降鈣素基因相關肽對MC3T3-E1成骨細胞氧化損傷的保護作用研究郭俊峰;張慧宇;張綱;安洋;楊陽;王飛;譚穎徽【摘要】目的探討降鈣素基因相關肽(CGRP)對MC3T3-E1成骨細胞氧化損傷的保護作用及其潛在機制.方法1)構建細胞氧化損傷模型，將實驗分為4組川2O2組使用含不同濃度(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5mol?L-1)H2O2的培養(yǎng)液CGRP+H2O2組使用含不同濃度(10-6、10-7、10-8、10-9、10-10mol-L-1)CGRP的培養(yǎng)液預處理后再加入含10-4mol?L-1H2O2的培養(yǎng)液,對照組為常規(guī)培養(yǎng)液，空白組不接種細胞.培養(yǎng)12、24、36、48h后,CCK-8法檢測細胞增殖活性，篩選最佳建模濃度和CGRP對成骨細胞氧化損傷的最佳保護濃度.2)采用含10-4mol?L-1H2O2(H2O2組)、10-8mol?L-1CGRP(CGRP組)的培養(yǎng)液和10-8mol?L-1CGRP+10-4mol?L-1H2O2培養(yǎng)液(CGRP+H2O2組)、常規(guī)培養(yǎng)液(對照組)培養(yǎng)成骨細胞，測定超氧化物歧化酶(SOD)的活性、活性氧(ROS)的含量以及炎癥因子腫瘤壞死因子(TNF)-a、白細胞介素(IL)-1B、IL-6的水平.結果1)在10-4mol-L-1H2O2時細胞增殖開始出現(xiàn)抑制(P<0.01),并呈濃度和時間依賴性;10-8mol-L-1CGRP預處理后細胞增殖活性最高，與只加入10-4mol-L-1H2O2有統(tǒng)計學差異(P<0.01).2)與H2O2組相比,CGRP+H2O2組SOD活性升高(P<0.01),TNF-a、IL-邛、IL-6水平降低(P<0.05),ROS含量降低(P<0.01).結論H2O2會對MC3T3-E1成骨細胞造成氧化損傷,CGRP對MC3T3-E1成骨細胞氧化損傷具有保護作用.％ObjectiveThisstudyaimedtoobservetheprotectiveeffectofcalcitoningene-relatedpeptide(CGRP),aswellasitspotentialmechanism,againstoxidativedamageinMC3T3-E1osteoblasts.Methods1)MC3T3-E1osteoblastsweretreatedwithdifferenthydrogenperoxide(H2O2)concentrations(10-1,10-2,10-3,10-4,and10-5mol?L-1)for12,24,36,and48htobuildanoxidativedamagemodel,todeterminecellproliferationactivityineachgroupbyusingCCK-8assay,andtodeterminetheoptimalmodelingconcentration.MC3T3-E1osteoblastswerepretreatedfor1hwithdifferentCGRPconcentrations(10-6,10-7,10-8,10-9,and10-10mol?L-1)followedbytreatmentwithH2O2(10-4mol-L-1).After12,24,36,and48h,theCGRPexpressionandactivityofosteoblastsweredetectedusingtheCCK-8methodtodeterminetheoptimalCGRPconcentrationthatprovidesthebestprotectiveeffectagainstoxidativedamage.2)Superoxidedismutase(SOD)activity,reactiveoxygenspecies(ROS)content,andthelevelsoftheinflammatorycytokinestumornecrosisfactor(TNF)-a,interleukin(IL)-邛，andIL-6ofthegroupstreatedwithCGRP,H2O2,CGRP+H2O2weredetermined.Results1)Comparedwiththecontrolgroup,treatmentwith10-4mol-L-1H2O2significantlystartedtoinhibitetheproliferationofosteoblasts(P<0.01)inadose-andtimedependentmanner.Comparedwith10-4mol-L-1H2O2group,pretreatmentwith10-8mol-L-1CGRPsignificantlyincreasedtheproliferationofosteoblasts(P<0.01).2)ComparedwithH2O2group,CGRP+H2O2groupsignificantlyincreasedtheSODactivity(P<0.01),ROScontentsignificantlydecreased(P<0.01),TNF-a,IL-邛,andIL-6secretionsignificantlydecreased(P<0.05).ConclusionH2O2cancauseoxidativedamagetoMC3T3-E1osteoblasts,whereasCGRPexertsprotectiveeffectagainstoxidativedamageinMC3T3-E1osteoblasts.【期刊名稱】《華西口腔醫(yī)學雜志》【年(卷)，期】2016(034)006【總頁數(shù)】5頁(P584-588)【關鍵詞】降鈣素基因相關肽;成骨細胞;氧化損傷;超氧化物歧化酶;活性氧【作者】郭俊峰;張慧宇漲綱;安洋;楊陽;王飛;譚穎徽【作者單位】第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院口腔頜面外科，重慶400037;第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院口腔頜面外科，重慶400037;第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院口腔頜面外科，重慶400037;第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院口腔頜面外科，重慶400037;第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院口腔頜面外科，重慶400037;第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院口腔頜面外科，重慶400037;第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院口腔頜面外科，重慶400037【正文語種】中文【中圖分類】R782.4頜面部的創(chuàng)傷和骨折在現(xiàn)代社會中很常見［1］。骨創(chuàng)傷愈合本身是一個受多種因子、信號、激素等精密調控的復雜的生理過程。其中，活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)的產(chǎn)生在骨折的發(fā)生及修復過程中起到重要的調節(jié)作用［2］。真核細胞在正常代謝中均能產(chǎn)生ROS［3］；但過剩的ROS所造成的氧化應激反而會導致許多疾病的發(fā)生。過氧化氫(H2O2)是主要的活性氧之一，能穿透生物膜導致細胞的膨脹破裂，損傷線粒體，造成細胞器和蛋白質的功能異常，從而對宿主細胞造成廣泛性的傷害。研究［4］表明，骨折發(fā)生時不僅會釋放大量的炎癥介質，同時組織內的ROS水平也會顯著增高；骨細胞在這樣的環(huán)境下功能會受到損傷，這也將嚴重影響骨的修復與愈合。研究［5］證實，神經(jīng)系統(tǒng)參與骨重塑。降鈣素基因相關肽(calcitoningene-relatedpeptide,CGRP）作為骨組織中分布最為廣泛的神經(jīng)肽，被認為是骨的天然活化劑，它的潛在治療作用越來越受到廣泛的關注。CGRP是由特定神經(jīng)元的可變剪接生成的37個氨基酸所組成的［6］，其受體屬于G蛋白偶聯(lián)家族成員。骨創(chuàng)傷后，在創(chuàng)傷周圍的末梢神經(jīng)會分泌大量CGRP顆粒，且與其他神經(jīng)肽類物質參與損傷修復和組織重建［7］。在體外實驗中，CGRP不僅能夠促進成骨細胞的增殖和分化，同時還能抑制破骨細胞的增殖；體內實驗中，CGRP能促進骨折或者其他外方的愈合。此外，CGRP還能抑制成骨細胞的凋亡［8］。通過這些結果，筆者推測CGRP對成骨細胞具有潛在的保護作用，那么在成骨細胞受到氧化損傷的過程中，CGRP是否還能夠對成骨細胞的生物學活性起到積極的作用呢？