標(biāo)記免疫技術(shù)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系臨床微生物學(xué)及免疫學(xué)教研室二OO四年三月標(biāo)記免疫技術(shù)=抗原抗體反應(yīng)示蹤物標(biāo)記靈敏性特異性標(biāo)記免疫技術(shù)的主要特點(diǎn)：高特異性、高靈敏性免疫技術(shù)+標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記免疫技術(shù)免疫測(cè)定技術(shù)免疫組化技術(shù)示蹤物及標(biāo)記技術(shù)放射免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)化學(xué)發(fā)光技術(shù)金免疫技術(shù)???第八章放射免疫技術(shù)

類型：放射免疫分析（radioimmunoassay,RIA）免疫放射分析（immunoradiometricassay,IRMA）

廣義放射免疫技術(shù)還包括放射受體分析（使用受體測(cè)量抗原）和放射配體結(jié)合分析（使用配體研究受體）。特點(diǎn):靈敏度高(10-9-10-15g/L)、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等標(biāo)記物:常用的核素有兩大類γ射線：131I、125I、57Cr和60Coβ射線：14C、3H和32P。使用最廣泛的是：125I①性質(zhì)活潑、易制備標(biāo)記物②對(duì)被標(biāo)記物的免疫活性影響?、蹨y(cè)量方法簡(jiǎn)便、已推廣④半衰期較長(zhǎng)、核素豐度高標(biāo)記方法125I的標(biāo)記原理：取代分子中酪氨酸或酪胺殘基及組胺殘基上的氫原子方法：直接標(biāo)記法

氯胺T法和乳過氧化物酶法間接標(biāo)記法

聯(lián)接標(biāo)記法適用分子原理特點(diǎn)缺點(diǎn)直接標(biāo)記肽類、蛋白質(zhì)、酶存在酪氨酸、組胺殘基等基團(tuán)操作簡(jiǎn)便、易標(biāo)記、比放射性高不適于活性功能區(qū)的殘基標(biāo)記間接標(biāo)記甾類化合物、核苷酸等小分子化合物不存在酪氨酸、組胺殘基等基團(tuán),需添加可避免氧化／還原劑對(duì)被標(biāo)記物活性的損傷等添加基團(tuán)可能影響被標(biāo)記物活性標(biāo)記物純化

對(duì)游離的125I等試劑與標(biāo)記物進(jìn)行分離方法：分子篩凝膠過濾；離子交換層析；聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）；高效液相色譜（HPLC）標(biāo)記物鑒定放射化學(xué)純度

單位標(biāo)記物中結(jié)合在被標(biāo)記物上的放射性占總放射性的百分率。一般要求大于95％。免疫活性

標(biāo)記過程中，被標(biāo)記物活性損傷程度。B/T％>80％，B/T％↑抗原損傷↓。比放射性

單位化學(xué)量標(biāo)記物中所含的放射性強(qiáng)度.常用Ci/g、mCi/mg、Ci/mmol等單位表示。比放射性↑方法更靈敏；過高輻射自損傷大，對(duì)標(biāo)記物免疫活性影響大，儲(chǔ)存穩(wěn)定性差?？寡彖b定多克隆抗體的抗血清是放射免疫分析的主要試劑之一，其質(zhì)量直接影響方法的特異性和靈敏度。親合力選用親和常數(shù)K值大(109~1012L//mol)抗血清特異性其程度可直接影響結(jié)果的準(zhǔn)確性

滴度最大稀釋度。在本技術(shù)方法中是指結(jié)合50％標(biāo)記抗原時(shí)的抗血清的稀釋度。放射免疫疫分析（RIA））基本原理理采用定量量的標(biāo)記記抗原（（Ag＋）和非標(biāo)標(biāo)記抗原原（Ag）競(jìng)爭(zhēng)爭(zhēng)性結(jié)合合有限量量特異性性抗體（（Ab））的反應(yīng)應(yīng)。以未結(jié)合合的Ag*為F，Ag*Ab復(fù)合物物為B，，則B/F與Ag的量量變存在在著函數(shù)數(shù)關(guān)系。。B/F60(％)50403020

