù)是從水棲高溫菌中分離到能耐高溫的Taq酶，使擴增反應不需要每一個循環(huán)加一次DNA聚合酶，從而實現(xiàn)了自動化。應用領(lǐng)域迅速擴大，PCR技術(shù)成為了分子生物學中的一項突破性技術(shù)。PCR的概念PCR概述——2000至2013年發(fā)表論文1280748篇PCR概述——2000至2013年發(fā)表論文1280748篇一、PCR概述（二）原理雙鏈DNA變性

退火鏈延伸

（膜板）

（雙鏈分成單鏈）

（膜板與引物雜交）

（DNA合成）不斷重復一、PCR概述（二）原理不斷重復二、實驗步驟（一）核酸提取1.DNA提取100ul濃縮液100ul血清吹打混勻12000g離心5min棄上清20ul提取液100℃煮10min模板二、實驗步驟（一）核酸提取100ul濃縮液100ul血清吹打二、實驗步驟2.RNA提取10ulA液200ulB液震蕩混勻8000g離心1min200ulDEPC乙醇65℃干燥10minRNA模板8000g離心1min逆轉(zhuǎn)錄為cDNA棄上清重復洗2次50ul血清二、實驗步驟2.RNA提取10ulA液200ulB液震蕩混勻3、細胞或組織劇烈震蕩400ul試劑1加入400ul試劑2震蕩混勻12000g離心5min完全棄上清加入試劑3模板加樣擴增雜交顯色3、細胞或組織劇烈震蕩400ul試劑1加入400ul試劑2震（二）擴增HBV引物(168bp)： 上游：5-GAAGTGTGACGTTGACATCC

下游：5-ACAGAGTACTTGCGCTCAGG擴增體系：（50μl體系）

10*Buffer---5μldNTP---1μlMgCl2---3μlPrimerF---2μlPrimerR---2μlDNA

---2μlTaq酶---1μlH2O---34μl（二）擴增HBV引物(168bp)：反應程序預變性94C3min循環(huán)延伸72C5min。注：每組實驗陰性對照用無菌生理鹽水代替模板58C45s72C45s94C45s30循環(huán)反應程序58C72C94C30循環(huán)（三）結(jié)果判讀（三）結(jié)果判讀（四）PCR的常見問題及處理措施常見問題污染：表現(xiàn)為陰性對照同樣出現(xiàn)目的條帶或陰性對照出現(xiàn)‘S’形曲線。污染的來源：來自其他測試樣品的DNA來自試驗材料如重組克隆的DNA外源DNA污染來自同一靶序列前一次PCR的擴增產(chǎn)物。

（四）PCR的常見問題及處理措施常見問題（三）PCR的常見問題及處理措施如何減少污染實驗室分區(qū)（三）PCR的常見問題及處理措施如何減少污染酶法控制尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG)短于100bp的PCR產(chǎn)物不能用UNG完全消除污染。紫外線表面照射消除試劑、加樣頭中的DNA污染。對短PCR產(chǎn)物效果不好以預防污染為主良好的實驗室操作酶法控制三、熒光定量PCR三、熒光定量PCR（一）熒光PCR定量的概念

以外參已知數(shù)量拷貝數(shù)的標準品為標準，通過擴增及對熒光值的監(jiān)測，對PCR起始模板量的定量。（一）熒光PCR定量的概念以外參已知數(shù)量拷貝數(shù)的標（二）熒光定量PCR原理染料染色SYBR?GreenI溴乙錠(EthidiumBromide)探針標記TaqManTM

分子信標(Molecularbeacons)（二）熒光定量PCR原理染料染色TaqMan探針reverseprimerRQforwardprimer3'3'5'5'3'5'5'1.PolymerisationprobeRQ3'3'5'5'3'5'5'2.StranddisplacementQ3'3'5'5'3'5'5'3.CleavageR3'5'5'3'5'5'4.PolymerisationcompletedQRR=ReporterQ=Quencher3'TaqMan探針reverseprimerRQforwar（三）定量PCR的數(shù)學原理PCR理論方程N=N0x(1+E)nN: 擴增數(shù)量N0: 起始模板數(shù)量E： 擴增效率n: 循環(huán)數(shù)