本實驗對此進行研究，觀察CGRP對H2O2刺激下MC3T3-E1成骨細胞增殖的影響，以及CGRP對MC3T3-E1成骨細胞氧化損傷的保護作用，旨在進一步了解骨創(chuàng)傷愈合機制以及CGRP在其中扮演的重要角色，以期為今后治療頜骨骨創(chuàng)傷提供新的思路和方向。1.1主要試劑MC3T3-E1成骨細胞（中國科學院細胞庫）；MEMa培養(yǎng)基、優(yōu)質胎牛血清、雙抗、胰蛋白酶（Gibco公司，美國），PBS緩沖液干粉（武漢博士德生物工程有限公司），30%過氧化氫（重慶川東化工集團有限公司）、CGRP（Sigma公司，美國）、CCK-8試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）、超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,SOD）、ROS測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）、小鼠腫瘤壞死因子（tumornecrosisfactor,TNF）-a、白細胞介素（interleukin,IL）-邛、IL-6定量分析酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）試劑盒（上海巧伊生物科技有限公司）。本實驗采用第3代MC3T3-E1成骨細胞。1.2構建細胞氧化損傷模型及CCK-8法檢測細胞增殖活性取生長狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的MC3T3-E1成骨細胞以5x103個?mL-1的密度接種于96孔板內，置于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細胞充分貼壁后隨機分組處理。實驗分為4組：對照組，H2O2組，CGRP+H2O2組，空白組。每組設3個平行孔。H2O2組：又分為5個小組，分別加入含不同濃度（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5mol?L-1）H2O2的培養(yǎng)液100pL;CGRP+H2O2組：又分為5個小組，分別使用含不同濃度（10-6、10-7、10-8、10-9、10-10mol?L-1）CGRP的培養(yǎng)液100pL預處理1h，再加入含10-4mol?L-1H2O2的培養(yǎng)液100pL;對照組：加入常規(guī)培養(yǎng)液100pL;空白組：用于調零，不接種細胞，僅加入常規(guī)培養(yǎng)液100pLoW96孔板置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12、24、36、48h后棄去上清液，每孔加入10pLCCK-8溶液和90pLPBS緩沖液，輕微振蕩混勻后繼續(xù)孵育1h，測定450nm波長下的吸光度值，重復實驗3次，篩選最佳建模濃度和CGRP對成骨細胞氧化損傷的最佳保護濃度。SOD活性測定將MC3T3-E1成骨細胞接種于6孔板中，細胞密度為每孔3x106個，置于37C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細胞充分貼壁。實驗分為4組，CGRP+H2O2組使用含10-8mol?L-1CGRP的培養(yǎng)液1mL預處理1h，然后再加入含10-4mol?L-1H2O2的培養(yǎng)液1mL;H2O2組中加入含10-4mol?L-1H2O2的培養(yǎng)液2mL;CGRP組中加入含10-8mol?L-1CGRP的培養(yǎng)液2mL；對照組中加入常規(guī)培養(yǎng)液2mL。培養(yǎng)48h后，收集細胞，按SOD測定試劑盒說明書進行操作，重復實驗3次。ELISA法檢測炎癥因子TNF-a、IL-邛、IL-6水平將MC3T3-E1成骨細胞接種于6孔板中，細胞密度為每孔3x106個，置于37C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細胞充分貼壁。實驗分為4組，CGRP+H2O2組使用含10-8mol?L-1CGRP的培養(yǎng)液1mL預處理1h，然后再加入含10-4mol?L-1H2O2的培養(yǎng)液1mL;H2O2組中加入含10-4mol?L-1H2O2的培養(yǎng)液2mL；CGRP組中加入含10-8mol?L-1CGRP的培養(yǎng)液2mL；對照組中加入常規(guī)培養(yǎng)液2mL。