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術擴

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術獲取基因全長簡介基因初步驗證基因全長獲?。≧ACE技術）RACE產物鑒定4123以介紹5’RACE技術為主5對序列進行生物信息學分析目錄獲取基因全長簡介基因初步驗證基因全長獲?。≧為什么要獲取基因全長？什么是EST？獲取基因全長基本流程？

獲取基因全長簡介EST(ExpressedSequenceTag)表達序列標簽—是從一個隨機選擇的cDNA克隆，進行5’端和3’端單一次測序挑選出來獲得的短的cDNA部分序列,代表一個完整基因的一小部分,在數據庫中其長度一般從20到7000bp不等,平均長度為360±120bp。獲取全長cDNA是研究基因功能的關鍵，是進行基因功能及產物分析的必要前提。為什么要獲取基因全長？獲取基因全長簡介EST(Expres獲取基因全長基本流程構建數據庫篩選EST序列普通PCR進行初步驗證RACE技術生物信息學分析庫篩選EST基因初步驗證獲取基因全長進行全序列分析以本實驗室具體情況為例子獲取基因全長基本流程構建數據庫篩選EST序列普通PCR進行初生物信息學分析Blast比對ORF比對相似序列多重比對家族成員多重比對PCR擴增凝膠回收測序設計引物提取RNA反轉錄PCR擴增Ⅰ電泳檢測Ⅱ凝膠回收Ⅲ電泳檢測Ⅳ克隆PCR產物測序凝膠回收測序克隆后菌液測序克隆后質粒測序基因初步驗證生物信息學分析Blast比對PCR擴增凝膠回收測序設計引物ⅠRACE技術方法RACE簡介試劑盒選取5’RACE原理實驗過程基因全長獲取RACE技術方法RACE試劑盒5’RACE實驗基因全長獲cDNA末端快速擴增(rapidamplificationofcDNAends,RACE)技術是基于PCR技術由已知的部分cDNA序列來獲得完整cDNA序列的一種方法。分為3’RACE和5’RACE

RACE簡介cDNA末端快速擴增分為3’RACE和5’RACERACClontech公司全稱：SMARTRACEcDNAamplificationkit

優(yōu)點：操作簡便，成功率較高，全長分子的比例較高

價錢：中等偏上。缺點：不知道能否拿到完整的5’UTR.試劑盒選取Clontech公司全稱：優(yōu)點：價錢：中等偏上。缺點：試劑盒5’RACE原理5’polyA3’Oligo(dT)primer5’polyA3’cDNA第一條鏈合成機制polyA3’polyA3’3’5’5’RACE5’polyA3’Oligo(dT)prime5’RACE原理polyA3’5’3’LUPSuppressionPCR:阻抑聚合酶反應5’3’5’3’3’5’GSP13’GSP1SUP5’5’3’5’3’5’RACEpolyA3’5’3’LUPSuppressi實驗過程合成cDNA第一條鏈（1）制備A管：加好后放在室溫下。共計4ul。2.0ul5XFirst-StrandBuffer1.0ulDTT(20mM)1.0uldNTPMix(10mM)4.0ulTotalVolume（2）制備B管：冰上操作。

1.0-2.75ulRNA1.0ul5'-CDSPrimerA

再加入無菌水，使體積達到3.75ul?；旌先芤海⒂谜粕想x心機離心。72℃3分鐘，42℃2分鐘。此過程可在PCR儀中進行。之后14000g離心10s。如果是做5’RACE，則加入1ulSMARTerIIAoligo。此時B管體積為4.75ul。實驗合成cDNA第一條鏈（1）制備A管：加好后放在室溫下。共實驗過程合成cDNA第一條鏈（3）在上一步放入PCR儀中后，在之前放在室溫下的A管中加入：（室溫進行）0.25ulRNaseInhibitor(40U/μl)1.0ulSMARTScribeReverseTranscriptase(100U)加上之前A管中的4ul，此時總體積為5.25ul。

（4）將A管中的混合液體5.25ul加入到B管4.75ul中。使體積達到10ul。緩慢吸打混合，離心至管底部。之后將管放在PCR儀中42℃90分鐘。70℃10分鐘。（5）在管中加入Tricine-EDTABuffer100ul。（在總RNA的濃度≥200ng時）-20℃保存3個月。實驗合成cDNA第一條鏈（3）在上一步放入PCR儀中后，在之RACEPCR每50ul的體系中先合成41.5ul的MasterMix:34.5ulPCR-GradeWater5.0ulHiFiPCRBuffer1.0uldNTP1.0ulHiFiMix實驗過程RACEPCR每50ul的體系中先合成41.5ul的MasPCR反應體系：5’RACEreadycDNA:2.5ulUPM（10*）：5ulGSP1（10uM）：1ulMasterMix：41.5ulTotal：50ul實驗過程RACEPCRPCR反應程序：94℃3min30cycles94°C30sec68°C30sec72°C3min72℃10min4℃+∞PCR反應體系：實驗RACEPCRPCR反應程序：4種方法凝膠回收對PCR產物進行凝膠回收，確認片段大小，對回收產物進行測序。產物位置、大小比較GSPs和NGSPs作為引物時擴增得到的產物。

