實(shí)時(shí)熒光定量PCR

數(shù)據(jù)分析及常見問題分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR

數(shù)據(jù)分析及常見問題分析1一、數(shù)據(jù)分析定量PCR擴(kuò)增曲線的各種概念一、數(shù)據(jù)分析定量PCR擴(kuò)增曲線的各種概念2一、數(shù)據(jù)分析什么是基線基線是擴(kuò)增曲線的水平部分。一、數(shù)據(jù)分析什么是基線3一、數(shù)據(jù)分析基線扣除一、數(shù)據(jù)分析基線扣除4一、數(shù)據(jù)分析什么是閾值閾值是一個(gè)熒光強(qiáng)度值，穿過閾值與X軸平行的直線稱為閾值線。一、數(shù)據(jù)分析什么是閾值5一、數(shù)據(jù)分析什么是Ct值Ct值是閾值線與擴(kuò)增曲線的交點(diǎn)對應(yīng)在X軸上的值。一、數(shù)據(jù)分析什么是Ct值6一、數(shù)據(jù)分析基線一、數(shù)據(jù)分析基線7一、數(shù)據(jù)分析基線一、數(shù)據(jù)分析基線8一、數(shù)據(jù)分析基線一、數(shù)據(jù)分析基線9一、數(shù)據(jù)分析基線一、數(shù)據(jù)分析基線10一、數(shù)據(jù)分析閾值線一、數(shù)據(jù)分析閾值線11一、數(shù)據(jù)分析閾值線一、數(shù)據(jù)分析閾值線12實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析及常見問題分析課件13二、常見問題分析1、PCR擴(kuò)增抑制（以Bio-CFX96為例）擴(kuò)增曲線熒光強(qiáng)度大小及Ct值大小可提示存在抑制。H07存在擴(kuò)增抑制；解決方法：將樣本稀釋后進(jìn)行擴(kuò)增。（抑制物的影響可通過稀釋樣本消除）二、常見問題分析1、PCR擴(kuò)增抑制（以Bio-CFX96為例14二、常見問題分析PCR抑制物黑色素多糖類血紅蛋白尿素其他乙醇

蛋白酶K胍鹽苯酚二、常見問題分析PCR抑制物15二、常見問題分析血液中PCR抑制物的作用機(jī)制及對策抑制物作用原理對策肝素可結(jié)合于DNA和RNA上；對反轉(zhuǎn)錄酶和聚合酶有抑制作用。肝素酶或氯化鋰血紅蛋白含有鐵，釋放鐵離子至PCR混合物，干擾DNA合成。1）DNA-瓊漿糖凝膠珠的相互混合；2）加入0.6%（wt/vol）的BSA（牛血清白蛋白）；3）NaOH處理。乳鐵蛋白含有鐵，釋放鐵離子至PCR混合物，干擾DNA合成。同上免疫球蛋白IgG與單鏈DNA相互作用同上亞鐵血紅素與DNA、RNA結(jié)合，后續(xù)的提取過程中不能被去除；抑制聚合酶活性。加BSA，結(jié)合亞鐵血紅素二、常見問題分析血液中PCR抑制物的作用機(jī)制及對策抑制物作用16二、常見問題分析檢查樣本質(zhì)量用分光光度計(jì)測量樣本260/280比值DNA純度：OD260/OD280=1.8RNA純度：OD260/OD280=2.0二、常見問題分析檢查樣本質(zhì)量17二、常見問題分析2、自動(dòng)基線有問題二、常見問題分析2、自動(dòng)基線有問題18二、常見問題分析手動(dòng)設(shè)置基線點(diǎn)擊右鍵，選擇BaselineThreshold二、常見問題分析手動(dòng)設(shè)置基線19二、常見問題分析手動(dòng)設(shè)置基線將BaselineEnd設(shè)置為“擴(kuò)增信號出現(xiàn)的前一個(gè)循環(huán)”即，原始為26，將其設(shè)置為20，點(diǎn)擊OK二、常見問題分析手動(dòng)設(shè)置基線20二、常見問題分析手動(dòng)設(shè)置基線設(shè)置完成后問題曲線恢復(fù)正常二、常見問題分析手動(dòng)設(shè)置基線21二、常見問題分析3、重復(fù)性1個(gè)樣本4個(gè)復(fù)孔重復(fù)性好二、常見問題分析3、重復(fù)性22二、常見問題分析3、重復(fù)性1個(gè)樣本4個(gè)復(fù)孔重復(fù)性差二、常見問題分析3、重復(fù)性23二、常見問題分析造成重復(fù)性差的原因基線、閾值的設(shè)置加樣誤差（操作？移液器？）沒有將試劑和樣本充分混勻低拷貝的樣本→泊松分布沒有使用ROX校準(zhǔn)（ABI7500）二、常見問題分析造成重復(fù)性差的原因24二、常見問題分析基線、閾值的設(shè)置根據(jù)曲線的具體情況進(jìn)行設(shè)置：閾值：大部分曲線熒光強(qiáng)度/20基線：開始→2/3（根據(jù)儀器和試劑）