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0.81.62.43.24.04.85.6Ag(ng/ml)測(cè)定方法法與步驟驟1.抗原原抗體反反應(yīng)：平平衡法或或非平衡衡法2.分離離結(jié)合與與游離標(biāo)標(biāo)記物沉淀劑沉沉淀復(fù)合合物，離離心分離離。如第第二抗體體沉淀法法、聚乙乙二醇沉沉淀法或或活性炭炭吸附法法等。要要求：分分離徹底底，迅速速；分離離試劑和和過程不不影響反反應(yīng)平衡衡；操作作簡(jiǎn)便，，重復(fù)性性好且經(jīng)經(jīng)濟(jì)。3.放射射性測(cè)定定及數(shù)據(jù)據(jù)處理晶體閃爍爍計(jì)數(shù)儀儀(γ射線)或或液體閃閃爍計(jì)數(shù)數(shù)儀(β射線)繪制標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)曲線，，計(jì)算待待檢抗原原濃度。。免疫放射射分析（（IRMA）基本原理理單位點(diǎn)IRMA：利用用過量標(biāo)標(biāo)記抗體體與待測(cè)測(cè)抗原進(jìn)進(jìn)行反應(yīng)應(yīng)，形成成抗原抗抗體復(fù)合合物，反反應(yīng)平衡衡后，用用固相抗抗原結(jié)合合反應(yīng)液液中剩余余的未結(jié)結(jié)合標(biāo)記記抗體并并將其分分離，測(cè)測(cè)定上清清液的放放射量。。雙位點(diǎn)IRMA先用固相相抗體與與抗原反反應(yīng)結(jié)合合,然后后再用過過量的標(biāo)標(biāo)記抗體體與已結(jié)結(jié)合于固固相抗原原的另一一抗原決決定簇結(jié)結(jié)合,形形成固相相抗體-抗原-標(biāo)記抗抗體復(fù)合合物,洗洗棄反應(yīng)應(yīng)液中剩剩余的標(biāo)標(biāo)記抗體體,測(cè)定定固相上上的放射射性。IRMA與與RIA的的異異同同點(diǎn)點(diǎn)標(biāo)記記物物在RIA中中核核素素標(biāo)標(biāo)記記抗抗原原，，抗抗原原有有不不同同種種類類，，根根據(jù)據(jù)其其化化學(xué)學(xué)結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)，，標(biāo)標(biāo)記記時(shí)時(shí)需需用用不不同同的的核核素素和和不不同同的的方方法法。。在在IRMA中中核核素素標(biāo)標(biāo)記記抗抗體體。?？箍贵w體為為蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)，，有有利利于于碘碘化化標(biāo)標(biāo)記記，，不不同同抗抗體體標(biāo)標(biāo)記記方方法法基基本本相相同同。。標(biāo)標(biāo)記記抗抗體體的的比比活活度度高高，，提提高高了了分分析析的的靈靈敏敏度度。。反應(yīng)應(yīng)速速率率反應(yīng)應(yīng)速速度度與與反反應(yīng)應(yīng)物物的的濃濃度度呈呈正正比比，，在在IRMA中中標(biāo)標(biāo)記記抗抗體體是是過過量量的的，，而而且且不不存存在在競(jìng)競(jìng)爭(zhēng)爭(zhēng)性性結(jié)結(jié)合合復(fù)復(fù)雜雜的的反反應(yīng)應(yīng)，，所所以以反反應(yīng)應(yīng)速速度度較較RIA快快。。在在RIA中中抗抗體體量量是是微微量量的的，，所所以以一一定定要要用用高高親親和和力力的的多多克克隆隆抗抗體體，，而而在在IRMA中中應(yīng)應(yīng)用用親親和和力力較較低低的的單單克克隆隆體體也也能能得得到到滿滿意意的的結(jié)結(jié)果果。。反應(yīng)應(yīng)原原理理RIA為為競(jìng)競(jìng)爭(zhēng)爭(zhēng)抑抑制制，，測(cè)測(cè)得得放放射射性性的的量量與與受受檢檢抗抗原原呈呈反反比比。。IRMA為為非非競(jìng)競(jìng)爭(zhēng)爭(zhēng)結(jié)結(jié)合合，，劑劑量量反反應(yīng)應(yīng)曲曲線線為為正正相相關(guān)關(guān)的的直直線線關(guān)關(guān)系系。。