培養(yǎng)48h后，收集細胞培養(yǎng)液上清，按小鼠TNF-a、IL-1&、IL-6定量分析ELISA試劑盒說明書進行操作，重復實驗3次。1.5ROS含量的測定將MC3T3-E1成骨細胞接種于6孔板中，細胞密度為每孔3x106個，置于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細胞充分貼壁。實驗分為4組，CGRP+H2O2組使用含10-8mol?L-1CGRP的培養(yǎng)液1mL預處理1h，然后再加入含10-4mol?L-1H2O2的培養(yǎng)液1mL;H2O2組中加入含10-4mol?L-1H2O2的培養(yǎng)液2mL;CGRP組中加入含10-8mol?L-1CGRP的培養(yǎng)液2mL；對照組中加入常規(guī)培養(yǎng)液2mL。培養(yǎng)48h后，按ROS測定試劑盒說明書進行操作，重復實驗3次。1.6統(tǒng)計學分析采用SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進行t檢驗和單因素方差分析，檢驗水準為雙側a=0.05。2.1細胞增殖活性各組的細胞增殖活性見圖1、2。1）MC3T3-E1成骨細胞在不同濃度（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5mol?L-1）H2O2下培養(yǎng)12-48h,細胞增殖活性在10-4mol?L-1H2O2時開始出現(xiàn)抑制（P<0.01），并隨著濃度的增加和時間的后移，呈現(xiàn)濃度和時間依賴性（圖1）；2）MC3T3-E1成骨細胞在不同濃度（10-6、10-7、10-8、10-9、10-10mol?L-1）CGRP的培養(yǎng)液預處理后，10-8mol?L-1CGRP的培養(yǎng)液中細胞增殖活性最高，與只加入10-4mol?L-1H2O2的培養(yǎng)液有統(tǒng)計學差異（P<0.01）（圖2）,提示10-8mol?L-1CGRP具有明顯的抗氧化損傷的作用，對MC3T3-E1成骨細胞的氧化損傷具有一定的保護作用。2.2細胞SOD活性與對照組相比，CGRP組、CGRP+H2O2組SOD活性升高（P<0.05）,H2O2組SOD活性降低（P<0.05）。CGRP+H2O2組SOD活性高于H2O2組（P<0.01）（圖3）。提示：CGRP在一定程度上可以降低H2O2對MC3T3-E1成骨細胞SOD活性的抑制作用。TNF-a、IL-邛、IL-6的水平各組的TNF-a、IL-邛、IL-6水平見圖4。H2O2組TNF-a、IL-邛、IL-6水平高于對照組（P<0.01）；CGRP+H2O2組TNF-a、IL-邛、IL-6水平低于H2O2組（P<0.05）。提示：CGRP的抗炎效應在MC3T3-E1成骨細胞氧化損傷中發(fā)揮了一定的保護作用。ROS含量CGRP+H2O2組、H2O2組、CGRP組、對照組的ROS含量分別為22.2%、32.6%、3.5%、11.0%。H2O2組ROS含量高于對照組（P<0.01）,CGRP+H2O2組ROS含量低于H2O2組（P<0.01）。提示：CGRP具有抗氧化作用，其能抑制H2O2對MC3T3-E1成骨細胞造成的氧化損傷。骨的生理功能主要依賴骨重建的動態(tài)平衡。骨的生理活動取決于成骨細胞的骨形成和破骨細胞的骨吸收之間的平衡，任何影響或者破壞骨重建平衡的因素均會導致骨代謝性疾病。成骨細胞是骨重建的重要細胞，它的質量與數(shù)量將決定基質的分泌，影響破骨細胞的功能。氧化應激是由細胞內產(chǎn)生過量的ROS或者是機體的抗氧化防御機制受損所引起，現(xiàn)已證實氧化應激對骨代謝有重要的影響［9-11］。骨折的過程中伴隨著ROS的升高，直接會影響到骨修復。此外，H2O2會對MC3T3-E1成骨細胞造成氧化損傷，不僅體現(xiàn)在細胞會失去原有的形態(tài)，成骨細胞增殖也會受到明顯的抑制。CGRP作為重要的感覺神經(jīng)遞質，被證明在頜骨創(chuàng)傷修復、骨重建過程中發(fā)揮著重要作用［12］。本課題前期研究［5］證實，CGRP在下頜骨骨折愈合中的修復作用，有一部分是通過促進成骨細胞增殖來實現(xiàn)的。筆者推測，在頜骨損傷的修復機制中是否也存在一部分是依賴于CGRP抗氧化損傷的保護機制來實現(xiàn)的呢？本實驗結果表明，CGRP可以逆轉H2O2對MC3T3-E1成骨細胞增殖的抑制，并篩選了最優(yōu)勢濃度。