結(jié)束→擴(kuò)增信號出現(xiàn)的前一個(gè)循環(huán)如果基線、閾值設(shè)置無問題，則是其它原因造成重復(fù)性差。二、常見問題分析基線、閾值的設(shè)置25二、常見問題分析加樣誤差（操作？移液器？）沒有將試劑和樣本充分混勻有時(shí)候在制備PCR反應(yīng)混合液時(shí)（包括Goldstar/PCRMix反應(yīng)液、引物探針、樣本、水），在分裝入反應(yīng)板（管）前沒有充分混勻。結(jié)果加入到每個(gè)孔中的試劑成分就有所不同。解決方法：在分裝反應(yīng)混合液前，要將其充分混勻（振蕩、吹打）離心。同時(shí)上機(jī)之前，要將PCR反應(yīng)板（管）離心，使所有液體都在反應(yīng)管底部。二、常見問題分析加樣誤差（操作？移液器？）26二、常見問題分析低拷貝的樣本→泊松分布泊松分布：是一種統(tǒng)計(jì)與概率學(xué)里常見到的離散機(jī)率分布（discreteprobabilitydistribution）。在30ul中有9個(gè)模板，每個(gè)反應(yīng)管均勻的分配到3個(gè)模板的幾率有多高？如果30ul中有9000個(gè)模板呢，又會(huì)怎么樣？二、常見問題分析低拷貝的樣本→泊松分布27二、常見問題分析ROX校準(zhǔn)：參比熒光（ABI7500）二、常見問題分析ROX校準(zhǔn)：參比熒光（ABI7500）28二、常見問題分析ROX設(shè)置ABI7500儀器軟件自動(dòng)進(jìn)行ROX校準(zhǔn)。ROX校準(zhǔn)為可選步驟，如果使用的PCR試劑沒有添加ROX參比熒光，或者ROX添加濃度不適合，請將ROX校準(zhǔn)關(guān)閉（None）。二、常見問題分析ROX設(shè)置29二、常見問題分析4、“可疑的”擴(kuò)增曲線（以ABI7500為例）由于PCR擴(kuò)增形成的真正的擴(kuò)增曲線通常很容易確認(rèn)。有特征的形狀：首先有背景信號（基線期），然后是三個(gè)增長階段（指數(shù)增長期、線性增長期和平臺(tái)期）二、常見問題分析4、“可疑的”擴(kuò)增曲線（以ABI7500為30二、常見問題分析指數(shù)增長期內(nèi)擴(kuò)增曲線具有高度重復(fù)性二、常見問題分析指數(shù)增長期內(nèi)擴(kuò)增曲線具有高度重復(fù)性31二、常見問題分析是什么原因造成平臺(tái)期很低呢？可能是目標(biāo)樣本的濃度太低。通常如果模板的起始濃度太低，反應(yīng)體系中會(huì)形成大量的引物二聚體。大量引物二聚體的形成使得引物很快消耗完，從而造成擴(kuò)增曲線的平臺(tái)期很低。二、常見問題分析是什么原因造成平臺(tái)期很低呢？32二、常見問題分析引物和模板比例二、常見問題分析引物和模板比例33二、常見問題分析是否可以調(diào)整引物和模板的比例？YES。低引物濃度會(huì)導(dǎo)致高Ct值（靈敏度低）。所以對于低濃度的樣本，反應(yīng)體系中引物的濃度卻不能太低。二、常見問題分析是否可以調(diào)整引物和模板的比例？34二、常見問題分析如何判斷他們是否存在擴(kuò)增？首先看對數(shù)圖譜，和同一反應(yīng)中的其它曲線相比，這些曲線的形狀不相同。二、常見問題分析如何判斷他們是否存在擴(kuò)增？35二、常見問題分析如何判斷他們是否存在擴(kuò)增？同時(shí)這些曲線沒有明顯的指數(shù)增長期。二、常見問題分析如何判斷他們是否存在擴(kuò)增？36二、常見問題分析如何判斷他們是否存在擴(kuò)增？最后看線性圖譜。曲線一直沒有上升的趨勢，提示不存在擴(kuò)增。二、常見問題分析如何判斷他們是否存在擴(kuò)增？37二、常見問題分析如何判斷他們是否存在擴(kuò)增？案例：

先看對數(shù)圖譜

右側(cè)的曲線形狀和擴(kuò)增曲線很相似，但曲線不光滑。二、常見問題分析如何判斷他們是否存在擴(kuò)增？38二、常見問題分析如何判斷他們是否存在擴(kuò)增？案例：

