甜玉米的核型分析閆紅博（華南師范大學生命科學學院，廣州，510631）摘要：玉米的對生性狀是一個新的變異類型，其葉片和果穗均為對生，是高產育種極其珍貴的種質資源。采用常規(guī)根尖壓片法對甜玉米和糯玉米的染色體標本進行核型分析(結果表明:甜玉米(L-11株系)和糯玉米(L-70株系)的染色體數(shù)均為2n=20，兩者均為二倍體(甜玉米核型公式為2n=2x20=2M+12m+6sm(2Sat)，染色體相對長度系數(shù)組成為2L+4M=2\*Arabic2+12M=1\*Arabic1+2S，按照Stebbins標準核型分類屬于2B核型，不對稱系數(shù)AS.K%=59.66%.關鍵詞：甜玉米核型壓片KaryotypeanalysisofsweetcornYanHongbo(Collegeoflifescience,SouthChinaNormalUniversity,Guangzhou,510631)Abstract:theoppositecharacterofmaizeisanewtypeofmutation,theleafandearareopposite,isextremelyhighyieldbreedingItsvaluablegermplasmresources.Theconventionalroottipsquashingmethodofsweetcornandwaxycornchromosomespecimensofkaryotypeanalysis,resultsshowedthat2n=20chromosomenumberofsweetcorn(L-11lines)withandwaxycorn(L-70lines),botharediploid(sweetcornkaryotypeformulafor2n=2x20=2M+12m+6sm2Sat,chromosomerelativelengtharraybecome2L+4M2+12M1+2S.AccordingtoStebbinskaryotypeclassificationbelongtothe2BkaryotypeasymmetrycoefficientAS.K%=59.66%.Keywords:SweetCornkaryotypetablet目的意義和國內外研究概況1.1研究甜玉米核型的目的意義1.1.1玉米是三大糧食作物之一，且是重要的飼料、蔬菜和工業(yè)原料作物，在國民經濟發(fā)展中占據(jù)重要的地位。隨著農業(yè)結構的調整，迫切需要高產、優(yōu)質的玉米組合。因此，發(fā)掘特殊的基因資源，選育特殊類型的雜交組合，是玉米生產中急待解決的問題。1.1.2玉米染色體核型觀察和分析，對于染色體核型分析以及培養(yǎng)過程中玉米細胞變異等遺傳學現(xiàn)象的研究具有重要意義。染色體核型分析對于細胞遺傳、細胞分類以及遺傳工程的研究都是十分基本而必要。1.2研究甜玉米核型的國內外研究狀況1.2.1國外對甜玉米的遺傳研究及育種工作開展較早,美國在世界上居領先地位。1836年諾埃斯達林育成第一個甜玉米品種/達林早熟。1900~

1907年,美國開始正式設立甜玉米育種項目。1911年Eest和Hayes

描述了甜玉米的su基因。1924年瓊斯育成第一個白粒/Redgreen0甜玉米單交種并進入商品生產,1927年史密斯育成著名單交種/高登彭頓廣泛栽培至今。今天以su1基因為基礎的甜玉米已有幾百個雜交種在世界各地銷售。1956年Peat等研究指出,su突變體能產生WSp,但其胚乳可溶性糖的總量較低。1954、1956年Camerson等和Creech等研究指出,sh和bt突變體(超甜玉米)籽粒乳熟期胚乳中可溶性糖分的含量比普甜玉米高一倍以上,但不能積累WSp,影響了甜玉米的食用品質。20世紀80年代后期培育成以su1se隱性組合為遺傳基礎的加強甜玉米。目前,雙、三隱性突變體已從研究階段進入實用階段,著名的su1se雙隱性組合、復合突變體(aesu1Wx)正在被廣泛研究。1987年D.V.Glover報道了三隱性突變體su1sesu2及其品種Symphony。近年來,美國Rogersbrother公司等國外一些育種機構育成發(fā)放一批加強甜玉米。1.2.21929年，McClintock描述了玉米粗線期染色體的形態(tài)特征。通過玉米減數(shù)分裂的研究獲得的，直到1969年和1973年，Chen]和Filion等才分別描述了玉米體細胞染色體的核型。