探討Smad7對(duì)ActA/Smads通路的調(diào)控機(jī)制,病理學(xué)論文激活素Ａ〔ＡｃｔｉｖｉｎＡ，ＡｃｔＡ〕是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子〔ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ－，ＴＧＦ－〕超家族成員之一，其作為ＡｃｔＡ／Ｓｍａｄｓ信號(hào)通路的第一信使，通過觸發(fā)下游細(xì)胞內(nèi)Ｓｍａｄｓ級(jí)聯(lián)反響，完成具有一定生物學(xué)功能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)經(jīng)過。前期研究發(fā)現(xiàn)ＡｃｔＡ／Ｓｍａｄｓ通路具有抗缺血損傷的神經(jīng)保衛(wèi)作用。但其相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)節(jié)機(jī)制尚需進(jìn)一步研究，本研究以該通路中重要的細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)因子Ｓｍａｄ７為靶點(diǎn)，利用ＲＮＡ干擾技術(shù)抑制Ｓｍａｄ７基因表示出，檢測(cè)其對(duì)ＰＣ１２細(xì)胞ＯＧＤ損傷及ＡｃｔＡ／Ｓｍａｄｓ通路活化水平的影響，討論Ｓｍａｄ７對(duì)ＡｃｔＡ／Ｓｍａｄｓ通路的調(diào)控機(jī)制。１材料和方式方法１．１主要材料大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤ＰＣ１２細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫(kù)。兔抗大鼠ＡｃｔＡ、Ｓｍａｄ７、－ａｃｔｉｎ抗體購(gòu)自Ｓａｎｔａ公司，羊抗兔二抗購(gòu)自鼎國(guó)公司，鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子〔ＮＧＦ〕購(gòu)自Ｓｉｇｍａ公司，Ｔｒ－ｉｚｏｌ總ＲＮＡ提取試劑盒購(gòu)自上海生工公司，Ｑｕａｎｔ－ｓｃｒｉｐｔｃＤＮＡ合成試劑盒、ＲｅａｌＭａｓｔｅｒＭｉｘ〔ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ〕試劑盒購(gòu)自天根公司。Ｓｍａｄ７和內(nèi)參ＧＡＰ－ＤＨ基因引物委托上海生工合成。１．２實(shí)驗(yàn)方式方法１．２．１ＰＣ１２細(xì)胞培養(yǎng)及神經(jīng)元轉(zhuǎn)化含１０％馬血清及１５％胎牛血清的高糖ＤＭＥＭ培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)ＰＣ１２細(xì)胞，２－３天換液后，當(dāng)細(xì)胞接近８０％融合時(shí)，胰酶消化傳代。細(xì)胞貼壁后參加終濃度為５０ｎｇ／ｍｌ的ＮＧＦ，連續(xù)刺激７天以誘導(dǎo)細(xì)胞神經(jīng)元樣轉(zhuǎn)化。１．２．２氧糖剝奪模型的建立神經(jīng)元樣ＰＣ１２細(xì)胞經(jīng)含有１０％胎牛血清和１．０ｍｏｌ／ＬＮａ２Ｓ２Ｏ４的無糖ＤＭＥＭ培養(yǎng)液培養(yǎng)１６ｈ，建立ＯＧＤ１６ｈ組。１．２．３大鼠Ｓｍａｄ７基因的ｓｉＲＮＡ合成設(shè)計(jì)大鼠Ｓｍａｄ７基因的ｓｉＲＮＡ，正義鏈５－ａａｃｇａｕｃｕｇｃｇｃｕｃｇｕｃｃｇｇｃｇｕｄｔｄｔ－３；反義鏈３－ｄｔｄｔｕｕｇｃ－ｕａｇａｃｇｃｇａｇｃａｇｇｃｃｇｃａ－５。ＳｉＲＮＡ及陰性對(duì)照基因序列委托吉?jiǎng)P生物有限公司合成。１．２．４ｓｉＲＮＡ轉(zhuǎn)染及分組２４孔板內(nèi)細(xì)胞８０％融合時(shí)行轉(zhuǎn)染，于前一天將培養(yǎng)液更換為不含血清及抗生素的高糖ＤＭＥＭ，分別轉(zhuǎn)染靶向Ｓｍａｄ７基因的ｓｉＲＮＡ，陰性ｓｉＲＮＡ及對(duì)照ＰＢＳ，建立陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組，陰性轉(zhuǎn)染組及空轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染濃度５０ｎＭ，２４ｈ后行ＯＧＤ１６ｈ。