特異異性性在雙雙位位點(diǎn)點(diǎn)IRMA中中，，一一般般均均應(yīng)應(yīng)用用針針對(duì)對(duì)不不同同位位點(diǎn)點(diǎn)的的單單克克隆隆抗抗體體，，其其交交叉叉反反應(yīng)應(yīng)率率低低于于應(yīng)應(yīng)用用多多克克隆隆抗抗體體的的RIA。。檢測(cè)測(cè)范范圍圍通常常RIA的的工工作作范范圍圍為為2-3個(gè)個(gè)數(shù)數(shù)量量級(jí)級(jí)，，而而RIMA可可達(dá)達(dá)3個(gè)個(gè)數(shù)數(shù)量量級(jí)級(jí)以以上上。。分析析誤誤差差RIA中中加加入入的的抗抗體體和和標(biāo)標(biāo)記記抗抗原原都都是是定定量量的的，，加加樣樣誤誤差差可可嚴(yán)嚴(yán)重重影影響響測(cè)測(cè)定定結(jié)結(jié)果果。。IRMA中中標(biāo)標(biāo)記記和和固固相相抗抗體體在在反反應(yīng)應(yīng)中中都都是是過過量量的的，，只只有有受受檢檢標(biāo)標(biāo)本本的的加加樣樣誤誤差差才才會(huì)會(huì)影影響響分分析析結(jié)結(jié)果果。。因因此此，，IRMA的的批批內(nèi)內(nèi)和和批批間間變變異異均均比比較較小小。。其他他RIA可可以以測(cè)測(cè)定定大大分分子子量量與與小小分分子子量量的的物物質(zhì)質(zhì)，，雙雙位位點(diǎn)點(diǎn)IRMA只只能能測(cè)測(cè)定定在在分分子子上上具具有有2個(gè)個(gè)以以上上抗抗原原表表位位的的物物質(zhì)質(zhì)。。在在RIA中中應(yīng)應(yīng)用用的的為為多多克克隆隆抗抗體體，，親親和和力力和和特特異異性性要要求求較較高高，，但但用用量量很很少少。。IRMA中中標(biāo)標(biāo)記記抗抗體體和和固固相相抗抗體體用用量量較較多多，，一一般般均均用用來來源源豐豐富富、、特特異異性性較較高高的的單單克克隆隆抗抗體體。。放射射免免疫疫技技術(shù)術(shù)的的應(yīng)應(yīng)用用常用用于于各各種種激激素素、、微微量量蛋蛋白白、、腫腫瘤瘤標(biāo)標(biāo)志志物物和和藥藥物物等等微微量量物物質(zhì)質(zhì)的的測(cè)測(cè)定定。。問題題：：放放射射性性污污染染、、常常用用核核素素半半衰衰期期短短、、試試劑劑盒盒穩(wěn)穩(wěn)定定期期不不長(zhǎng)長(zhǎng)不不易易自自動(dòng)動(dòng)化化儀儀器器分分析析等等。。第九九章章免免疫疫熒熒光光技技術(shù)術(shù)免疫疫熒熒光光技技術(shù)術(shù)(immunofluorescencetechnique)是是標(biāo)標(biāo)記記免免疫疫技技術(shù)術(shù)中中發(fā)發(fā)展展最最早早的的一一種種。。是將將抗抗原原抗抗體體反反應(yīng)應(yīng)的的特特異異性性與與熒熒光光物物質(zhì)質(zhì)檢檢測(cè)測(cè)的的敏敏感感性性和和直直觀觀性性結(jié)結(jié)合合起起來來的的一一種種方方法法。?；驹砝脽晒馑厮貥?biāo)記抗體體，使之在在涂片上或或組織切片片上與標(biāo)本本中的待檢檢抗原特異異結(jié)合，采采用高發(fā)光光效率的點(diǎn)點(diǎn)光源，透透過濾色板板發(fā)出一定定波長(zhǎng)的光光，使結(jié)合合在標(biāo)本上上的熒光素素被激發(fā)而而產(chǎn)生熒光光，借助熒熒光顯微鏡鏡觀察底物物片上熒光光染色形態(tài)態(tài)，來判斷斷有無待檢檢抗原或抗抗體。第一節(jié)熒熒光的基本本知識(shí)異硫氰酸熒熒光素（FITC））為黃色或橙橙黃色結(jié)晶晶粉末，分分子量為389.4，最大吸吸收光波長(zhǎng)長(zhǎng)為490-495nm，最最大發(fā)射光光波長(zhǎng)520-530nm，，呈現(xiàn)明亮亮的黃綠色熒光光，是應(yīng)用最最廣泛的熒熒光素。主要優(yōu)點(diǎn)：：①人眼對(duì)對(duì)黃綠色較較為敏感；；②通常切切片標(biāo)本中中的綠色熒熒光少于紅紅色，降低背景干干擾。