此外，本研究結果還表明，CGRP能夠恢復H2O2對MC3T3-E1成骨細胞SOD活性的抑制。分析CGRP這種發(fā)揮抗氧化作用所涉及的機制，筆者認為，可能是因為CGRP增強了MC3T3-E1成骨細胞在H2O2下被抑制的SOD活性，SOD本身能夠清除MC3T3-E1成骨細胞因氧化損傷所產(chǎn)生的過量的超氧化物如ROS；ROS量的減少又可以改善MC3T3-E1成骨細胞的細胞活性，從而促進骨折的愈合。近來，也有研究報道CGRP還具有抗炎的潛能。CGRP能夠抑制在內毒素刺激下炎癥因子如TNF-a、IL-邛、IL-6等的釋放，通過減少炎癥反應，抑制成骨細胞凋亡和破骨細胞活化從而促進骨折愈合［8,13］,這些結果也是CGRP積極參與骨修復的有力證據(jù)。在H2O2作用下，成骨細胞產(chǎn)生的ROS增多，ROS通過刺激破骨細胞釋放TNF-a等炎癥因子間接影響到成骨細胞的活性與增殖，進而影響骨折的愈合。不論如何，CGRP可以減輕H2O2對MC3T3-E1成骨細胞SOD的負性影響，改善MC3T3-E1成骨細胞的增殖活性，能對氧化損傷下的MC3T3-E1成骨細胞產(chǎn)生保護作用，這一點是比較明確的。相關的研究還在繼續(xù)，我們在下一步的實驗中將會進一步揭示這種保護作用所涉及的信號分子及機制，以期為CGRP促進頜面部骨創(chuàng)傷的愈合提供新的靶點和依據(jù)。Supportedby:TheNationalNaturalScienceFoundationofChina(81371110).Correspondence:TanYinghui,E-mail:.劉家武，俞輝明,邱長樂，等.顱頜面骨折及伴發(fā)傷同期手術的臨床研究[J].華西口腔醫(yī)學雜志，2014,32(1):51-53.LiuJW,YuHM,QiuCL,etal.Clinicalresearchonthesimultaneoussurgicaltreatmentofcraniomaxillofacialfracturecombinedwithotherinjuries[J].WestChinJStomatol,2014,32(1):51-53.YamamotoN,FukudaK,MatsushitaT,etal.Cyclictensilestretchstimulatesthereleaseofreactiveoxygenspeciesfromosteoblast-likecells[J].CalcifTissueInt,2005,76(6):433438.YangYH,LiB,ZhengXF,etal.Oxidativedamagetoosteoblastscanbealleviatedbyearlyautophagythroughtheendoplasmicreticulumstresspathway—implicationsforthetreatmentofosteoporosis[J].FreeRadicBiolMed,2014,77:10-20.SmietanaMJ,ArrudaEM,FaulknerJA,etal.ReactiveoxygenspeciesonbonemineraldensityandmechanicsinCu,Znsuperoxidedismutase(Sod1)knockoutmice[J].BiochemBiophysResCommun,2010,403(1):149-153.TianG,ZhangG,TanYH.Calcitoningene-relatedpeptidestimulatesBMP-2expressionandthedifferentiationofhumanosteoblast-likecellsinvitro[J].ActaPharmacolSin,2013,34(11):1467-1474.LiangW,ZhuoX,Tang乙etal.Calcitoningene-relatedpeptidestimulatesproliferationandosteogenicdifferentiationofosteoporoticrat-derivedbonemesenchymalstemcells[J].MolCellBiochem,2015,402(1/2):101-110.WuM,Zhao乙HanY.ThechangesofProteomeinMG-63cellsafterinducedbycalcitoningene-relatedpeptide[J].BiochemBiophysResCommun,2014,453(3):648-652.Mrak