１．２．５Ｓｍａｄ７基因ｍＲＮＡ的表示出檢測(cè)收集細(xì)胞，Ｔｒｉｚｏｌ法提取總ＲＮＡ，逆轉(zhuǎn)錄為ｃＤＮＡ。應(yīng)用ＡＢＩ７５００Ｆａｓｔ型實(shí)時(shí)熒光定量ＰＣＲ儀對(duì)Ｓｍａｄ７基因及內(nèi)參ＧＡＰＤＨｍＲＮＡ的表示出進(jìn)行檢測(cè)。引物序列如下：Ｓｍａｄ７上游５＇－ＴＣＣＴＧＣＴＧＴＧ－ＣＡＡＡＧＴＧＴＴＣ－３＇，下游５＇－ＡＧＴＡＡＧＧＡＧ－ＧＡＧＧＧＧＧＡＧＡＣ－３＇，片段大小：１０４ｂｐ；ＧＡＰＤＨ上游５＇－ＧＧＴＴＡＣＣＡＧＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴ－３＇，下游５＇－ＡＴＧＧＧＴＴＴＣＣＣＧＴＴＧＡＴＧＡＣ－３＇，片段大?。海保罚保猓?。結(jié)果應(yīng)用ＲｅｌａｔｉｖｅＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ〔ｄｄＣｔ〕Ｓｔｕｄｙ軟件行相對(duì)定量分析。檢測(cè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。１．２．６ＭＴＴ細(xì)胞存活率檢測(cè)三組細(xì)胞以１１０４個(gè)／孔接種于９６孔板，每組１０個(gè)復(fù)孔，各組隨機(jī)選擇５個(gè)復(fù)孔行ＯＧＤ１６ｈ，每孔加人２０ｌ的ＭＴＴ〔５ｍｇ／ｍｌ〕３７℃孵育４ｈ后棄去培養(yǎng)液，參加２００ｌ的二甲基亞砜溶解藍(lán)紫色結(jié)晶，充分振蕩溶解，應(yīng)用酶標(biāo)儀在４９０ｎｍ激發(fā)波長(zhǎng)測(cè)吸光度〔Ａ〕。ＯＧＤ１６ｈ的Ａ值與ＯＧＤ０ｈ的Ａ值比擬，計(jì)算每組細(xì)胞存活率。檢測(cè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。１．２．７Ｓｍａｄ７和ＡｃｔＡ的蛋白水平檢測(cè)神經(jīng)元樣ＰＣ１２細(xì)胞，經(jīng)ＯＧＤ１６ｈ處理的陽(yáng)性及陰性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞分別消化離心，利用含有１％ＰＭＳＦ的ＲＩ－ＰＡ裂解提取總蛋白，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，而后分別用兔抗大鼠Ｓｍａｄ７〔１∶５００〕和ＡｃｔＡ〔１∶５００〕一抗４℃過夜孵育，洗膜，羊抗兔二抗〔１∶５００〕３７℃孵育２ｈ，ＥＣＬ顯影壓膠片。１．３統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用ＳＰＳＳ１０．０軟件包，計(jì)量資料用ｘ珚ｓ描繪敘述，均數(shù)間比擬采用獨(dú)立樣本ｔ檢驗(yàn)，多個(gè)均數(shù)比擬采用單因素方差分析，Ｐ＜０．０５視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。２結(jié)果２．１Ｓｍａｄ７ｓｉＲＮＡ沉默效果檢測(cè)應(yīng)用ＲｅａｌＴｉｍｅＲＴ－ＰＣＲ檢測(cè)Ｓｍａｄ７ｍＲＮＡ的表示出變化，陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組Ｓｍａｄ７ｍＲＮＡ表示出水平〔０．３２０．１３〕較陰性轉(zhuǎn)染組顯著下調(diào)〔０．６８０．１４〕〔見圖１〕。２．２Ｓｍａｄ７及ＡｃｔＡ蛋白水平的表示出檢測(cè)ｓｉＲＮＡ轉(zhuǎn)染２４ｈ，Ｓｍａｄ７及ＡｃｔＡ蛋白表示出檢測(cè)顯示：ＯＧＤ１６ｈ，ｓｉＲＮＡ陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組Ｓｍａｄ７蛋白表示出〔０．３５０．０８〕與陰性組〔１．１７０．１２〕比擬，顯著下調(diào)。ＯＧＤ后ＡｃｔＡ蛋白表示出上調(diào)，以陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組為著〔對(duì)照組：０．９４０．１０，陰性轉(zhuǎn)染組＋ＯＧＤ１６ｈ：１．２９０．１３，陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組＋ＯＧＤ１６ｈ：２．