（三）定量PCR的數(shù)學原理PCR理論方程N=N指數(shù)期PCR定量方程才有效Log[DNA]循環(huán)數(shù)線性增長期Linear平臺期Plateauy=x(1+e)n指數(shù)增長期Geometric指數(shù)期PCR定量方程才有效Log[DNA]循環(huán)數(shù)線性增長期PCR曲線線性圖譜半對數(shù)圖譜PCR曲線線性圖譜半對數(shù)圖譜起點定量與終點定量起點定量終點定量“加進不同拷貝的膜板”半對數(shù)圖譜線性圖譜起點定量與終點定量起點定量終點定量“加進不同拷貝的膜板”半對同一個樣品重復96次起點定量的優(yōu)勢終點產(chǎn)物數(shù)量：誤差太大拐點產(chǎn)物數(shù)量：重現(xiàn)性好起始DNA量，更具意義重現(xiàn)性好，誤差小同一個樣品重復96次起點定量的優(yōu)勢終點產(chǎn)物數(shù)量：拐點產(chǎn)物數(shù)量起點定量的關(guān)鍵：CT值CT值：熒光信號有統(tǒng)計學意義顯著增長(穿過閾值線)時的循環(huán)次數(shù)CT值半對數(shù)圖譜CT值線性圖譜起點定量的關(guān)鍵：CT值CT值：熒光信號有統(tǒng)計學意義顯著增長(CT起始DNA濃度當循環(huán)次數(shù)n=CT值時：RT=RB+X0(1+E)CT

Rs

lg(RT-RB)=lgX0+CTlg(1+E)+lgRsCTlg(1+E)=-lgX0+lg(RT-RB)–lgRs即

CT=-klgX0+b（線性方程）Rn=RB+X0(1+E)nRsCT起始DNA濃度當循環(huán)次數(shù)n=CT值時：RT=RCT值-X0作圖CTX0CT=-klogX0+bCT值-X0作圖CTX0CT=-klogX0四、PCR檢測的臨床應用

（一）標本采集要求四、PCR檢測的臨床應用

（一）標本采集要求項目標本采集HBV無菌注射器抽取2毫升靜脈血或其它體液注入無菌試管或抗凝管。HCVEB1.鼻咽拭子或體液標本。2.也可取抗凝血標本,但一般不推薦。CMV1.尿液：中段晨尿20ml于加蓋試管。其他體液標本或咽拭子。也可取抗凝血標本,但一般不推薦。TB1.痰液：患者深部咳痰1～3ml于無菌加蓋試管。2.其他組織標本：留于無菌試管。。3.也可取抗凝血標本,但需分離單個核細胞檢測，陽性率才會高。（于發(fā)熱時抽?。㎝P

咽拭子項目標本采集HBV無菌注射器抽取2毫升靜脈血或其它體液注入無項目標本采集所需容器CT男性：尿道分泌物：細小棉拭子伸入尿道約2～4厘米，旋轉(zhuǎn)數(shù)圈取出分泌物（應略帶粘膜）。前列腺液、精液。女性：陰道分泌物：用無菌生理鹽水洗去宮頸外分泌物，再用無菌棉拭子插入宮頸內(nèi)，停5秒后旋動棉拭子采取分泌物。尿道分泌物：同上一次性無菌帶蓋的試管。NGUUTPHPVHSV項目標本采集所需容器CT男性：一次性無菌帶蓋的試管。NGUU（二）結(jié)果分析、報告及解釋1.定性PCR與定量PCR的比較2.定量PCR測定的臨床意義3.定性PCR測定的臨床意義4.定性和定量測定的結(jié)果報告及解釋（二）結(jié)果分析、報告及解釋1.定性PCR與定量PCR的比較1.定性PCR與定量PCR的比較瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳定量PCR擴增曲線圖定量PCR擴增曲線圖2.定量PCR的臨床意義對致病微生物核酸含量進行定量檢測彌補免疫檢測的缺陷縮短診斷的窗口期（如HBV,HIV）對治療過程進行藥物療效監(jiān)測用于基因表達方面的研究2.定量PCR的臨床意義對致病微生物核酸含量進行定量檢測某患者HBV-DNA的PCR結(jié)果動態(tài)圖日期HBV-DNA2004-6-39.3E+72004-12-72.0E+62005-4-191.8E+32005-7-250.0E+0某患者HBV-DNA的PCR結(jié)果動態(tài)圖日期HBV-DNA203、定性測定的臨床應用診斷用于篩檢耐藥突變檢測病毒基因型檢測GGAGGGAGAAAA3、定性測定的臨床應用GGAGGGAGAAA4.定性和定量測定的結(jié)果報告及解釋（1）定性陰性陽性（2）定量(以我科參考值為例)HBV-DNA<100IU/ml(不同項目數(shù)值不同)大于參考值，在檢測范圍之內(nèi)，是多少報多少。4.定性和定量測定的結(jié)果報告及解釋（1）定性大于107拷貝/ml，日常生活接觸強傳染性。小于105拷貝/ml，日常生活接觸傳染性較小但不管HBV-DNA的濃度為多少，哪怕是低于檢測下限，也均會引起輸血后的感染。（3）血漿HBV-DNA濃度與傳染性強弱的問題（3）血漿HBV-DNA濃度與傳染性強弱的問題