四乙基羅丹丹明（RB200））為橘紅色粉粉末，不溶溶于水，易易溶于酒精精和丙酮。。性質(zhì)穩(wěn)定定，可長(zhǎng)期期保存。最最大吸收光光波長(zhǎng)為570nm，最大發(fā)發(fā)射光波長(zhǎng)長(zhǎng)為595－600nm，呈呈橘紅色熒光光。常用于雙雙重標(biāo)記或或?qū)Ρ热旧?。四甲基異硫硫氰酸羅丹丹明（TRITC））最大吸引光光波長(zhǎng)為550nm，最大發(fā)發(fā)射光波長(zhǎng)長(zhǎng)為620nm，呈呈橙紅色熒光光。其異硫氰氰基可與蛋蛋白質(zhì)結(jié)合合，但熒光光效率較低低。熒光分子的的輻射能力力在受到激激發(fā)光較長(zhǎng)長(zhǎng)時(shí)間的照照射后會(huì)減減弱甚至猝猝滅，一些些化合物對(duì)對(duì)熒光有猝猝滅作用，，因此熒光光物質(zhì)的保保存應(yīng)注意意避免光（（特別是紫紫外光）的的直接照射射和與其他他化合物的的接觸。熒光抗體的的制備作為標(biāo)記的的熒光素應(yīng)應(yīng)符合以下下要求：①應(yīng)具有能能與蛋白質(zhì)質(zhì)分子形成成共價(jià)健的的化學(xué)基團(tuán)團(tuán)，與蛋白白質(zhì)結(jié)合后后不易解離離，而未結(jié)結(jié)合的色素素及其降解解產(chǎn)物易于于清除。②熒光效率率高,與蛋蛋白質(zhì)結(jié)合合后，仍能能保持較高高的熒光效效率。③熒光色澤澤與背景組組織的色澤澤對(duì)比鮮明明。④與蛋白質(zhì)質(zhì)結(jié)合后不不影響蛋白白質(zhì)原有的的生化與免免疫性質(zhì)，，與蛋白質(zhì)質(zhì)的結(jié)合物物穩(wěn)定，易易于保存。。⑤標(biāo)記方法法簡(jiǎn)單、安安全無毒。。熒光抗體是是將熒光素素（如FITC）與特異性性抗體以化化學(xué)方式共共價(jià)結(jié)合而而成。標(biāo)記方法：：攪拌法(適合大樣樣品)透析法(適適合小樣品品)標(biāo)記抗體的的純化：透透析法層析分離法法熒光抗體的的鑒定F/P比率：將制備的熒熒光抗體稀稀釋至A280≈1.0，分別測(cè)讀讀A280（蛋白質(zhì)特特異吸收峰峰）和標(biāo)記記熒光素的的特異吸收收峰F/P值越高，說說明抗體分分子上結(jié)合合的熒光素素越多，反反之則越少少。一般用用于固定標(biāo)標(biāo)本的熒光光抗體以F/P＝1.5為宜，用于于活細(xì)胞染染色的以F/P＝2.4為宜?？贵w效價(jià)：效價(jià)越大大標(biāo)記抗體體的特異性性越高非特特異熒光越越少。效價(jià)價(jià)在1:16-1:32者較較為理想抗體特異性性：免疫電泳泳和交叉免免疫電泳觀觀察特異性性沉淀線或或沉淀峰，，在紫外線線照射下發(fā)發(fā)出強(qiáng)烈熒熒光第二節(jié)免免疫熒光光顯微技術(shù)術(shù)基本原理：使熒光抗抗體與標(biāo)本本切片中組組織或細(xì)胞胞表面的抗抗原進(jìn)行反反應(yīng)，洗滌滌除去游離離的熒光抗抗體后，于于熒光顯微微鏡下觀察察，在黑暗暗背景上可可見明亮的的特異熒光光。直接法熒光抗體染染色直接法優(yōu)點(diǎn)：操作作簡(jiǎn)便、特特異性高、、非特異熒熒光染色色因素少，，缺點(diǎn)：靈敏敏度偏低，，每檢查一一種抗原需需制備相應(yīng)應(yīng)的特異熒熒光抗體間接法間接法優(yōu)點(diǎn)：靈敏敏度高，在在不同抗原原的檢測(cè)中中只需應(yīng)用用一種熒光光抗體。既既可檢測(cè)抗抗原，也可可檢測(cè)抗體體。免疫熒光技技術(shù)在醫(yī)學(xué)學(xué)檢驗(yàn)中的的應(yīng)用在細(xì)菌學(xué)檢檢驗(yàn)中主要要用于菌種種的鑒定。。免疫熒光用用于梅毒螺螺旋體抗體體的檢測(cè)是是梅毒特異異性診斷常常用方法之之一。用熒光抗體體染色法可可檢出病毒毒及其繁殖殖情況。在寄生蟲感感染診斷中中，間接免免疫熒光試試驗(yàn)（IFAT）是是當(dāng)前公認(rèn)認(rèn)的最有效效的檢測(cè)瘧瘧疾抗體的的方法。