４６０．１６〕〔見圖２〕。２．３細(xì)胞存活率ＭＴＴ檢測(cè)ＯＧＤ１６ｈ后ＭＴＴ細(xì)胞存活率檢測(cè)結(jié)果顯示：陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組〔９０．６８％１．３１％〕與陰性轉(zhuǎn)染組〔８０．５６％２．１３％〕及空轉(zhuǎn)染組相比〔７８．３％１．７２％〕，存活細(xì)胞比例顯著升高〔見圖３〕。３討論國(guó)內(nèi)外研究及本課題組的前期工作均證實(shí)ＡｃｔＡ的抗缺血損傷神經(jīng)保衛(wèi)作用。當(dāng)前研究表示清楚，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制主要為Ｓｍａｄｓ家族蛋白將胞外信號(hào)傳遞至胞內(nèi)繼而調(diào)控核內(nèi)基因的表示出。在該通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)經(jīng)過中，Ｓｍａｄｓ蛋白作為重要結(jié)點(diǎn)，一方面，膜受體激活的Ｓｍａｄｓ２／３和通用Ｓｍａｄｓ〔ｃｏｍｍｏｎｍｅｄｉａｔｏｒＳｍａｄｓ，Ｃｏ－Ｓｍａｄｓ〕作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的細(xì)胞內(nèi)傳遞因子發(fā)揮著級(jí)聯(lián)反響功能，另一方面通過抑制性Ｓｍａｄｓ〔Ｓｍａｄ６／７〕，抑制該通路的激活經(jīng)過。在非神經(jīng)細(xì)胞模型的研究中，Ｓｍａｄ７主要通過與抑制性Ｓｍａｄｓ競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合ＴＧＦ－Ｉ型受體以及促進(jìn)ＴＧＦ－Ｉ型受體去磷酸化而發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用。但Ｓｍａｄ７基因?qū)ι窠?jīng)細(xì)胞缺血性損傷及其相關(guān)的ＡｃｔＡ／Ｓｍａｄｓ通路活化的影響當(dāng)前尚不明確。為此，本研究利用ＲＮＡ干擾技術(shù)，體外設(shè)計(jì)合成靶向大鼠Ｓｍａｄ７基因的ｓｉＲＮＡ，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染神經(jīng)元樣ＰＣ１２細(xì)胞，繼而對(duì)Ｓｍａｄ７在轉(zhuǎn)錄及蛋白水平的表示出、細(xì)胞對(duì)ＯＧＤ損傷的敏感性及ＡｃｔＡ／Ｓｍａｄｓ通路的活化水平進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ＰＣ１２細(xì)胞經(jīng)外源性ｓｉＲＮＡ瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后，經(jīng)實(shí)時(shí)定量ＰＣＲ及蛋白印記檢測(cè)均證實(shí)細(xì)胞內(nèi)Ｓｍａｄ７基因在ｍＲＮＡ及蛋白水平的表示出均明顯下調(diào)，細(xì)胞ＯＧＤ損傷后的存活率升高，與陰性轉(zhuǎn)染組及空轉(zhuǎn)染組相比有顯著差異。本研究進(jìn)一步對(duì)ＡｃｔＡ蛋白的表示出情況進(jìn)行了檢測(cè)，以明確ＡｃｔＡ／Ｓｍａｄｓ通路的活化水平，結(jié)果顯示ＯＧＤ損傷刺激激活了調(diào)細(xì)胞內(nèi)初級(jí)ＡｃｔＡ蛋白合成，且此經(jīng)過受Ｓｍａｄ７基因的負(fù)向調(diào)節(jié)?？紤]到細(xì)胞外ＡｃｔＡ是該信號(hào)通路的始動(dòng)因素，當(dāng)前研究結(jié)果提示了ＡｃｔＡ／Ｓｍａｄｓ通路活化可能存在著一定程度的環(huán)路〔反應(yīng)〕調(diào)節(jié)，在ＯＧＤ損傷經(jīng)過中通過正反應(yīng)促進(jìn)ＡｃｔＡ基因表示出，維持通路活性，但該機(jī)制又遭到Ｓｍａｄ７基因的負(fù)性調(diào)控，其途徑一方面可能是通過經(jīng)典機(jī)制下調(diào)通路活化程度，另一方面可能也與Ｓｍａｄ７能夠結(jié)合核內(nèi)ＤＮＡ，干擾可發(fā)揮生物學(xué)功能性的Ｓｍａｄｓ－ＤＮＡ復(fù)合物構(gòu)成有關(guān)。