...wd......wd......wd...腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)隨著干細(xì)胞生物學(xué)以及腫瘤學(xué)研究的不斷深入，腫瘤干細(xì)胞已成為當(dāng)前腫瘤研究的熱點(diǎn)。腫瘤干細(xì)胞的體外培養(yǎng)在腫瘤干細(xì)胞研究領(lǐng)域具有不可替代的重要地位，通過別離、純化及培養(yǎng)腫瘤干細(xì)胞可以對(duì)其生物學(xué)特性如異質(zhì)性、腫瘤的演化、轉(zhuǎn)移和抗藥性等進(jìn)展研究，為腫瘤的早期診斷與治療提供了新的思路和策略。腫瘤干細(xì)胞的體外培養(yǎng)多采用無血清培養(yǎng)基(serumfreemedium,SFM)，根據(jù)不同的細(xì)胞類型參加適當(dāng)?shù)募?xì)胞因子聯(lián)合培養(yǎng)以防止其分化。腫瘤細(xì)胞系或者是臨床腫瘤組織聯(lián)合采用機(jī)械和膠原酶消化腫瘤組織得到單細(xì)胞懸液，經(jīng)過流式細(xì)胞儀或者免疫磁珠分選的方法得到腫瘤干細(xì)胞使用無血清培養(yǎng)基在37℃，5％CO2無血清培養(yǎng)基有很多種，針對(duì)不同的細(xì)胞類型有專門的無血清營(yíng)養(yǎng)液出售。無血清培養(yǎng)基具有以下的優(yōu)點(diǎn)：各批產(chǎn)品之間成分相對(duì)明確、質(zhì)量相對(duì)一致；便于控制培養(yǎng)的生理環(huán)境；特殊細(xì)胞類型的優(yōu)化配方有利于提高細(xì)胞的穩(wěn)定性，使不同類型的細(xì)胞能在最有利于各自生長(zhǎng)的環(huán)境中持續(xù)傳代培養(yǎng)；依據(jù)不同類型的細(xì)胞、甚至不同的細(xì)胞系(株)都可能有各自的無血清培養(yǎng)基?？偟膩碚f可以分為根基營(yíng)養(yǎng)基及附加成分兩大局部[1]。根基培養(yǎng)基一般采用人工合成的培養(yǎng)基主要有DMEM、DMEM/F12、UltraCULTURETM、神經(jīng)干細(xì)胞專用無血清培養(yǎng)基、黑色素瘤專用培養(yǎng)基等其中以DMEM/F12(1:1，Invitrogen)最為常用。附加成分是指在根基培養(yǎng)基中參加各種不同細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)成分，包括①營(yíng)養(yǎng)因子：胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和亞硒酸鈉、牛血清白蛋白、B27、L－谷氨酰胺；②細(xì)胞因子：白血病抑制因子、表皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、血小板衍化生長(zhǎng)因子等。使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化傳代后不使用血清終止胰酶的作用，可使用0.1％－0.5%大豆胰酶抑制劑(soybeantrypsininhibitor)。一、腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)中幾種常見的細(xì)胞因子(一)白血病抑制因子LIF(leukemininhibitoryfactor,LIF)是白介素6(IL-6)細(xì)胞因子家族中的一員，是典型的多功能生長(zhǎng)因子，具有多種生物學(xué)功能：對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖與分化有著廣泛的作用，抑制分化促進(jìn)干細(xì)胞增殖。胚胎干細(xì)胞的體外培養(yǎng)需要添加LIF以抑制其分化，維持其多能性。LIF可抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FibroblastGrowthFactor,FGF)、β轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子(β-transformingGrowthFactor,TGFβ)和葉酸(RetinoicAcid,RA)誘導(dǎo)的細(xì)胞分化。(二)干細(xì)胞因子(stemcellfactor,SCF)又稱肥大細(xì)胞生長(zhǎng)因子(MGF)，Kit配體(KL)及Steel因子(SLF)，SCF可以誘導(dǎo)干和祖細(xì)胞增生。SCF主要由腦、肝臟、骨髓、胎盤等組織(尤其骨髓)中的基質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞產(chǎn)生。