免疫熒光法法還是檢測(cè)測(cè)自身抗體體的好工具具，在自身身免疫病的的實(shí)驗(yàn)診斷斷中應(yīng)用廣廣泛。其突突出優(yōu)點(diǎn)是是能以簡(jiǎn)單單方法同時(shí)時(shí)檢測(cè)抗體體和與抗體體起特異反反應(yīng)的組織織成分，并并能在同一一組織中同同時(shí)檢查抗抗不同組織織成分的抗抗體。熒光抗體技技術(shù)的一種種特殊應(yīng)用用是流式細(xì)細(xì)胞分析（（flowcytometry）?？煽捎糜跈z測(cè)測(cè)細(xì)胞大小小、折散率率、粘滯度度等，更常常用于T細(xì)細(xì)胞亞群等等的檢測(cè)。。第十章酶酶免疫技技術(shù)第一節(jié)酶酶免疫技術(shù)術(shù)概述基本原理利用酶催化化底物反應(yīng)應(yīng)的生物放放大作用,提高特異異性抗原-抗體免疫疫學(xué)反應(yīng)的的檢測(cè)敏感感性的一種種標(biāo)記免疫疫技術(shù)?；咎攸c(diǎn)：：①標(biāo)記后保保留酶和抗抗原(抗體體)的活性性②酶促反應(yīng)應(yīng)專一性，，保證特異異性③底物反應(yīng)應(yīng)放大作用用，提高敏敏感性④酶標(biāo)試劑劑保存穩(wěn)定定⑤操作簡(jiǎn)便便，安全易易行主要試劑的的制備與要要求一、酶與酶酶作用底物物（一）用于于標(biāo)記酶的的要求：酶活性高標(biāo)記后酶活活性穩(wěn)定，，且不影響響標(biāo)記抗原原與抗體的的免疫反應(yīng)應(yīng)性酶催化底物物后信號(hào)易易判定或測(cè)測(cè)定酶活性不受受樣品中其其他成分的的影響酶、輔助因因子及底物物理化性質(zhì)質(zhì)穩(wěn)定，安安全無害，，價(jià)廉（二）常用用酶及其底底物1.辣根過過氧化物酶酶（HRP）常用底物：：鄰苯二胺（（OPD））：反應(yīng)顯顯橙黃色，，應(yīng)避光，，致癌性四甲基聯(lián)苯苯胺（TMB）：反反應(yīng)后呈藍(lán)藍(lán)色，無需需避光，無無致癌性，，但水溶性性差。2.堿性性磷酸酶（（AP）常用底物為為對(duì)硝基苯苯磷酸酯（（p-NPP），產(chǎn)產(chǎn)物為黃色色。*AP靈敏性性高與HRP，但不不易獲得純純品，穩(wěn)定定性及酶標(biāo)標(biāo)記物收率率低于HRP，且價(jià)高高，故應(yīng)用用不如HRP普及。。二、酶標(biāo)記記抗體或抗抗原基本要求：：酶標(biāo)記抗原原純度要高高，抗原性性完整；抗抗體的特異異性好，效效價(jià)高，親親和力強(qiáng)，，比活性高高以及易于于批量生產(chǎn)產(chǎn)和分離純純化酶標(biāo)記方法法1.交聯(lián)法法以雙功能交交聯(lián)劑為““橋”，分分別與酶和和抗體（抗抗原）連接接形成結(jié)合合物。如戊戊二醛交聯(lián)聯(lián)法。2.直接法用過碘酸鈉鈉活化酶蛋蛋白分子后后，再與抗抗體（抗原原）結(jié)合。。僅適用于于含糖蛋白白分子的酶酶（如HRP）標(biāo)記記物制備。。三、固相載載體基本要求結(jié)合容量高高，結(jié)合穩(wěn)穩(wěn)定；可與與抗原抗體體復(fù)合物等等大分子蛋蛋白結(jié)合；；生物大分分子固化后后仍保持活活性；固化化方法簡(jiǎn)便便易行、快快捷經(jīng)濟(jì)。。固相載體的的種類與選選擇1.塑料制品材料經(jīng)濟(jì)，，操作簡(jiǎn)便便，易于自自動(dòng)化，最最常用。2.微顆粒結(jié)合容量大大，反應(yīng)迅迅速，逐漸漸普遍用于于自動(dòng)化分分析。3.膜載體硝酸纖維素素膜（NC）、尼龍龍膜等微孔孔濾膜，廣廣泛應(yīng)用于于定性或半半定量的斑斑點(diǎn)ELISA。四、、免免疫疫吸吸附附劑劑原理理：：非非共共價(jià)價(jià)鍵鍵吸吸附附或或共共價(jià)價(jià)鍵鍵化化學(xué)學(xué)偶偶聯(lián)聯(lián)（（包包被被））。。一般般采采用用偏偏堿堿性性（（pH9.6））的的碳碳酸酸鹽鹽溶溶液液（（ELISA板板））。。封閉閉：：1％％－－5％％牛牛血血清清白白蛋蛋白白或或5％％－－20％％小小牛牛血血清清。。