但Ｓｍａｄ７對(duì)ＡｃｔＡ／Ｓｍａｄｓ通路調(diào)控確實(shí)切機(jī)制仍有待于在時(shí)間水平上對(duì)神經(jīng)細(xì)胞缺血損傷這一動(dòng)態(tài)經(jīng)過中不同時(shí)間位點(diǎn)以及空間水平上在細(xì)胞核內(nèi)的進(jìn)一步討論和研究。以下為參考文獻(xiàn)：［１］ＭａｓｓａｇｕＪ，ＳｅｏａｎｅＪ，ＷｏｔｔｏｎＤ．Ｓｍａｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓ［Ｊ］．ＧｅｎｅｓＤｅｖ，２００５，１９〔２３〕：２７８３．［２］ＳｃｈｕｂｅｒｔＤ，ＫｉｍｕｒａＨ，ＬａＣｏｒｂｉｅｒｅＭ，ｅｔａｌ．Ａｃｔｉｖｉｎｉｓａｎｅｒｖｅｃｅｌｌｓｕｒｖｉｖａｌｍｏｌｅｃｕｌｅ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，１９９０，３４４〔６２６９〕：８６８．［３］ＨｅＪｉｎ－Ｔｉｎｇ，ＭａｎｇＪｉｎｇ，ＭｅｉＣｈｕｎ－Ｌｉ，ｅｔａｌ．ＮｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅＥｆｆｅｃｔｓｏｆＥｘｏｇｅｎｏｕｓＡｃｔｉｖｉｎＡｏｎＯｘｙｇｅｎ－ＧｌｕｃｏｓｅＤｅｐｒｉｖａｔｉｏｎｉｎＰＣ１２Ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１１，１７〔１〕：３１５．［４］ＭｕｋｅｒｊｉＳＳ，ＲａｉｎｅｙＲＮ，ＲｈｏｄｅｓＪＬ，ｅｔａｌ．ＤｅｌａｙｅｄａｃｔｉｖｉＡａｄ－ｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎａｔｔｅｎｕａｔｅｓｔｉｓｓｕｅｄｅａｔｈａｆｔｅｒｔｒａｎｓｉｅｎｔｆｏｃａｌｃｅｒｅｂｒａｌｉｓｃｈｅｍｉａａｎｄｉｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｄｅｃｒｅａｓｅｄｓｔｒｅｓｓ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｋｉｎａｓｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＪＮｅｕｒｏｃｈｅｍ，２００９，１１１〔５〕：１１３８．［５］ＳｃｈｍｉｅｒｅｒＢ，ＨｉｌｌＣＳ．ＴＧＦｂｅｔａ－ＳＭＡＤｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ：ｍｏ－ｌｅｃｕｌａｒｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ［Ｊ］．ＮａｔＲｅｖＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ，２００７，８〔１２〕：９７０．［６］ＭｕｋｅｒｊｉＳＳ，ＫａｔｓｍａｎＥＡ，ＷｉｌｂｅｒＣ，ｅｔａｌ．Ａｃｔｉｖｉｎｉｓａｎｅｕｒｏｎａｌｓｕｒｖｉｖａｌｆａｃｔｏｒｔｈａｔｉｓｒａｐｉｄｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄａｆｔｅｒｔｒａｎｓｉｅｎｔｃｅｒｅｂｒａｌｉｓ－ｃｈｅｍｉａａｎｄｈｙｐｏｘｉａｉｎｍｉｃｅ［Ｊ］．ＪＣｅｒｅｂＢｌｏｏｄＦｌｏｗＭｅｔａｂ，２００７，２７〔６〕：１１６１［７］ＫａｔｏＳ，ＵｅｄａＳ，ＴａｍａｋｉＫ，ｅｔａｌ．ＣｔｏｐｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳｍａｄ７ｉｎｈ－ｈｉｂｉｔｓｔｒａｎｓ－ｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｓｐｏｎｓｅｓｉｎｖａｓｃｕｌａｒｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＬｉｆｅＳｃｉ，２００１，６９〔２２〕：２６４１．［８］ＥｂｉｓａｗａＴ，ＦｕｋｕｃｈｉＭ，ＭｕｒａｋａｍｉＧ，ｅｔａｌ．Ｓｍｕｒｆ１ｉｎｔｅｒａｃｔｓｗｉｔｈｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａｔｙｐｅＩｒｅｃｅｐｔｏｒ