1974年，Neuffer等進而提出了玉米體細胞染色體的核型模式圖。此后，雖已有一些玉米核型的研究報道，但其內容主要是介紹制片技術或作為一種細胞學鑒別特征用于分析染色體的結構變異及其近緣屬的關系。1.2.3在中國均有研究玉米自交系和雜交系的染色體形態(tài)結構，以期對玉米的演化進程有更深入的了解，在該項領域已有許多的研究報告，積累了大量玉米品種的遺傳分析資料，但由于玉米品種，亞種繁多，所以當前的研究工作基本仍是在對不同玉米品種的核型分析。如呂桂華的“玉米與四倍體多年生玉米雜交后代遺傳的研究”，該項研究主要目的是通過對玉米（自交系48-2）與3種不同玉米野生型近緣種的核型比較研究，從而揭示玉米起源和演化及其種間關系.也有對玉米新品種的核型分析的，如蘇子潘的“86451玉米新物種種質核型分析。另外，由于分子技術的發(fā)展，對玉米的核型分析手段也愈來愈側重于分子水平了。論文的理論依據(jù)、研究方法、研究內容2.1論文理論依據(jù)玉米是一年生禾本科草本植物，是重要的糧食作物和飼料來源。玉米按其籽粒形狀、胚乳性質及稃殼有無，可分為９個亞種或類型。甜玉米（又稱水果玉米）因其籽粒在乳熟期含糖量較高而得名，其原產于美洲，是一類胚乳隱性突變體，由su１，su２，sh１，sh２，sh４，se，bt１，bt２等系列隱性突變基因控制。根據(jù)遺傳基礎的不同，甜玉米可分為普甜（susu）、超甜（sh２sh２／sh２sh２sh２）、脆甜（bt１bt1／bt１bt１bt１和bt２bt２／bt２bt２bt２）和加強甜（su１sesu１se／su１sesu１sesu１se）４種類型，其胚乳各種糖分含量因類型而異。每一生物體內特定的染色體組成染色體組型。染色體組型分析（也稱核型分析）是對染色體數(shù)目、形態(tài)、著絲點位置、長度、臂比和隨體等進行定性或定量的分析，是研究物種演化、分類以及染色體結構、形態(tài)與功能之間的關系所不可缺少的重要手段。關于玉米染色體核型的研究，Ｋｕｗａｄａ證實玉米的染色體數(shù)目為２n＝２０。2.2研究方法2.2.1實驗材料甜玉米種子2.2.1材料培養(yǎng)把干燥的玉米種子至于水中浸泡24h，種子吸水膨脹后轉到鋪有幾層吸水紙的培養(yǎng)皿中，25℃-28℃條件下培養(yǎng)待根長1-1.5cm時。2.2.2壓片法進行染色體紙片（1）預處理處在細胞分裂中期的染色體最易觀察，但細胞分裂中期持續(xù)時間很短，一般只有10-30min，因此固定材料的中期分裂相較少，而且染色體緊密排列在赤道面上，很難將染色體分開，這樣就不能準確的進行染色體技術和形態(tài)觀察。經過預處理可以拽細胞分裂中紡錘體的形成，又不影響前期細胞的正常分裂，使得細胞分裂停止于中期，獲得較多的中期分裂相，染色體更分散，方便觀察材料中的染色體，待根尖長到1-2cm切取根尖0.5cm，投入空試劑瓶中，加入一定量的0.05%-0.2%的秋水仙堿，在處理4h。（2）固定將預處理過的根尖用蒸餾水沖洗兩次，一如卡諾氏固定液中，在4℃-15℃條件下固定24小時，用90%的乙醇沖洗兩次后，轉入70%乙醇中置4℃冰箱中保存使用。（3）解離酸解：將70%乙醇中取出的根尖用蒸餾水沖洗兩次，置于60℃恒溫水浴鍋中預熱的1MHCL中，解離10分鐘，然后用蒸餾水沖洗兩次。（4）染色在培養(yǎng)皿中倒適量改良品紅，將解離后的根尖置于其中，進行染色10分鐘。（5）壓片取一染色的根尖置于載玻片中央，用吸水紙吸取多余的溶液，加1滴新鮮染液蓋上蓋玻片，并在高波偏上蓋上一些吸水紙，左手固定載玻片，右手用筆敲蓋玻片，是材料盡量分散。（6）鏡檢選擇分散的較好的中期染色體在顯微鏡下拍照分析。每種材料觀察３０個以上中期分裂相進行染色體計數(shù)。2.3研究內容：核型分析核型分析按照李懋學等的標準，核型分類按Stebbins的分類標準，按Arano方法計算核型不對稱系數(shù)(As．k%)，按KuoSＲ等的方法確定染色體相對長度系數(shù)(Indexofrelativelength)，采用Levan著絲點命名系統(tǒng)。每種材料觀察30個以上中期分裂相進行染色體計數(shù)，并選取5個分散良好的中期分裂相，用尼康顯微鏡(80i)在100倍油鏡下拍照。采用手工剪分，取其平均值供核型分析，用Excel繪制核型模式圖。研究條件、可能存在的問題3.1研究條件材料、試劑、水浴鍋、顯微鏡由實驗室提供，相機自帶，處理軟件可上網(wǎng)下載，對壓片法操作較熟悉。