酶免免疫疫技技術(shù)術(shù)的的分分類類酶免免疫疫組組化化用于于檢檢測(cè)測(cè)組組織織切切片片或或細(xì)細(xì)胞胞涂涂片片中中的的抗抗原原和和抗抗體體酶免免疫疫技技術(shù)術(shù)均均相相酶酶免免疫疫測(cè)測(cè)定定酶免免疫疫測(cè)測(cè)定定固固相相酶酶免免疫疫測(cè)測(cè)定定異相相酶酶免免疫疫測(cè)測(cè)定定（ELISA））液相相酶酶免免疫疫測(cè)測(cè)定定均相相酶酶免免疫疫測(cè)測(cè)定定Ag+Ab-EAgAb-E+Ab-E基本本原原理理：：利利用用酶酶標(biāo)標(biāo)抗抗體體結(jié)結(jié)合合抗抗原原形形成成復(fù)復(fù)合合物物后后，，標(biāo)標(biāo)記記酶酶的的活活性性發(fā)發(fā)生生改改變變的的原原理理，，在在不不將將復(fù)復(fù)合合物物與與游游離離酶酶標(biāo)標(biāo)抗抗體體分分離離的的情情況況下下，，直直接接測(cè)測(cè)定定系系統(tǒng)統(tǒng)中中總總的的標(biāo)標(biāo)記記酶酶活活性性的的改改變變，，進(jìn)進(jìn)而而推推算算出出待待檢檢樣樣品品中中的的抗抗原原量量。。異相相酶酶免免疫疫測(cè)測(cè)定定（enzymeimmunoassay,EIA））基本本原原理理：：在在抗抗原原抗抗體體反反應(yīng)應(yīng)后后，，先先將將抗抗原原抗抗體體復(fù)復(fù)合合物物與與游游離離的的酶酶標(biāo)標(biāo)抗抗體體分分離離，，再再測(cè)測(cè)定定酶酶標(biāo)標(biāo)記記的的復(fù)復(fù)合合物物催催化化底底物物顯顯色色的的活活性性，，最最后后推推算算出出樣樣品品中中抗抗原原的的含含量量。。液相相EIA：分分離離劑劑分分離離游游離離的的和和結(jié)結(jié)合合的的標(biāo)標(biāo)記記物物。。固相相EIA：固固相相載載體體結(jié)結(jié)合合酶酶標(biāo)標(biāo)復(fù)復(fù)合合物物，，經(jīng)經(jīng)洗洗滌滌去去除除游游離離的的酶酶標(biāo)標(biāo)抗抗體體。。如如ELISA。。Ag+Ab-EAgAb-E+Ab-E第二二節(jié)節(jié)酶酶聯(lián)聯(lián)免免疫疫吸吸附附試試驗(yàn)驗(yàn)enzymelinkedimmunosorbentassay(ELISA)基本本原原理理：：使抗抗原原或或抗抗體體結(jié)結(jié)合合到到某某種種固固相相載載體體表表面面，，并并保保持持其其免免疫疫活活性性在測(cè)測(cè)定定時(shí)時(shí)，，把把受受檢檢標(biāo)標(biāo)本本（（測(cè)測(cè)定定其其中中的的抗抗體體或或抗抗原原））和和酶酶標(biāo)標(biāo)抗抗原原或或抗抗體體按按不不同同的的步步驟驟與與固固相相載載體體表表面面的的抗抗原原或或抗抗體體起起反反應(yīng)應(yīng)用洗洗滌滌的的方方法法使使固固相相載載體體上上形形成成的的抗抗原原抗抗體體復(fù)復(fù)合合物物與與其其他他物物質(zhì)質(zhì)分分開開，，最最后后結(jié)結(jié)合合在在固固相相載載體體上上的的酶酶量量與與標(biāo)標(biāo)本本中中受受檢檢物物質(zhì)質(zhì)的的量量成成一一定定的的比比例例。。加入酶反反應(yīng)的底底物后，，底物被被酶催化化變?yōu)橛杏猩a(chǎn)物物，產(chǎn)物物的量與與標(biāo)本中中受檢物物質(zhì)的量量直接相相關(guān)，故故可根據(jù)據(jù)顏色反反應(yīng)的深深淺進(jìn)行行定性或或定量分分析ELISA技術(shù)術(shù)類型：：ELISA可用用于測(cè)定定抗原，，也可用用于測(cè)定定抗體，，在這種種測(cè)定方方法中有有3種必必要的試試劑：固相的抗抗原或抗抗體，酶標(biāo)記的的抗原或或抗體，，酶作用的的底物。。1．雙抗抗體夾心心法特點(diǎn)：非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)結(jié)合反應(yīng)應(yīng)常用于抗抗原的檢檢測(cè)適用于分分子中具具有至少少兩個(gè)抗抗原決定定簇的多多價(jià)抗原原，而不不能用于于小分子子半抗原原的檢測(cè)測(cè)所用兩種種抗體分分別針對(duì)對(duì)同一個(gè)個(gè)抗原分分子的不不同抗原原決定簇簇2．