SCF是一種作用于最早期造血干祖細(xì)胞的造血細(xì)胞因子，在維持造血及肥大細(xì)胞存活、促進(jìn)造血細(xì)胞增殖和分化、調(diào)控各系造血細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育過程中起著重要作用。(三)表皮生長(zhǎng)因子(epidermalgrowthfactor,EGF)是含有53個(gè)氨基酸的多肽,早期研究中發(fā)現(xiàn)其有剌激表皮細(xì)胞生長(zhǎng)的作用,是表皮細(xì)胞培養(yǎng)的最常用的添加因子之一。EGF可顯著促使細(xì)胞分裂、增殖，在一定濃度范圍內(nèi)(5~20ng/ml),隨EGF濃度提高,效應(yīng)加強(qiáng)。(四)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)1975年Gospodarowicz及其同事從牛大腦和垂體中別離純化出一種分子量為16-18kD由146個(gè)氨基酸組成的陽(yáng)離子多肽，并將其命名為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。bFGF具有多種生物學(xué)功能，可以促進(jìn)和調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等多種起源于中胚層、神經(jīng)外胚層源性的許多種細(xì)胞的增殖和分化。二、腫瘤干細(xì)胞目前腫瘤干細(xì)胞已經(jīng)在多種腫瘤細(xì)胞系以及白血病、腦瘤、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、肝癌、肺癌等多種腫瘤組織中別離鑒定和培養(yǎng)。不同組織來源的腫瘤特性不同的，培養(yǎng)條件也不完全一樣，本章就已有報(bào)道的從不同腫瘤細(xì)胞系或者腫瘤組織別離的腫瘤干細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系加以闡述，在實(shí)際操作中讀者需要經(jīng)過摸索才能針對(duì)不同的腫瘤干細(xì)胞建設(shè)穩(wěn)定的體外培養(yǎng)條件。(一)白血病干細(xì)胞ALL急性淋巴細(xì)胞白血病干細(xì)胞(CD34+/CD10–/CD19–)采用懸浮培養(yǎng)體系培養(yǎng)[2]。ALL急性淋巴細(xì)胞白血病患者來源的骨髓用Ficoll別離得到單個(gè)核細(xì)胞(MNC)，使用IMDM(Gibco)添加50%FCS(Gibco)和10%DMSO二甲基亞砜(ManorParkPharmaceuticals)凍存液將別離得到的MNC在液氮中備用。培養(yǎng)時(shí)以5×105個(gè)/mL密度接種在IMDM無血清培養(yǎng)基中，添加了10μg/mL人胰島素，200μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白(Sigma-Aldrich)和2%HAS。使用時(shí)以下兩組生長(zhǎng)因子任選其一：①20ng/mL重組人Fms樣酪氨酸激酶3(rhFlt3)配體、20ng/mL重組人白介素3(rhIL-3)、20ng/mLrhIL-6、20ng/mLrhGM-CSF、20ng/mLrhG-CSF和50ng/mLSCF。②20ng/mLrhIL-3、10ng/mLrhIL-7和50ng/mLSCF(R&DSystems)。每周半量換液一次，培養(yǎng)6周后收集細(xì)胞用于細(xì)胞遺傳學(xué)和形態(tài)學(xué)分析。(二)乳腺癌干細(xì)胞乳腺癌干細(xì)胞培養(yǎng)多參考MaxWicha及其同事建設(shè)的人乳腺上皮干/祖細(xì)胞體外懸浮培養(yǎng)體系[3]，在無血清培養(yǎng)基中乳腺上皮干細(xì)胞呈懸浮非分化形式生長(zhǎng)，我們稱之為乳腺干細(xì)胞球。原代培養(yǎng)時(shí)在超低粘附板(Corning)以20000個(gè)/mL活性細(xì)胞傳代時(shí)以1000個(gè)/mL密度進(jìn)展培養(yǎng)。無血清培養(yǎng)基選擇無血清乳腺上皮生長(zhǎng)培養(yǎng)基MEGM(BioWhittaker)，添加了B27(Invitrogen)、20ng/mlEGF、20ng/mLbFGF(BDBiosciences)和4μg/mL肝磷脂(Sigma)，不添加牛垂體浸膏。乳腺干細(xì)胞球培養(yǎng)7－10天后用0.05%胰酶和0.53mMEDTA-4Na消化10分鐘(Invitrogen)，收集細(xì)胞到離心管中800rpm離心。