謝謝謝謝臨床PCR技術(shù)臨床PCR技術(shù)KaryB.Mullis

USA,forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method1930年提出了兩種核酸DNA和RNA的概念1953年Watson和Crick提出了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)及其半保留復制模型。一、PCR概述KaryB.Mullis

USA,forhisin一、PCR概述（一）PCR概念PCR（polymerasechainreaction)是一種在體外通過重復DNA合成，以擴增特定核苷酸序列的方法。特點高靈敏度高特異性體外進行快捷一、PCR概述（一）PCR概念PCR的概念核心技術(shù)是從水棲高溫菌中分離到能耐高溫的Taq酶，使擴增反應不需要每一個循環(huán)加一次DNA聚合酶，從而實現(xiàn)了自動化。應用領(lǐng)域迅速擴大，PCR技術(shù)成為了分子生物學中的一項突破性技術(shù)。PCR的概念PCR概述——2000至2013年發(fā)表論文1280748篇PCR概述——2000至2013年發(fā)表論文1280748篇一、PCR概述（二）原理雙鏈DNA變性

退火鏈延伸

（膜板）

（雙鏈分成單鏈）

（膜板與引物雜交）

（DNA合成）不斷重復一、PCR概述（二）原理不斷重復二、實驗步驟（一）核酸提取1.DNA提取100ul濃縮液100ul血清吹打混勻12000g離心5min棄上清20ul提取液100℃煮10min模板二、實驗步驟（一）核酸提取100ul濃縮液100ul血清吹打二、實驗步驟2.RNA提取10ulA液200ulB液震蕩混勻8000g離心1min200ulDEPC乙醇65℃干燥10minRNA模板8000g離心1min逆轉(zhuǎn)錄為cDNA棄上清重復洗2次50ul血清二、實驗步驟2.RNA提取10ulA液200ulB液震蕩混勻3、細胞或組織劇烈震蕩400ul試劑1加入400ul試劑2震蕩混勻12000g離心5min完全棄上清加入試劑3模板加樣擴增雜交顯色3、細胞或組織劇烈震蕩400ul試劑1加入400ul試劑2震（二）擴增HBV引物(168bp)： 上游：5-GAAGTGTGACGTTGACATCC

下游：5-ACAGAGTACTTGCGCTCAGG擴增體系：（50μl體系）

10*Buffer---5μldNTP---1μlMgCl2---3μlPrimerF---2μlPrimerR---2μlDNA

---2μlTaq酶---1μlH2O---34μl（二）擴增HBV引物(168bp)：反應程序預變性94C3min循環(huán)延伸72C5min。注：每組實驗陰性對照用無菌生理鹽水代替模板58C45s72C45s94C45s30循環(huán)反應程序58C72C94C30循環(huán)（三）結(jié)果判讀（三）結(jié)果判讀（四）PCR的常見問題及處理措施常見問題污染：表現(xiàn)為陰性對照同樣出現(xiàn)目的條帶或陰性對照出現(xiàn)‘S’形曲線。污染的來源：來自其他測試樣品的DNA來自試驗材料如重組克隆的DNA外源DNA污染來自同一靶序列前一次PCR的擴增產(chǎn)物。

（四）PCR的常見問題及處理措施常見問題（三）PCR的常見問題及處理措施如何減少污染實驗室分區(qū)（三）PCR的常見問題及處理措施如何減少污染酶法控制尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG)短于100bp的PCR產(chǎn)物不能用UNG完全消除污染。紫外線表面照射消除試劑、加樣頭中的DNA污染。對短PCR產(chǎn)物效果不好以預防污染為主良好的實驗室操作酶法控制三、熒光定量PCR三、熒光定量PCR（一）熒光PCR定量的概念