間接接法3.競(jìng)爭(zhēng)爭(zhēng)法特點(diǎn)：用于抗原原和半抗抗原的定定量測(cè)定定，也可可對(duì)抗體體進(jìn)行測(cè)測(cè)定。酶標(biāo)Ag（Ab）與樣樣品或標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品中中的非標(biāo)標(biāo)記Ag（Ab）具有有相同的的與固相相Ab(Ag)結(jié)合的的能力。。反應(yīng)體系系中，固固相Ab（Ag）和酶酶標(biāo)Ag（Ab）是固固定限量量的，且且前者的的結(jié)合位位點(diǎn)少于于酶標(biāo)記記與非標(biāo)標(biāo)記Ag（Ab）的分分子數(shù)量量和。反應(yīng)后，，結(jié)合與與固相載載體上復(fù)復(fù)合物中中被測(cè)定定的酶標(biāo)標(biāo)Ag（（Ab））的量（（酶活性性）與樣樣品中非非標(biāo)記Ag（Ab）的的濃度成成反比。。4.捕獲獲法（反反向間接接法）主要用于于血清清中某種種抗體亞亞型成分分（如IgM））的測(cè)定定?；驹砝恚汗滔嗫笽gM待檢標(biāo)本(IgM)抗原(與特異抗體結(jié)合)E酶標(biāo)抗體底物第三節(jié)膜膜載體體的酶免免疫測(cè)定定固相膜免免疫測(cè)定定與ELISA相類似似,其特特點(diǎn)是以以微孔膜膜作為固固相.標(biāo)標(biāo)記物可可用酶和和各種有有色微粒粒子,如如彩色乳乳膠、膠膠體金等等。常用用固相膜膜為硝酸酸纖維素素膜。類型：免免疫滲濾濾試驗(yàn)：：穿流形形式免疫層析析試驗(yàn)：：橫流形形式斑點(diǎn)酶免免疫吸附附試驗(yàn)（（dot-ELISA）免疫印跡跡法(Westernblot)免疫印跡跡法（immunoblottingtest，，IBT）亦被稱為為Westernblot分三個(gè)階階段進(jìn)行行:SDS-聚丙烯烯酰胺凝凝膠電泳泳（SDS）電轉(zhuǎn)移酶免疫定定位SDS抗原等蛋蛋白樣品品經(jīng)SDS處理理后帶陰陰電荷，，在聚丙丙烯胺凝凝膠中從從陰極向向陽(yáng)泳動(dòng)動(dòng)，分子子量越小小，泳動(dòng)動(dòng)速度就就越快。。此階段段分離效效果肉眼眼不可見見（只有有在染色色后才顯顯出電泳泳區(qū)帶））電轉(zhuǎn)移將在凝膠膠中已經(jīng)經(jīng)分離的的條帶轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移至硝硝酸纖維維素膜上上，選用用低電壓壓（100V））和大電電流（1-2A），通通電45min轉(zhuǎn)移即即可完成成。此分分階段分分離的蛋蛋白質(zhì)條條帶肉眼眼仍不可可見。酶免疫定定位將印有蛋蛋白質(zhì)條條帶的硝硝酸纖維維素膜（（相當(dāng)于于包被了了抗原的的固相載載體）依依次與特特異性抗抗體和酶酶標(biāo)第二二抗體作作用后，，加入能能形成不不溶性顯顯色物的的酶反應(yīng)應(yīng)底物，，使區(qū)帶帶染色。。陽(yáng)性反反應(yīng)的條條帶清晰晰可辨，，并可根根據(jù)SDA加入的的分子量量標(biāo)準(zhǔn)，，確定各各組分的的分子量量。第四節(jié)酶酶免免疫測(cè)定定的應(yīng)用用病原體及及其抗體體廣泛應(yīng)應(yīng)用于傳傳染病的的診斷。。病毒如如肝炎病病毒、風(fēng)風(fēng)疹病毒毒、皰疹疹病毒、、輪狀病病毒等；；細(xì)菌如如鏈球菌菌、結(jié)核核分枝桿桿菌、幽幽門螺桿桿菌和布布氏桿菌菌等；寄寄生蟲如如弓形體體、阿米米巴、瘧瘧原蟲等等。蛋白質(zhì)如如各種免免疫球蛋蛋白、補(bǔ)補(bǔ)體組分分、腫瘤瘤標(biāo)志物物（例如如AFP、CEA、PSA））、多種種血漿蛋蛋白質(zhì)、、同工酶酶、激素素（如HCG、、TSH）。非肽類激激素如T3、T4、雌雌激素、、皮質(zhì)醇醇等。藥物和毒毒品如地地高辛、、苯巴比比妥、慶慶大霉素素、嗎啡啡等。ABC-ELISA(應(yīng)用親親和素和和生物素素的ELISA)生物素-親合素素系統(tǒng)(biotin-avidinsystem，BAS)，，是70年代后后期應(yīng)用用于免疫疫學(xué)，并并得到迅迅速發(fā)展展的一種種新型生生物反應(yīng)應(yīng)放大系系統(tǒng)。由由于它具具有生物物素與親親合素之之間高度度親和力力及多級(jí)級(jí)放大效效應(yīng)，并并與熒光光素、酶酶、同位位素等免免疫標(biāo)記記技術(shù)有有機(jī)地結(jié)結(jié)合，使使各種示示蹤免疫疫分析的的特異性性和靈敏敏度進(jìn)一一步提高高。親和素素是一種種糖蛋蛋白，，可以以和4個(gè)生生物素素分子子親密密結(jié)合合?，F(xiàn)現(xiàn)在使使用更更多的的是從從鏈霉霉菌中中提取取的鏈鏈霉和和素（（strepavidin））。生物素素（biotin）。。卵黃黃、肝肝組織織提取取用化化學(xué)方方法制制成的的衍生生物，，生物物素－－羥基基琥珀珀亞胺胺酯（（biotin-hydroxysuccinimide，，BNHS）。。末端端羧基基可與與蛋白白質(zhì)、、糖類類和酶酶等多多種類類型的的大小小分子子形成成生物物素化化的產(chǎn)產(chǎn)物。。親和素素與生生物素素的結(jié)結(jié)合，，雖不不屬免免疫反反應(yīng)，，但特特異性性強(qiáng)，，親和和力大大，兩兩者一一經(jīng)結(jié)結(jié)合就就極為為穩(wěn)定定。由由于1個(gè)親親和素素分子子有4個(gè)生生物素素分子子的結(jié)合合位置置，可可以連連接更更多的的生物物素化化的分分子，，形成成一種種類似似晶格格的復(fù)復(fù)合體體。因因此把把親和和素和和生物物素與與ELIS偶聯(lián)聯(lián)起來來，就就可大大提高高ELISA的的敏感感度。。橋聯(lián)法法ABC-ELISA（（avidinbiotincomplex-ELISA））夾心心法測(cè)測(cè)抗原原的過過程廣泛應(yīng)應(yīng)用于于生物物醫(yī)學(xué)學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)研究究的各各個(gè)領(lǐng)領(lǐng)域，，既可可用于于微量量抗原原、抗抗體及及受體體的定定量、、定性性檢測(cè)測(cè)及定定位觀觀察研研究，，亦可可制成成親和和介質(zhì)質(zhì)用于于上述述各類類反應(yīng)應(yīng)體系系中反反應(yīng)物物的分分離、、純化化。9、靜靜夜夜四四無無鄰鄰，，荒荒居居舊舊業(yè)業(yè)貧貧。。。。12月月-2212月月-22Thursday,December29,202210、雨中黃黃葉樹，，燈下白白頭人。。。03:52:3503:52:3503:5212/29/20223:52:35AM11、以我獨(dú)獨(dú)沈久，，愧君相相見頻。。。12月-2203:52:3503:52Dec-2229-Dec-2212、故故人人江江海海別別，，幾幾度度隔隔山山川川。。。。03:52:3503:52:3503:52Thursday,December29,202213、乍見見翻疑疑夢(mèng)，，相悲悲各問問年。。。12月月-2212月月-2203:52:3503:52:35December29,202214、他鄉(xiāng)鄉(xiāng)生白白發(fā)，，舊國(guó)國(guó)見青青山。。。29十十二二月20223:52:35上上午03:52:3512月月-2215、比不了了得就不不比，得得不到的的就不要要。。。十二月223:52上午午12月-2203:52December29,202216、行行動(dòng)動(dòng)出出成成果果，，工工作作出出財(cái)財(cái)富富。。。。2022/12/293:52:3603:52:3629December202217、做前，，能夠環(huán)環(huán)視四周周；做時(shí)時(shí)，你只只能或者者最好沿沿著以腳腳為起點(diǎn)點(diǎn)的射線線向前。。。3:52:36上午午3:52上午午03:52:3612月-229、沒有有失敗敗，只只有暫暫時(shí)停停止成成功??！。12月月-2212月月-22Thursday,December29,202210、很很多多事事情情努努力力了了未未必必有有結(jié)結(jié)