克隆測序對RACE產物進行克隆測序，建議選取8-10個克隆進行測序。SouthernBlot

對Southern雜交結果進行分析RACE產物的鑒定4種方法凝膠回收對PCR產物進行凝膠回收，確認片段大小，對回謝

謝謝

謝擴

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術獲取基因全長簡介基因初步驗證基因全長獲取（RACE技術）RACE產物鑒定4123以介紹5’RACE技術為主5對序列進行生物信息學分析目錄獲取基因全長簡介基因初步驗證基因全長獲?。≧為什么要獲取基因全長？什么是EST？獲取基因全長基本流程？

獲取基因全長簡介EST(ExpressedSequenceTag)表達序列標簽—是從一個隨機選擇的cDNA克隆，進行5’端和3’端單一次測序挑選出來獲得的短的cDNA部分序列,代表一個完整基因的一小部分,在數據庫中其長度一般從20到7000bp不等,平均長度為360±120bp。獲取全長cDNA是研究基因功能的關鍵，是進行基因功能及產物分析的必要前提。為什么要獲取基因全長？獲取基因全長簡介EST(Expres獲取基因全長基本流程構建數據庫篩選EST序列普通PCR進行初步驗證RACE技術生物信息學分析庫篩選EST基因初步驗證獲取基因全長進行全序列分析以本實驗室具體情況為例子獲取基因全長基本流程構建數據庫篩選EST序列普通PCR進行初生物信息學分析Blast比對ORF比對相似序列多重比對家族成員多重比對PCR擴增凝膠回收測序設計引物提取RNA反轉錄PCR擴增Ⅰ電泳檢測Ⅱ凝膠回收Ⅲ電泳檢測Ⅳ克隆PCR產物測序凝膠回收測序克隆后菌液測序克隆后質粒測序基因初步驗證生物信息學分析Blast比對PCR擴增凝膠回收測序設計引物ⅠRACE技術方法RACE簡介試劑盒選取5’RACE原理實驗過程基因全長獲取RACE技術方法RACE試劑盒5’RACE實驗基因全長獲cDNA末端快速擴增(rapidamplificationofcDNAends,RACE)技術是基于PCR技術由已知的部分cDNA序列來獲得完整cDNA序列的一種方法。分為3’RACE和5’RACE

RACE簡介cDNA末端快速擴增分為3’RACE和5’RACERACClontech公司全稱：SMARTRACEcDNAamplificationkit

優(yōu)點：操作簡便，成功率較高，全長分子的比例較高

價錢：中等偏上。缺點：不知道能否拿到完整的5’UTR.試劑盒選取Clontech公司全稱：優(yōu)點：價錢：中等偏上。缺點：試劑盒5’RACE原理5’polyA3’Oligo(dT)primer5’polyA3’cDNA第一條鏈合成機制polyA3’polyA3’3’5’5’RACE5’polyA3’Oligo(dT)prime5’RACE原理polyA3’5’3’LUPSuppressionPCR:阻抑聚合酶反應5’3’5’3’3’5’GSP13’GSP1SUP5’5’3’5’3’5’RACEpolyA3’5’3’LUPSuppressi實驗過程合成cDNA第一條鏈（1）制備A管：加好后放在室溫下。共計4ul。2.0ul5XFirst-StrandBuffer1.0ulDTT(20mM)1.0uldNTPMix(10mM)4.0ulTotalVolume（2）制備B管：冰上操作。

1.0-2.75ulRNA1.0ul5'-CDSPrimerA

再加入無菌水，使體積達到3.75ul。混合溶液，并用掌上離心機離心。72℃3分鐘，42℃2分鐘。此過程可在PCR儀中進行。之后14000g離心10s。如果是做5’RACE，則加入1ulSMARTerIIAoligo。此時B管體積為4.75ul。實驗合成cDNA第一條鏈（1）制備A管：加好后放在室溫下。共實驗過程合成cDNA第一條鏈（3）在上一步放入PCR儀中后，在之前放在室溫下的A管中加入：（室溫進行）0.25ulRNaseInhibitor(40U/μl)1.0ulSMARTScribeReverseTranscriptase(100U)加上之前A管中的4ul，此時總體積為5.25ul。

（4）將A管中的混合液體5.25ul加入到B管4.75ul中。使體積達到10ul。緩慢吸打混合，離心至管底部。之后將管放在PCR儀中42℃90分鐘。70℃10分鐘。（5）在管中加入Tricine-EDTABuffer100ul。（在總RNA的濃度≥200ng時）-20℃保存3個月。實驗合成cDNA第一條鏈（3）在上一步放入PCR儀中后，在之RACEPCR每50ul的體系中先合成41.5ul的MasterMix:34.5ulPCR-GradeWater5.0ulHiFiPCRBuffer1.0uldNTP1.0ulHiFiMix實驗過程RACEPCR每50ul的體系中先合成41.5ul的MasPCR反應體系：5’RACEreadycDNA:2.5ulUPM（10*）：5ulGSP1（10uM）：1ulMasterMix：41.5ulTotal：50ul實驗過程RACEPCRPCR反應程序：94℃3min30cycles94°C30sec6