離心后得到的細(xì)胞需通過40μm濾膜并且在顯微鏡下觀察是否為單個(gè)細(xì)胞。10000個(gè)單細(xì)胞懸液中兩個(gè)相連、三個(gè)相連、多個(gè)細(xì)胞相連的團(tuán)塊數(shù)量應(yīng)該在30到150之間，如果細(xì)胞團(tuán)大于>100外科手術(shù)得到乳腺癌實(shí)體瘤中乳腺癌干細(xì)胞(CD44+/CD24?/low)的培養(yǎng)需要在手術(shù)后30分鐘內(nèi)對(duì)乳腺癌標(biāo)本進(jìn)展處理，在膠原酶(Roche)和透明質(zhì)酸(Sigma)按1:1比例配成的消化液中37℃消化2小時(shí)后通過30μm濾膜后得到單細(xì)胞懸液。以1000個(gè)/mL無血清DMEM-F12(Cambrex),添加10ng/mLbFGF、20ng/mLEGF、5μg/mL胰島素和0.4%牛血清白蛋白(Sigma)。細(xì)胞在上述培養(yǎng)基中呈懸浮球狀細(xì)胞團(tuán)生長(zhǎng)，每隔3天使用胰酶－EDTA消化2分鐘后傳代[4]乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231中別離得到乳腺癌干細(xì)胞(CD24?/low/CD44+)，收集細(xì)胞500g離心5分鐘,使用Hanks’緩沖鹽溶液洗滌后以1000個(gè)/mL重懸于無酚磺酞的DMEM–F12(Cellgro)添加0.4%牛血清白蛋白BSA(Sigma)、5μg/mL牛胰島素(Sigma)、20ng/mLbFGF(Sigma)和10ng/mLEGF(Sigma)，每三天換液一次[5](三)腦膠質(zhì)瘤臨床獲得的腫瘤標(biāo)本使用lympholyte-M(Cedarlane)去除紅細(xì)胞，在充氧的人工腦脊液中使用胰酶消化成單細(xì)胞懸液，總的來說，每份腫瘤標(biāo)本大概可以獲得2－5×106個(gè)細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞使用TSM(tumorspheremedium)腫瘤細(xì)胞球培養(yǎng)基，添加20ng/ml重組人EGF(Sigma)、20ng/mlbFGF(Upstate)、10ng/mlLIF(Chemicon)、1×神經(jīng)元存活因子NSF(Clonetics)和60μg/mlN－乙酰半胱氨酸(Sigma),使用60-mm細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)展培養(yǎng)確保活細(xì)胞數(shù)量為3×106。原代培養(yǎng)三天后免疫磁珠分選得到CD133+腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，使用上述細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)[6]。也有學(xué)者從臨床腫瘤組織獲得的單個(gè)腫瘤細(xì)胞懸液在Neurobasal培養(yǎng)基(Invitrogen)，添加2mML-谷氨酰胺、N2(Invitrogen)、B27(Invitrogen)、20ng/mlhrEGF(Invitrogen)、20ng/mlhrbFGF(Invitrogen)和50mg/mlBSA。實(shí)驗(yàn)中使用的細(xì)胞應(yīng)該在4代之內(nèi)，分選得到的Nestin+/CD133+細(xì)胞即為腦腫瘤干細(xì)胞[7]大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞系C6采用SP分選的方法得到腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞[8],在100-mm培養(yǎng)盤中(Nunc)使用無血清的DMEM培養(yǎng)，添加了10μg/ml牛胰島素、100μg/ml人轉(zhuǎn)鐵蛋白、100μg/mlBSA、60ng/ml黃體激素、16μg/ml四甲烯二胺、40ng/ml亞硒酸鈉、63μg/mlN－乙酰半胱氨酸、5μM血小板凝集抑制劑forskolin、50units/ml青霉素、50μg/ml鏈霉素(GIBCO)、10ng/mlbFGF和10ng/mlPDGF。大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞系9L，無血清NSC增殖培養(yǎng)基采用DMEM/F12添加20ng/mlEGF(Peprotech)和bFGF(Peprotech)、50ng/ml肝磷脂、1×B27(Gibco)。每隔兩天換液一次。