以外參已知數(shù)量拷貝數(shù)的標準品為標準，通過擴增及對熒光值的監(jiān)測，對PCR起始模板量的定量。（一）熒光PCR定量的概念以外參已知數(shù)量拷貝數(shù)的標（二）熒光定量PCR原理染料染色SYBR?GreenI溴乙錠(EthidiumBromide)探針標記TaqManTM

分子信標(Molecularbeacons)（二）熒光定量PCR原理染料染色TaqMan探針reverseprimerRQforwardprimer3'3'5'5'3'5'5'1.PolymerisationprobeRQ3'3'5'5'3'5'5'2.StranddisplacementQ3'3'5'5'3'5'5'3.CleavageR3'5'5'3'5'5'4.PolymerisationcompletedQRR=ReporterQ=Quencher3'TaqMan探針reverseprimerRQforwar（三）定量PCR的數(shù)學原理PCR理論方程N=N0x(1+E)nN: 擴增數(shù)量N0: 起始模板數(shù)量E： 擴增效率n: 循環(huán)數(shù)

（三）定量PCR的數(shù)學原理PCR理論方程N=N指數(shù)期PCR定量方程才有效Log[DNA]循環(huán)數(shù)線性增長期Linear平臺期Plateauy=x(1+e)n指數(shù)增長期Geometric指數(shù)期PCR定量方程才有效Log[DNA]循環(huán)數(shù)線性增長期PCR曲線線性圖譜半對數(shù)圖譜PCR曲線線性圖譜半對數(shù)圖譜起點定量與終點定量起點定量終點定量“加進不同拷貝的膜板”半對數(shù)圖譜線性圖譜起點定量與終點定量起點定量終點定量“加進不同拷貝的膜板”半對同一個樣品重復96次起點定量的優(yōu)勢終點產(chǎn)物數(shù)量：誤差太大拐點產(chǎn)物數(shù)量：重現(xiàn)性好起始DNA量，更具意義重現(xiàn)性好，誤差小同一個樣品重復96次起點定量的優(yōu)勢終點產(chǎn)物數(shù)量：拐點產(chǎn)物數(shù)量起點定量的關(guān)鍵：CT值CT值：熒光信號有統(tǒng)計學意義顯著增長(穿過閾值線)時的循環(huán)次數(shù)CT值半對數(shù)圖譜CT值線性圖譜起點定量的關(guān)鍵：CT值CT值：熒光信號有統(tǒng)計學意義顯著增長(CT起始DNA濃度當循環(huán)次數(shù)n=CT值時：RT=RB+X0(1+E)CT

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lg(RT-RB)=lgX0+CTlg(1+E)+lgRsCTlg(1+E)=-lgX0+lg(RT-RB)–lgRs即

CT=-klgX0+b（線性方程）Rn=RB+X0(1+E)nRsCT起始DNA濃度當循環(huán)次數(shù)n=CT值時：RT=RCT值-X0作圖CTX0CT=-klogX0+bCT值-X0作圖CTX0CT=-klogX0四、PCR檢測的臨床應用

（一）標本采集要求四、PCR檢測的臨床應用

（一）標本采集要求項目標本采集HBV無菌注射器抽取2毫升靜脈血或其它體液注入無菌試管或抗凝管。HCVEB1.鼻咽拭子或體液標本。2.也可取抗凝血標本,但一般不推薦。CMV1.尿液：中段晨尿20ml于加蓋試管。其他體液標本或咽拭子。也可取抗凝血標本,但一般不推薦。TB1.痰液：患者深部咳痰1～3ml于無菌加蓋試管。2.其他組織標本：留于無菌試管。。3.也可取抗凝血標本,但需分離單個核細胞檢測，陽性率才會高。（于發(fā)熱時抽?。㎝P

咽拭子項目標本采集HBV無菌注射器抽取2毫升靜脈血或其它體液注入無項目標本采集所需容器CT男性：尿道分泌物：細小棉拭子伸入尿道約2～4厘米，旋轉(zhuǎn)數(shù)圈取出分泌物（應略帶粘膜）。前列腺液、精液。女性：陰道分泌物：用無菌