3.2可能存在的問題3.2.1藥品不齊或實驗室不能提供適宜環(huán)境解決方案：提前與實驗室老師溝通協(xié)商好3.2.2實驗制片效果不好，耗時長解決方案：全組人員齊心協(xié)力，認真制片觀察，總結經驗，相互溝通交流經驗，實驗過程中應合理安排工作，提高效率。3.2.3染色體重疊，難以觀察解決方案：重復制片，爭取找到染色體完全分散的形態(tài)，使結果更清晰準確。③用Excel繪制核型模式圖4.3甜玉米染色體參數(shù)實驗結果1、甜玉米染色體壓片圖甜玉米10*40顯微鏡圖（來自閆紅博）甜玉米核型100倍油鏡圖（來自閆紅博）甜玉米核型100倍油鏡圖（來自易芝琳）甜玉米核型分析圖（來自吳惠劍）甜玉米染色體剪切圖（此圖原型來自易芝琳）染色體測量結果匯總依次各測量染色體長臂和短臂的長度，隨體計入臂長與否須注明。根據(jù)顯微測量或放大照片測量、記錄染色體形態(tài)測量數(shù)據(jù)如下：1、絕對長度（μm）=放大的染色體長度÷放大倍數(shù)2、染色體組總長度=該細胞單倍體全部染色體長度（包括性染色體）之和3、相對長度（%）=每個染色體長度÷染色體組總長度×1004、臂比=長臂長度÷短臂長度5、著絲粒指數(shù)=短臂÷該染色體長度×1006、計數(shù)體細胞染色體數(shù)目：統(tǒng)計細胞數(shù)≥30，85%具有恒定一致的數(shù)目；7、以分裂中期、高質量的體細胞染色體圖像作為形態(tài)描述，以5個以上的細胞染色體，測其平均值。8、核不對稱系數(shù)（Ask）＝長臂總長÷全組染色體總長×100%9、染色體的長短：按Kuo等的方法，以染色體相對長度系數(shù)（I.R.L）組成劃分染色體的長短，即I.R.L≥1.26為長染色體（L）；1.01≤I.R.L≤1.25為中長染色體（M2）；0.76≤I.R.L≤1.00為中短染色體（M1）；I.R.L﹤0.76為短染色體（S）。2n=24=8L+2M2+10M1+4S。10、相對長度系數(shù)（I.R.L）=每條染色體的相對長度÷染色體的平均相對長度序號染色體相對長度全長=短臂+長臂相對長度系數(shù)臂比著絲點指數(shù)類型10.20+0.40=0.600.102.0033.33m20.20+0.30=0.500.081.5040.00m30.20+0.20=0.400.071.0050.00M40.20+0.30=0.500.081.5040.00m50.25+0.25=0.500.081.0050.00M60.40+0.60=1.000.161.5040.00m70.40+0.50=0.900.181.2544.44m80.30+0.40=0.700.111.3343.10m90.20+0.20=0.400.071.0050.00M100.30+0.30=0.600.101.0050.00M討論分析甜玉米與糯玉米是屬于不同類型的個玉米品種(兩者的起源不同，甜玉米主要起源于美洲，而糯玉米是我國西南的特殊變異類型，對環(huán)境的適應性更強(甜玉米引入后經過長時間的馴化種植(基因提純(選擇，對國內的環(huán)境(包括土壤(氣侯等)適應能力逐步加強，也能很好地適應國內的生產種植(但它們的起源演化過程的不同，可能導致它們核型的差異(另外，栽培居群的不同也可能導致核型的差異(由于不同的生長地點在氣候條件(土壤性質等生境方面的差異，同種植物很有可能因適應不同環(huán)境。結果表明，甜玉米核型公式為2n=2x20=2M+12m+6sm(2Sat)，染色體相對長度系數(shù)組成為2L+4M=2\*Arabic2+12M=1\*Arabic1+2S，核型分析所得的染色體數(shù)目相符合(2n=20)，甜玉米最長與最短的染色體比值為2.5，臂比大于2的染色體比例為10%，核型不對稱系數(shù)為57%，核型屬2B型。染色體相對長度變化范圍為7%~16%。對材料預處理(壓片技術等，可能導致核型參數(shù)產生差異，比如染色體長度在預處理過程中受藥劑種類、濃度及處理時間的影響，可能會明顯縮短(玉米染色體較小，給制片與核型分析帶來一定的影響。因此要獲得準確的結果，合適的預處理濃度和時間。我們小組通過多次試驗發(fā)現(xiàn)，酶解濃度過大或者時間過長，會導致材料變太軟，不利于壓片。此外染色時間控制在10~15min最為合適。制作清晰、高質量的染色體玻片標本是關鍵，運用染色體分帶技術作核型分析，更能準確反映核型上的差異(X<帶是染色體本身特征的本質反應，結合X<帶分析可有效地提高了核型分析的精確度。同樣，植物染色體的3<帶顯示的