當(dāng)腫瘤細(xì)胞球到達(dá)100–200個(gè)時(shí)使用0.1%胰酶和1×EDTA(Gibco)37°C消化10分鐘。通過25μm細(xì)胞濾膜(BDBiosciences)以1000個(gè)/ml密度接種在添加促有絲分裂劑的NSC培養(yǎng)基中每隔兩天換液一次，18天后可以進(jìn)展細(xì)胞的傳代，培養(yǎng)的細(xì)胞球即為具有化療抵抗和侵襲能力的腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞[9]。(四)黑色素瘤原代培養(yǎng)轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞，外科手術(shù)獲得的腫瘤組織在1－2小時(shí)內(nèi)處理，沖洗腫瘤組織去除外表壞死組織后1mg/mLIV型膠原酶(Invitrogen)DMEM中4℃消化4－6小時(shí)，得到的單細(xì)胞懸液用HBSS洗滌后種在非粘附性的培養(yǎng)板中，使用以下兩種培養(yǎng)基①小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)–人胚胎干細(xì)胞(hESC)營(yíng)養(yǎng)液，并且添加4ng/mLbFGF。②使用黑色素瘤培養(yǎng)液建設(shè)黑色素瘤細(xì)胞系由以下成分組成MCDB153培養(yǎng)基(Sigma)、L15(Invitrogen)、2%FCS、5μg/mL胰島素(Sigma)、15μg/mL牛垂體浸膏(Cambrex)、1.68mmol/L氯化鈣和5ng/mLEGF(Sigma)。建設(shè)的WM115andWM239A黑色素瘤細(xì)胞系使用Mel2%培養(yǎng)液不加垂體浸膏和EGF。在hESC培養(yǎng)基采用有限稀釋的方法從原代培養(yǎng)的細(xì)胞中培養(yǎng)黑色素瘤細(xì)胞[10]，盡管單個(gè)細(xì)胞增殖能力有限，兩個(gè)單個(gè)原代培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)可以形成新的腫瘤細(xì)胞球，7－10天后以1000個(gè)/mL密度消化傳代。黑色素瘤干細(xì)胞外表標(biāo)記為CD20+別離自小鼠黑色素瘤細(xì)胞系B16F10中CD44+CD133+CD24+腫瘤干細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中添加20μg/LEGF、20μg/LbFGF和100U/ml青霉素G和100μg/ml鏈霉素[11]。(五)結(jié)腸癌干細(xì)胞臨床結(jié)腸癌標(biāo)本使用機(jī)械和酶消化得到單細(xì)胞懸液，流式或免疫磁珠分選的CD133+細(xì)胞被認(rèn)為是腫瘤干細(xì)胞并使用無血清營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)培養(yǎng)[12]，添加20ng/mlEGF和10ng/mlFGF-2。為了獲得原代培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞在酶消化后將細(xì)胞種到膠原包被的培養(yǎng)板種營(yíng)養(yǎng)液為添加了10%FCS的DMEM。(六)前列腺癌干細(xì)胞前列腺癌組織中別離腫瘤干細(xì)胞：人前列腺癌組織在征得病人的同意下從40個(gè)病人根治性前列腺切除術(shù)中獲得腫瘤標(biāo)本。前列腺癌通過組織學(xué)檢查而確認(rèn)，有些使用的標(biāo)本是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶。從腫瘤組織中別離得到的CD44/α2β1hi/CD133+(同時(shí)也是正常前列腺上皮細(xì)胞的標(biāo)志)細(xì)胞并且在四個(gè)標(biāo)本中進(jìn)展了長(zhǎng)期培養(yǎng)一個(gè)活組織檢查為良性腫瘤。完全角(質(zhì))化細(xì)胞生長(zhǎng)介質(zhì)培養(yǎng)基－角質(zhì)化細(xì)胞無血清培養(yǎng)基添加EGF和牛垂體浸膏(Invitrogen)，此外還添加了2ng/mLLIF(Sigma)、2ng/mLSCF(Sigma)和100ng/mL霍亂毒素(Sigma)[13]。(七)肺癌干細(xì)胞外科手術(shù)獲得肺癌腫瘤組織塊，沖洗去除外表血細(xì)胞后置于含有青霉素/鏈霉素和兩性霉素B的DMEM–F12中過夜以防止污染。20mg/mlII型膠原酶(Gibco-Invitrogen)37℃消化2小時(shí)。