再看下線性圖譜，可以看到曲線有一定的上升。二、常見問題分析如何判斷他們是否存在擴(kuò)增？39二、常見問題分析如何判斷他們是否存在擴(kuò)增？案例：分析：形成這類曲線的原因可能是模板可能是模板的質(zhì)量差（PCR抑制物；模板濃度低），也有可能是引物探針有問題。試劑原因：如果使用的試劑背景信號太強(qiáng)，熒光的增長將會(huì)很小，導(dǎo)致擴(kuò)增曲線的指數(shù)增長期會(huì)變得很短，或者沒有。熒光信號差的試劑也會(huì)有同樣的問題。二、常見問題分析如何判斷他們是否存在擴(kuò)增？40二、常見問題分析總結(jié)對PCR原理的了解是基礎(chǔ)，一切從原理出發(fā)。常見問題歸類：抑制物：稀釋樣本消除抑制重復(fù)性差：基線/閾值設(shè)置、加樣/混勻、泊松分布、參比熒光可疑的擴(kuò)增：綜合各種圖譜分析二、常見問題分析總結(jié)41實(shí)時(shí)熒光定量PCR

數(shù)據(jù)分析及常見問題分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR

數(shù)據(jù)分析及常見問題分析42一、數(shù)據(jù)分析定量PCR擴(kuò)增曲線的各種概念一、數(shù)據(jù)分析定量PCR擴(kuò)增曲線的各種概念43一、數(shù)據(jù)分析什么是基線基線是擴(kuò)增曲線的水平部分。一、數(shù)據(jù)分析什么是基線44一、數(shù)據(jù)分析基線扣除一、數(shù)據(jù)分析基線扣除45一、數(shù)據(jù)分析什么是閾值閾值是一個(gè)熒光強(qiáng)度值，穿過閾值與X軸平行的直線稱為閾值線。一、數(shù)據(jù)分析什么是閾值46一、數(shù)據(jù)分析什么是Ct值Ct值是閾值線與擴(kuò)增曲線的交點(diǎn)對應(yīng)在X軸上的值。一、數(shù)據(jù)分析什么是Ct值47一、數(shù)據(jù)分析基線一、數(shù)據(jù)分析基線48一、數(shù)據(jù)分析基線一、數(shù)據(jù)分析基線49一、數(shù)據(jù)分析基線一、數(shù)據(jù)分析基線50一、數(shù)據(jù)分析基線一、數(shù)據(jù)分析基線51一、數(shù)據(jù)分析閾值線一、數(shù)據(jù)分析閾值線52一、數(shù)據(jù)分析閾值線一、數(shù)據(jù)分析閾值線53實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析及常見問題分析課件54二、常見問題分析1、PCR擴(kuò)增抑制（以Bio-CFX96為例）擴(kuò)增曲線熒光強(qiáng)度大小及Ct值大小可提示存在抑制。H07存在擴(kuò)增抑制；解決方法：將樣本稀釋后進(jìn)行擴(kuò)增。（抑制物的影響可通過稀釋樣本消除）二、常見問題分析1、PCR擴(kuò)增抑制（以Bio-CFX96為例55二、常見問題分析PCR抑制物黑色素多糖類血紅蛋白尿素其他乙醇

蛋白酶K胍鹽苯酚二、常見問題分析PCR抑制物56二、常見問題分析血液中PCR抑制物的作用機(jī)制及對策抑制物作用原理對策肝素可結(jié)合于DNA和RNA上；對反轉(zhuǎn)錄酶和聚合酶有抑制作用。肝素酶或氯化鋰血紅蛋白含有鐵，釋放鐵離子至PCR混合物，干擾DNA合成。1）DNA-瓊漿糖凝膠珠的相互混合；2）加入0.6%（wt/vol）的BSA（牛血清白蛋白）；3）NaOH處理。乳鐵蛋白含有鐵，釋放鐵離子至PCR混合物，干擾DNA合成。同上免疫球蛋白IgG與單鏈DNA相互作用同上亞鐵血紅素與DNA、RNA結(jié)合，后續(xù)的提取過程中不能被去除；抑制聚合酶活性。加BSA，結(jié)合亞鐵血紅素二、常見問題分析血液中PCR抑制物的作用機(jī)制及對策抑制物作用57二、常見問題分析檢查樣本質(zhì)量用分光光度計(jì)測量樣本260/280比值DNA純度：OD260/OD280=1.8RNA純度：OD260/OD280=2.0二、常見問題分析檢查樣本質(zhì)量58二、常見問題分析2、自動(dòng)基線有問題二、常見問題分析2、自動(dòng)基線有問題59二、常見問題分析手動(dòng)設(shè)置基線點(diǎn)擊右鍵，選擇BaselineThreshold二、常見問題分析手動(dòng)設(shè)置基線60二、常見問題分析手動(dòng)設(shè)置基線將BaselineEnd設(shè)置為“擴(kuò)增信號出現(xiàn)的前一個(gè)循環(huán)”即，原始為26，將其設(shè)置為20，點(diǎn)擊OK二、常見問題分析手動(dòng)設(shè)置基線61二、常見問題分析手動(dòng)設(shè)置基線設(shè)置完成后問題曲線恢復(fù)正常二、常見問題分析手動(dòng)設(shè)置基線62二、常見問題分析3、重復(fù)性1個(gè)樣本4個(gè)復(fù)孔重復(fù)性好二、常見問題分析3、重復(fù)性63二、常見問題分析3、重復(fù)性1個(gè)樣本4個(gè)復(fù)孔重復(fù)性差二、常見問題分析3、重復(fù)性64二、常見問題分析造成重復(fù)性差的原因基線、閾值的設(shè)置加樣誤差（操作？移液器？）沒有將試劑和樣本充分混勻低拷貝的樣本→泊松分布沒有使用ROX校準(zhǔn)（ABI7500）二、常見問題分析造成重復(fù)性差的原因65二、常見問題分析基線、閾值的設(shè)置根據(jù)曲線的具體情況進(jìn)行設(shè)置：閾值：大部分曲線熒光強(qiáng)度/20基線：開始→2/3（根據(jù)儀器和試劑）

結(jié)束→擴(kuò)增信號出現(xiàn)的前一個(gè)循環(huán)如果基線、閾值設(shè)置無問題，則是其它原因造成重復(fù)性差。二、常見問題分析基線、閾值的設(shè)置66二、常見問題分析加樣誤差（操作？移液器？）沒有將試劑和樣本充分混勻有時(shí)候在制備PCR反應(yīng)混合液時(shí)（包括Goldstar/PCRMix反應(yīng)液、引物探針、樣本、水），在分裝入反應(yīng)板（管）前沒有充分混勻。結(jié)果加入到每個(gè)孔中的試劑成分就有所不同。解決方法：在分裝反應(yīng)混合液前，要將其充分混勻（振蕩、吹打）離心。同時(shí)上機(jī)之前，要將PCR反應(yīng)板（管）離心，使所有液體都在反應(yīng)管底部。二、常見問題分析加樣誤差（操作？移液器？）67二、常見問題分析低拷貝的樣本→泊松分布泊松分布：是一種統(tǒng)計(jì)與概率學(xué)里常見到的離散機(jī)率分布（discreteprobabilitydistribution）。在30ul中有9個(gè)模板，每個(gè)反應(yīng)管均勻的分配到3個(gè)模板的幾率有多高？如果30ul中有9000個(gè)模板呢，又會(huì)怎么樣？二、常見問題分析低拷貝的樣本→泊松分布68二、常見問題分析ROX校準(zhǔn)：參比熒光（ABI7500）二、常見問題分析ROX校準(zhǔn)：參比熒光（ABI7500）69二、常見問題分析ROX設(shè)置ABI7500儀器軟件自動(dòng)進(jìn)行ROX校準(zhǔn)。ROX校準(zhǔn)為可選步驟，如果使用的PCR試劑沒有添加ROX參比熒光，或者ROX添加濃度不適合，請將ROX校準(zhǔn)關(guān)閉（None）。二、常見問題分析ROX設(shè)置70二、常見問題分析4、“可疑的”擴(kuò)增曲線（以ABI7500為例）由于PCR擴(kuò)增形成的真正的擴(kuò)增曲線通常很容易確認(rèn)。有特征的形狀：首先有背景信號（基線期），然后是三個(gè)增長階段（指數(shù)增長期、線性增長期和平臺(tái)期）二、常見問題分析4、“可疑的”擴(kuò)增曲線（以ABI7500為71二、常見問題分析指數(shù)增長期內(nèi)擴(kuò)增曲線具有高度重復(fù)性二、常見問題分析指數(shù)增長期內(nèi)擴(kuò)增曲線具有高度重復(fù)性72二、常見問題分析是什么原因造成平臺(tái)期很低呢？可能是目標(biāo)樣本的濃度太低。通常如果模板的起始濃度太低，反應(yīng)體系中會(huì)形成大量的引物二聚體。大量引物二聚體的形成使得引物很快消耗完，從而造成擴(kuò)增曲線的平臺(tái)期很低。二、常見問題分析是什么原因造成平臺(tái)期很低呢？73二、常見問題分析引物和模板比例二、常見問題分析引物和模板比例74二、常見問題分析是否可以調(diào)整引物和模板的比例？YES。低引物濃度會(huì)導(dǎo)致高Ct值（靈敏度低）。所以對于低濃度的樣本，反應(yīng)體系中引物的濃度卻不能太低。二、常見問題分析是否可以調(diào)整引物和模板的比例？