得到的細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中包括DMEM–F12(Gibco-Invitrogen)中添加50mg/ml胰島素,100mg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白,10mg/ml四甲烯二胺，0.03mM亞硒酸鈉，2mM黃體激素，0.6%葡萄糖，5mMHEPES,0.1%碳酸氫鈉，0.4%BSA，谷氨酰胺和抗生素，20mg/mlEGF和10mg/mlbFGF。用未經(jīng)過處理的細(xì)胞培養(yǎng)皿降低細(xì)胞的貼壁性來支持未分化的腫瘤細(xì)胞球的生長(zhǎng)[14]。營(yíng)養(yǎng)液每周換兩次直到形成懸浮細(xì)胞球(八)卵巢癌小鼠乳腺癌細(xì)胞系MOVCAR7和4306在含有4%FBS(MIS-free)DMEM并添加了L-谷氨酰胺，1%青霉素/鏈霉素，1%胰島素－轉(zhuǎn)鐵蛋白－硒ITS(GIBCO)37°C,5%CO2,在T175培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)[15]。臨床標(biāo)本去除紅細(xì)胞后，10%FBSRPMI，1%青霉素/鏈霉素和1%兩性霉素。(九)肝癌干細(xì)胞人肝癌細(xì)胞系HuH7細(xì)胞系中分選得到的SP細(xì)胞使用無血清培養(yǎng)基DMEM/Ham’sF-12(Invitrogen)中，作者[16]嘗試了添加干細(xì)胞因子SCF(Chemicon),血小板衍生的生長(zhǎng)因PDGF(PeproTech),堿性成纖維生長(zhǎng)因子bFGF(R&DSystems)和白血病抑制因子LIF(Chemicon)，最終確立了添加20ng/ml重組人LIF,可以有效的培養(yǎng)HuH7細(xì)胞系中的腫瘤干細(xì)胞。(十)鼻咽癌干細(xì)胞人鼻咽癌細(xì)胞系CNE-1、CNE－2等分選SP細(xì)胞即為鼻咽癌細(xì)胞干細(xì)胞，將分選后的細(xì)鼻咽癌干細(xì)胞ultraMEM培養(yǎng)基(cambrex)添加5％FBS，10ng/mlbFGF(sigma)和10ng/mlEGF(sigma)1mmol/LL－谷氨酰胺(sigma)50U/ml青霉素G和50μg/ml鏈霉素[17]。干細(xì)胞培養(yǎng)最初用飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)，其缺點(diǎn)為操作復(fù)雜，有多種穿插污染的不安全因素，目前較少采用。實(shí)際上飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)揮著關(guān)鍵作用的是飼養(yǎng)層細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，因此，使用無血清培養(yǎng)基中添加一定量的LIF、EGF、bFGF等細(xì)胞因子完全可以取代飼養(yǎng)層細(xì)胞,抑制干細(xì)胞分化并維持其增殖。但是，由于干細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中存在自發(fā)分化趨勢(shì)，通常認(rèn)為干細(xì)胞包括胚胎、骨髓血、臍帶血干細(xì)胞以及腫瘤干細(xì)胞只能做短期培養(yǎng)，從而限制了干細(xì)胞的擴(kuò)增和研究。AkioSoeda[18]等從臨床腦腫瘤組織中原代培養(yǎng)并建設(shè)了一個(gè)腦腫瘤干細(xì)胞系，腦腫瘤細(xì)胞在有血清培養(yǎng)基中貼壁單層培養(yǎng)后換無血清培養(yǎng)基仍可以形成新的細(xì)胞球并且移植到免疫缺陷鼠中有致瘤能力。重新形成的細(xì)胞球保持了干細(xì)胞特性，而且從中別離得到的單個(gè)腫瘤干細(xì)胞可以形成新的細(xì)胞球和腫瘤甚至可以在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)超過2年時(shí)間。這說明了腫瘤干細(xì)胞中有局部細(xì)胞在非貼壁或貼壁條件下傳代屢次后仍然保持了干細(xì)胞的特性。胰腺癌、食管癌、頭頸部皮膚癌中腫瘤干細(xì)胞也已經(jīng)別離和鑒定但是到目前為止還未見有體外培養(yǎng)的報(bào)道。因此，若何建設(shè)穩(wěn)定的干細(xì)胞的體外培養(yǎng)條件，防止腫瘤干細(xì)胞的分化仍然是一個(gè)急需解決的問題。(江蘇大學(xué)徐學(xué)靜，人民幣暉)參考文獻(xiàn)：[1]司徒鎮(zhèn)強(qiáng)，吳軍正主編。細(xì)胞培養(yǎng)。西安：世界圖書出版公司，2004.[2]CoxCV,EvelyRS,OakhillA,PamphilonDH,GouldenNJ,BlairA.Characterizationofacutelymphoblasticleukemiaprogenitorcells.Blood,2004,104(9):2919-2925.[3]DontuG,AbdallahWM,FoleyJM,JacksonKW,ClarkeMF,KawamuraMJ,WichaMS.Invitropropagationandtranscriptionalprofilingofhumanmammarystem/progenitorcells.GenesDev,2003,17(10):1253-1270.[4]PontiD,CostaA,ZaffaroniN,PratesiG,PetrangoliniG,CoradiniD,PilottiS,PierottiMA,DaidoneMG.IsolationandInvitroPropagationofTumorigenicBreastCancerCellswithStem/ProgenitorCellProperties.CancerRes,2005,65(13):5506-5511.[5]PhillipsTM,McBrideWH,PajonkF.TheResponseofCD24?/low/CD44+BreastCancer–InitiatingCellstoRadiation.JNatlCancerInst,2006,98(24):1777-1785.[6]SinghSK,ClarkeID,TerasakiM,BonnVE,HawkinsC,SquireJ,DirksPB.IdentificationofaCancerStemCellinHumanBrainTumors.CancerRes,2003,63(18):5821-5828.[7]SinghSK,HawkinsC,ClarkeID,SquireJA,BayaniJ,HideT,HenkelmanRM,CusimanoMD,DirksPB.Identificationofhumanbraintumourinitiatingcells.Nature,2004,432(7015):396-401.[8]KondoT,SetoguchiT,TagaT.Persistenceofasmallsubpopulationofcancerstem-likecellsintheC6gliomacellline.ProcNatlAcadSciUSA,2004,101(3):781-786.[9]GhodsAJ,IrvinD,LiuG,YuanX,AbdulkadirIR,TuniciP,KondaB,Wachsmann-HogiuS,BlackKL,YuJS.SpheresIsolatedfrom9LGliosarcomaRatCellLinePossessChemoresistantandAggressiveCancerStem-LikeCells.StemCells,2007,25(7):1645-1653.[10]FangD,NguyenTK,LeishearK,FinkoR,KulpAN,HotzS,VanBellePA,XuX,ElderDE,HerlynM.ATumorigenicSubpopulationwithStemCellPropertiesinMelanomas.CancerRes,2005,65(20):9328-9337.[11]DouJ,PanM,WenP,LiY,TangQ,ChuL,ZhaoF,JiangC,HuW,HuK,GuN.IsolationandIdentificationofCancerStem-LikeCellsfromMurineMelanomaCellLines.CellMolImmunol,2007,4(6):467-472.[12]Ricci-VitianiL,LombardiDG,PilozziE,BiffoniM,TodaroM,PeschleC,DeMariaR.Identificationandexpansionofhumancolon-cancer-initiatingcells.Nature,2007,445(7123):111-115.[13]CollinsAT,BerryPA,HydeC,StowerMJ,MaitlandNJ.ProspectiveIdentificationofTumorigenicProstateCancerStemCells.CancerRes,2005,65(23):10946-10951.[14]HYPERLINK":///sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Eramo%20A%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPan